De Vermicelli en Capellini Handling Tests: Eenvoudige kwantitatieve metingen van behendige voorpootje functie in ratten en muizen

Summary

De Vermicelli en Capellini Handling Tests van de voorpoot behendigheid profiteren van de natuurlijke neiging van knaagdieren om voedsel items met behulp van bekwame voorpootje en cijfers bewegingen te manipuleren. Dieren zijn gefilmd bij het behandelen van korte strengen van ongekookte droge pasta. Slow motion afspelen van video zorgt voor de kwantificering van voorpootje aanpassingen.

Abstract

Vorige karakteriseringen van knaagdieren eetgedrag hebben onthuld dat ze gebruiken voorpootje bewegingen gecoördineerd om voedsel stukken te manipuleren. We hebben uitgebreid over dit werk om een ​​eenvoudige kwantitatieve maat van de voorpoot handigheid die gevoelig is voor gelateraliseerde bijzondere waardeverminderingen en leeftijdsafhankelijke veranderingen te ontwikkelen. Knaagdieren leren bekwame voorpootje en cijfers bewegingen om dunne pasta stukken, die gretig ze verbruiken beheren. We hebben eerder beschreven methoden voor het kwantificeren van vermicelli behandeling in ratten en bleek dat de maatregelen die zeer gevoelig zijn voor voorpoot bijzondere waardeverminderingen als gevolg van eenzijdige ischemische laesies, midden cerebrale slagader occlusies en eenzijdige striatum dopamine depletie [Allred, RP, Adkins, DL, Woodlee, MT, echtgenoten, LC, Maldonado MA, Kane, JR, Schallert, T. & Jones, TA de vermicelli Handling Test: een eenvoudige kwantitatieve maat van de behendige voorpootje functie in ratten.

Protocol

1. Voorbereiding voor het begin van het testen

1. Ongekookte pasta stukken worden gesneden in de lengte met behulp van een scheermesje. Voor ratten, is het merk Skinner vermicelli pasta (1,5 mm diameter) snijden tot 7 cm lengte. Voor muizen, is DeCecco merk capellini pasta (1,0 mm diameter) snijden tot 2,6 cm lengte (Fig. 1C). Omdat de pasta merken variëren in textuur en diameter, die handling manier kunnen beïnvloeden, wordt aanbevolen dat een enkele bron van pasta worden gebruikt voor herhaalde testen.
2. Te overwinnen neophobic reacties, en vaardigheid in het omgaan met vast te stellen, zijn dieren blootgesteld aan de pasta stukken in hun eigen kooi een paar keer in de week voorafgaand aan de test. (Meestal, 5-10 dagen na de blootstelling, ongeveer 4 stuks per keer, is voldoende.)
3. Als de test zal worden toegediend in een kamer anders dan de kooi, of als de kooi wordt verplaatst voor het testen, gewenning aan eten in de testomgeving wordt voorzien. (Het duurt meestal drie tot vijf sessies tot dieren zijn gemakkelijk te eten van de pasta in deze omgeving.)
4. Zelfs nadat de dieren gretig accepteren pasta, kunnen ze ineens terughoudend wanneer er een grote camera is naast het testen gebied verplaatst. Het is nuttig om de camera in de voorkant van de testomgeving voor een of meer van de gewenning sessies.
5. Omdat de meeste dieren doen alsof het pasta is zeer smakelijk, is het niet noodzakelijk om voedsel te beperken ze voor de test. Echter, verwijdering van levensmiddelen een paar uur voor of 's nachts kunnen vergemakkelijken het eten in de voorkant van de experimentator en de camera en zorg ervoor dat ze niet verzadigd bij de testtijd.
6. Het doorbreken van de pasta stuk tijdens het eten ongeldig een proces. Wij hebben gevonden deze gewoonte is grotendeels te voorkomen als de dieren nooit gegeven stukken langer dan die welke worden gebruikt in de tests.
7. Voor de testsessies, zijn pasta stukken gemarkeerd met een ultrafijne tip marker op specifieke intervallen met behulp van een sjabloon kaarten (1,75 cm in stappen van vermicelli en 0,86 cm in stappen op capellini strengen). Dit vergemakkelijkt visualisatie van de beweging van de pasta streng tijdens het eten.

2. Testopstelling

1. De dieren moeten worden getest in zowel de kooi of een ander apparaat met unmarred, heldere muren, en dient te worden geïsoleerd van hun lotgenoten tijdens de testsessie.
2. Hoewel ratten kunnen worden getest in real-time door een geoefend experimentator (Allred et al.., 2008), is kwantificering vergemakkelijkt door video-opname, zodat gegevens kunnen worden verzameld tijdens slow-motion afspelen van video. We hebben niet gevonden het mogelijk om op betrouwbare wijze de muis voorpootje bewegingen te kwantificeren zonder slow motion afspelen van de video door de kleine omvang van hun poten en snelle bewegingen.
3. Een videocamera met een hoge framerate en adequate zoom wordt gebruikt. We maken gebruik van een Canon XL1S camera met een 16x zoomlens ingesteld op een sluitertijd van ten minste 420 s-1 in normale lichtomstandigheden in de kamer. Het gebruik van een statief op wielen met een panning en zwenkbare kop vergemakkelijkt camera positionering.
4. Ratten meestal rechtop zitten op hun hurken om pasta te eten en de poten zijn het makkelijkst te bekijken met de camera gepositioneerd op ongeveer kamer vloerniveau met een lichte opwaartse hoek (Fig. 1A). Als het testen in een kooi met krullen, kan het verwijderen van sommige krullen nuttig zijn om de weergave te optimaliseren.
5. Muizen hebben de neiging om voorover te buigen tijdens het pasta eten, houdt het stuk op meer van een hoek dan ratten te doen. Zo is een test kamer met een open vloer geplaatst op de top van een spiegel. De camera wordt geplaatst op een iets hoger niveau dan de vloer, en naar beneden hoek te richten op de reflectie van de poten in de spiegel (figuur 1B). Het gebruik van een eerste oppervlak spiegel verbetert de duidelijkheid van de poten voor het afspelen van video.
6. Elke hap van de pasta stuk is hoorbaar en dus audio-opname is nuttig voor het controleren eten.

3. Toedienen van pasta hanteren trials

1. Test sessies bestaan ​​uit opeenvolgende proeven, met een stuk pasta gegeten per proef. We meestal nemen gegevens 4-5 onderzoeken per rat en 3-4 onderzoeken per muis.
2. Voorafgaand aan de video-opnamen, is een stukje pasta geplaatst in de kamer het eten van te initiëren en om het dier te verplaatsen naar een geschikte camera te bekijken.
3. Het is noodzakelijk voor het dier om de camera het gezicht en om de scherpstelling en zoom voldoende (~ 10-12X) voor discrete aanpassingen te bekijken met zowel voorpoten en alle cijfers. De knokkels van beide poten moet worden bekeken. In ieder geval met deze camera, we vinden het nuttig om autofocus functies te gebruiken alleen voorafgaand aan de proef begin, te smal in op de regio van belang. We vervolgens overschakelen naar handmatige scherpstelling.
4. Zodra het dier en de camera op hun plaats zitten, is de eerste proef gestart. Een stuk is gevallen of bungelden direct voor het dier en de opname is gestart voordat het eten begin.
5. Daarna worden de proeven in direct na elkaar. Het is raadzaam om Beperk vertragingen tussen de proeven, zodat dieren niet af te stappenvan de optimale kijkpositie.
6. Studies, waarbij de poten worden bekeken aan de zijkant of waarin focus is verloren worden niet gescoord.
7. De test sessies kunnen worden herhaald dag, bijvoorbeeld om pre-en post-behandeling temporele patronen (bijv. herstel na CNS verwonding.; Allred et al., 2008) document.
8. Een uitdaging kan krijgen dieren om te eten in de gewenste posities ten opzichte van de camera. Het kan nodig zijn om de camera-schuwe dieren wennen aan de aanwezigheid van de camera voor een paar minuten voor de test. Dieren kunnen vaak worden overgehaald in de positie door laten vallen of bungelen pasta in de ideale regio. Het kan een paar stukken om dit gewenste positie te bereiken, hoewel het aantal gegeven stukken moet worden beperkt tot verzadiging te voorkomen.
9. Voor de sequentiële het testen van een aantal ratten, hebben we vonden het handig om een ​​paar van hun kooien configureren op een moment in een cirkel, met de camera op een verrijdbaar statief in het midden. Een stuk is gedaald in een ideale regio per kooi en de camera vervolgens verplaatst naar de rat die begint te eten in een juiste positie eerst. Hierdoor kan meer tijd voor de langzamere (om te eten in positie) ratten te worden gewend aan de camera en experimentator aanwezigheid en ze kunnen ook worden gestimuleerd om te eten door de bijtende klanken van de snellere ratten.

4. Kwantitatieve analyse van de video voorpootje aanpassingen en het eten van de tijd

1. De analyse van voorpootje aanpassingen tijdens het eten is een eenvoudige kwantitatieve maatregel die gevoelig zijn voor bijzondere waardeverminderingen gelateraliseerde is na CNS verwondingen in ratten (Allred et al., 2008;. Whishaw & Coles, 1996; Whishaw et al., 1997.) En aan veroudering gerelateerde veranderingen bij muizen (Tennant et al.., 2009).
2. De gekwantificeerde gedeelte van het onderzoek begint wanneer de pasta stuk wordt eerst geplaatst in de mond en eindigt wanneer de laatste van de pasta is vrijgelaten uit de poten en verdwijnt in de mond.
3. Video afspelen is vertraagd (~ 50% van de real-time), of beeld-voor-beeld vooruit wordt gebruikt, indien nodig, aanpassingen te identificeren.
4. Een aanpassing wordt geteld telkens wanneer de poot releases en re-contacten van de pasta stuk, wanneer er sprake is hervorming van de poot te houden op het stuk, of als er is een extensie-flexie of abductie-adductie van de cijfers (Fig. 2). Elke aanpassing wordt afzonderlijk geregistreerd voor de linker en rechter poot.
5. Aanpassingen worden niet meegeteld bij de poot dia's over de pasta stuk met geen beweging van de cijfers of herpositionering van de poot vast te houden. Bewegingen van de poot als deze niet in contact komt met de pasta stuk (dat wil zeggen, bewegingen naast het stuk) zijn ook niet meegerekend.
6. De tijd om te eten is ook geregistreerd voor elk onderzoek, te beginnen met het eten van het begin en eindigt wanneer de pasta verdwijnt in de mond. We nemen de tijd met behulp van het afspelen van video display heeft, maar het kan ook worden opgenomen met een stopwatch tijdens de normale snelheid afspelen.
7. Als het dier stopt met eten, maar handhaaft een greep op het stuk, is de tijd gepauzeerd afgetrokken van de totale tijd. Een pauze in het eten is duidelijk door een verplaatsing van het werkstuk uit de mond of een staking in de hoorbare bijten.
8. De proef is weggelaten uit de analyse als gedurende een deel van het eten, het uitzicht op de poten is verduisterd, of wanneer het dier breekt het stuk, omdat de kortere stukken te veranderen handling patronen.
9. Sommige ratten en muizen voortdurend te maken meer aanpassingen met een poot dan de andere. Voor unilaterale CNS verwonding modellen, zijn gelateraliseerde bijzondere waardeverminderingen gevoeliger gedetecteerd als de verwondingen van invloed op de poot die meer aanpassingen in pre-schade testen (Allred et al., 2008). Gemaakt.
10. Muizen soms vallen de pasta stuk in het midden van het eten, en na een korte pauze, pak het op en blijven eten. Dit komt het meest voor in de laatste proef van de dag, mogelijk als gevolg van gedeeltelijke verzadiging en het verlies van focus op eten. Omdat dit vaak voor, zelfs in intacte muizen, hebben we niet nalaten deze proeven. Echter, is de tijd dat het stuk is gedaald afgetrokken van de totale tijd te eten.
11. Bij normale ratten, te laten vallen stukken is atypisch en hervatting in het eten is vaak erg vertraagd of afwezig zijn. Dergelijke studies zijn weggelaten uit de analyse van de aanpassingen en het eten van de tijd.
12. Aanpassingen voorafgaand aan het eten begin worden niet geteld. Pre-eten handling gedrag worden beïnvloed door CNS verwondingen (bijv. Whishaw et al., 1992;.. Whishaw et al., 1986), maar we hebben nog niet uitgebreid de kwantitatieve methoden voor het voorpootje aanpassingen aan deze periode.
13. Deze gegevens kunnen worden samengevat als: (a) het gemiddelde aantal aanpassingen per poot per stuk, (b) de gemiddelde tijd per stuk te eten en (c) de mate van de aanpassingen (aanpassingen / eten tijd).

5. Video analyse van atypische handling patronen

1. Atypische behandeling patronen kunnen onderscheid maken tussen verschillende soorten letsel CNS bij ratten (Allred et al.., 2008) en recording deze gedragingen kan nuttig zijn als een aanvullende analyse.
2. Omgaan met patronen worden beschouwd als atypisch als ze slechts zelden waargenomen bij intacte dieren. Intacte dieren meestal starten met het eten van een poot, de "greep poot", geplaatst lager op de pasta, en de "gids poot" is dan dicht bij de mond (Fig. 3A, C). Dezelfde poot is meestal de greep poot in alle studies. Ratten vaak positie poten ver uit elkaar over de lengte van de pasta op het eerste, en beweeg ze samen als het stuk korter. Muizen typisch positie beide poten dicht bij de mond, met de greep en gids ledematen dicht bij elkaar gehouden, zelfs aan het begin van het eten. In beide soorten, de poten bewegen in meer symmetrische posities, side-by-side of met cijfers daartussen, wanneer het stuk is zeer kort (Fig. 3B, D). Beide poten in gebruik zijn continu voor het begeleiden, het bezit of het bevorderen van de pasta tijdens het eten.
3. Atypische patronen in poot positie in ratten en muizen omvatten: (a) het plaatsen van de poten bij elkaar, in een symmetrisch te houden, wanneer de pasta stuk is lang (meer dan de helft van de oorspronkelijke lengte), (b.) niet aan de poten te verplaatsen naar een symmetrische positie voor het stuk volledig is verbruikt en (c.) schakelstanden van de gids en begrijpen ledematen in het midden van het eten.
4. Twee extra atypisch gedrag bij ratten en muizen zijn: (a.) niet aan de pasta stuk contact met een poot voor een langere tijd tijdens het eten ("gebrek aan contact") en (b) met de mond om de pasta te trekken door middel van de poten om ze te verplaatsen ('de mond trekken ").
5. Twee gedragingen worden beschouwd als atypisch voor ratten, maar zijn typisch voor muizen: (a.) gebogen houding en (b.) het schrappen van de pasta stuk na het eten begint. Echter, de frequentie van de druppels in muizen te verhogen na CNS schade. Zo hebben we historische daling frequentie in beide soorten.
6. Andere atypische gedrag zijn gezien in een rat eenzijdige striatale dopamine-depletie model: (a.) een "ijzeren greep", waar de greep been wordt gehouden in een onbewogen, starre positie tijdens het eten, (b.) herhaalde beweging van de gids poot rond de starre greep poot, en (c.) en extreme kantelen van het hoofd als de pasta wordt schuin in de mond (Allred et al., 2008;. zie ook Whishaw et al. 1997.).
7. We hebben gezien dat oude muizen vaak aanpassingen die niet effectief zijn voor het verplaatsen van de pasta in de mond te maken. Zo, zijn aanpassingen die niet leiden tot een zichtbare beweging van de pasta stuk in de mond apart opgenomen.
8. Het schakelen van de gids en begrijpen ledematen, mislukkingen om contact, druppels, en de mond te trekken worden opgenomen per gebeurtenis, terwijl alle andere atypische gedrag worden een keer vastgelegd per proef.

6. Representatieve resultaten

De resultaten van de video-analyse moet ook het aantal aanpassingen van elke poot per proef en de tijd om elk stuk pasta eten. De resultaten van ratten met sensomotorische corticale laesies of cerebrale ischemie aan te geven dat de dieren minder aanpassingen te maken met de verminderde (contra-to-laesie) ledematen, een effect dat duurt minstens een maand na de blessures. Eenzijdige dopamine depletie resulteert in zowel een afname in aanpassingen met de contralaterale ledematen en een toename van de aanpassingen met de ipsilaterale ledematen (Allred et al.., 2008). Resultaten van muizen tonen aan dat oudere dieren langer duren om de pasta stukken te eten, en maken meer aanpassingen die niet in vooruitgang van de pasta resultaat in de mond, in vergelijking met jonge volwassen muizen (Tennant et al.., 2009). De analyse van deze tests kunnen ook waarnemingen van atypische handling gedrag. Striatale schade en midden cerebrale slagader occlusie bovendien resulteerde in een verhoogde frequentie van abnormale eetgedrag (Allred et al.., 2008).

Figuur 1. Pasta behandeling houding van (A) en ratten (B) muizen. Merk op dat de ratten weer zitten op hun hurken, terwijl de muizen vermoeden over de pasta, noopt de plaatsing van een spiegel onder de muis om de poot bewegingen te bekijken. (C) Voorbeelden van deegwaren stukken voorbereid voor de beproevingen.

Figuur 2. Een voorbeeld voorpootje aanpassing van (AC), een rat en (DF) een muis. Het eerste paneel toont het dier vóór de aanpassing, het midden paneel toont de voorpoot te passen, met een asterisk is aangegeven voor het aanpassen van poot (s), en de laatste paneel toont de vervanging op de pasta stuk.

Figuur 3. Guide en greep ledematen posities van ratten en muizen als de pasta is (A, C) lang en (B, D) kort.

Discussion

In deze video laten we zien hoe de vermicelli en de Capellini Handling tests zijn uitgevoerd bij ratten en muizen, respectievelijk. Deze tests zijn een eenvoudige, kwantitatieve manier om poot en cijfers functioneren in normale dieren bestuderen, na schade aan motorische systemen van de hersenen, of tijdens het ouder worden. Slow-motion video analyse van de poot en het cijfer bewegingen gebruikt om kleine stukjes van ongekookte pasta hanteren de onderzoeker aan de aanpassingen die met elke poot, evenals abnormaal gedrag dat kan worden gezien in acht na experimenteel geïnduceerde CNS schade te kwantificeren mogelijk te maken. Testsessies kan herhaaldelijk gedaan worden op verschillende dagen en de meeste dieren alle proeven van een sessie te voltooien binnen een paar minuten. Zo is de test is geschikt voor inbouw in een grotere testbatterij of experimentele design. De tests kan ook worden gebruikt in studies van motorische vaardigheden leren (Xu et al.., 2009), maar hier presenteren we een protocol voor het testen van veranderingen in een gevestigde vaardigheid in de tijd.

Op dit moment, ervaren het bereiken van tests zijn de meest gebruikte tests van de behendige voorpoot functie in ratten (bijv. Whishaw et al., 1986;. Ballermann et al., 2001;. Montoya et al., 1991.) En muizen (Farr & Whishaw, 2002; Tennant & Jones, 2009; Baird et al., 2001).. Het bereiken van testen vergunning geïsoleerde testen van elke ledemaat, terwijl pasta handling is een bimanuele taak. Niettemin de tests zijn vergelijkbaar in hun gevoeligheid voor stoornissen in geschoold voorpootje functie en het verwerven van vaardigheden voor beide testen gaat plasticiteit in de voorpoot representatie van de motorische cortex (Xu et al.., 2009). In onze ervaring, het bereiken tests zijn ingewikkelder en moeizaam uit te voeren, en voor sommige experimentele vragen, de huidige onderzoeken kunnen een efficiënter alternatief te bieden. Echter, in tegenstelling tot de tests hier beschreven, hebben ervaren het bereiken van testen is in gebruik voor decennia (Peterson, 1934) en ze nu ook een veelzijdige set van zeer gevoelige maatregelen en test parameters (Ballermann et al., 2001;. Farr & Whishaw, 2002; Montoya et al., 1991;. Whishaw et al., 1992).. In tegenstelling, de vermicelli en Capellini Handling Tests uit te breiden van relatief recente karakteriseringen van de behendige behandeling van voedsel het gedrag van ratten (Whishaw en Coles, 1996). In zowel het beheer en analyse, kunnen deze tests ongetwijfeld verder worden verfijnd en uitgebreid, bijvoorbeeld om meer precies te kwantificeren mooie cijfers en bimanuele bewegingspatronen en de gecoördineerde bewegingen van de tong, mond en kaak te kwantificeren.