Den spån och Capellini Tester Hantering: Enkel kvantitativa mått på händiga framtassarna funktionen hos råttor och möss

Summary

Den spån och Capellini Tester Hantering av framtassarna fingerfärdighet dra nytta av den naturliga böjelsen av gnagare att manipulera livsmedel med hjälp av skickliga framtassarna och siffran rörelser. Djur är videofilmade vid hantering av korta delar av okokta torr pasta. Slow motion-video-uppspelning låter för kvantifiering av framtassarna justeringar.

Abstract

Föregående karakteriseringar av gnagare ätbeteende har avslöjat att de använder samordnad framtassarna rörelser för att manipulera mat bitar. Vi har utökat på detta arbete med att utveckla ett enkelt kvantitativt mått på framtassarna fingerfärdighet som är känslig för lateralized nedskrivningar och åldersberoende förändringar. Gnagare lär skicklig framtassarna och siffran rörelser för att hantera tunn pasta bitar, som de ivrigt konsumerar. Vi har tidigare beskrivna metoder för att kvantifiera spån hantering hos råtta och visade att de åtgärder som är mycket känsliga för forelimb nedskrivningar till följd av ensidiga ischemiska lesioner, mitten cerebral ocklusioner artär och ensidiga striatala dopamin utarmning [Allred, RP, Adkins, DL, Woodlee, MT, män, LC, Maldonado MA, Kane, JR, Schallert, T. & Jones, TA Den spån hantering av test: ett enkelt kvantitativt mått på händiga framtassarna funktionen hos råttor.

Protocol

1. Förberedelser för uppkomsten av testning

1. Okokta pastaprodukter bitar skärs till önskad längd med hjälp av ett rakblad. För råttor är Skinner varumärke spån pasta (1,5 mm) kapas till 7 cm längd. För möss är DeCecco varumärke Capellini pasta (1,0 mm) kapas till 2,6 cm långa (fig. 1C). Eftersom pasta varumärken varierar i konsistens och diameter, som skulle kunna påverka hanteringen sätt, rekommenderas det att en enda källa av pasta användas för upprepad testning.
2. För att övervinna neophobic svar och att etablera skicklighet i hanteringen, är djur som utsatts för pasta bitarna i sina olika buren gånger under veckorna före testet. (Normalt är 5-10 dagar efter exponeringen, ca 4 st varje gång, räcker.)
3. Om testet kommer att administreras i en kammare än buren, eller om buren flyttas för testning, tillvänjning att äta i testningen miljön lämnas. (Det tar vanligtvis 3-5 sessioner tills djuren är lätt att äta pasta i denna miljö.)
4. Även efter djur ivrigt acceptera pasta kan de plötsligt förtegen när en stor kamera flyttas intill testning området. Det är bra att placera kameran framför testmiljö för en eller flera av tillvänjning sessioner.
5. Eftersom de flesta djur agerar som om pastan är begärliga, är det inte viktigt att maten begränsa dem före testning. Avlägsnandet av mat ett par timmar innan eller över natten kan underlätta äta framför försöksledaren och kamera och se till att de inte är mätt på testtiden.
6. Att bryta pastan bit under äta ogiltigförklarar en rättegång. Vi har funnit denna vana till stor del undvikas om djuren inte får bitar längre än de som används i testerna.
7. För test sessioner, är pasta stycken markerade med en ultrafina spetsen markör vid specifika intervaller med hjälp av ett vykort mall (1,75 cm steg på spån och 0,86 steg cm på Capellini trådar). Detta underlättar visualisering av rörelse pasta del under äta.

2. Test upprätta

1. Djur bör testas antingen i buren eller annan anordning med unmarred, tydliga väggar och bör isoleras från sina cagemates under testet sessionen.
2. Även råttor kan testas i realtid genom ett praktiseras försöksledaren (Allred et al., 2008), är kvantifiering underlättas av videoinspelning, så att data kan samlas in under slow motion video. Vi har inte funnit det möjligt att tillförlitligt kvantifiera musrörelser framtassarna utan slow motion-video uppspelning på grund av den lilla storleken på sina tassar och snabba rörelser.
3. En videokamera med hög bildhastighet och adekvat zoomen används. Vi använder en Canon XL1S kamera med 16x zoomobjektiv inställt på en slutartid på minst 420 s-1 under normal inomhusbelysning. Användningen av ett hjul stativ med en panorering och luta huvudet underlättar kamerans positionering.
4. Råttor sitta vanligen upprätt på bakbenen för att äta pasta och tassar är lättast ses med kameran placerad på ungefär kammare golvet med en lätt uppåtriktad vinkel (bild 1A). Om tester i en bur med spån, kanske bort några spån vara användbar för att optimera vyn.
5. Möss tenderar att böja sig framåt under pasta äta, hålla bit på mer av en vinkel än råttor gör. Således är ett test kammare med ett öppet golv placeras på toppen av en spegel. Kameran är placerad på en något högre nivå än golvet och vinklade nedåt för att fokusera på reflektion av tassar i spegeln (Fig. 1B). Användningen av en första yta spegel förbättrar avsevärt tydligheten i tassarna för videouppspelning.
6. Varje tugga av pastan pjäs är hörbar och därmed är ljudinspelning bra för att verifiera att äta.

3. Administrera försök pasta hantering

1. Test sessioner består av sekventiell försök, med en pasta bit ätit per rättegång. Vi registrerar vanligtvis uppgifter 4-5 försök per råtta och 3-4 försök per mus.
2. Innan videofilmning, är en bit pasta placeras in i kammaren att inleda äta och att flytta djuret till en lämplig kamera uppfattning.
3. Det är nödvändigt för djuret att möta kameran och att fokusera och zooma tillräckligt (~ 10-12X) för att visa diskreta justeringar med båda framtassarna och alla siffror. Knogarna på båda tassarna bör vara synlig. Åtminstone med denna kamera, finner vi det lämpligt att använda autofokus funktioner bara före rättegång debut, att minska i den regionen av intresse. Vi växlar därefter till manuell fokus.
4. Så snart djuret och kameran är på plats, är den första rättegången inleddes. En bit tappas eller dinglade direkt framför djuret och inspelningen inleds före äta debut.
5. Därefter försöken ges i omedelbar följd. Det är tillrådligt att minimera förseningar mellan studier så att djuren inte flytta bortfrån den optimala visningsläge.
6. Prövningar där tassar ses på sidan eller där fokus är förlorat är inte poäng.
7. Testet sessioner kan upprepas under dagarna, t.ex. att dokumentera före och efter behandling tidsmässiga mönster (t.ex. återhämtning efter CNS-skada,. Allred et al, 2008).
8. En utmaning kan vara att få djuren att äta i önskad position i förhållande till kameran. Det kan vara nödvändigt att vänja kamera-skygga djuren på närvaron av kameran under ett par minuter före testning. Djur kan ofta vara lirkade in den position genom att släppa eller dinglar pasta i den perfekta regionen. Det kan kräva ett par bitar för att åstadkomma detta önskad position, även om antal givna delar bör minimeras för att undvika mättnad.
9. För sekventiell testning av flera råttor har vi funnit det bekvämt att konfigurera några av sina burar i taget i en cirkel, med kameran på ett hjulförsett stativ i mitten. En bit släpps in i en idealisk region i varje bur och kameran därefter flyttade till råttan som börjar äta i en lämplig position först. Detta ger mer tid för långsammare (för att äta på plats) råttor att vänja sig vid kameran och försöksledaren närvaro och de kan också stimuleras att äta den bitande ljudet av snabbare råttor.

4. Kvantitativ videoanalys av framtassarna justeringar och äter tid

1. Analysen av framtassarna justeringar under ätande är ett enkelt kvantitativt mått som är känslig för lateralized nedskrivningar efter CNS-skada hos råttor (Allred et al, 2008;. Whishaw & Coles, 1996; Whishaw et al, 1997.) Och åldersrelaterade förändringar hos möss (Tennant et al., 2009).
2. De kvantifierade delen av rättegången börjar när pastan pjäsen är första gången släpps in i munnen och slutar när den sista av de pasta frigörs från tassar och försvinner in i munnen.
3. Videouppspelning är långsammare (~ 50% i realtid) eller frame-by-frame förväg används, vid behov, för att identifiera justeringar.
4. En justering räknas varje gång tassen släpper och åter kontakter pastan pjäs, när det är reformeringen av tass grepp om pjäsen, eller när det finns en extension-flexion eller bortförande-adduktion av siffror (Fig. 2). Varje justering redovisas separat för vänster och höger tass.
5. Justeringar räknas inte när tassen glider över pastan stycke utan förflyttning av siffror eller ompositioneringen av tass håll. Rörelser i tassen när det inte är i kontakt med pasta bit (dvs rörelser intill verket) är inte heller räknas.
6. Tiden att äta är också registreras för varje försök, till att börja med att äta debut och slutar när pastan försvinner i munnen. Vi rekordtid med hjälp av video uppspelningsfunktioner skärm, men det kan också spelas in med ett stoppur under normal hastighet uppspelning.
7. Om djuret pauser i att äta, men håller ett grepp om pjäsen, är det dags paus subtraheras från den sammanlagda tiden. En paus för att äta framgår av antingen rörelse bit ut ur munnen eller upphörande i hörbart bitande.
8. Rättegången utelämnas från analysen om det under någon del av att äta, är synen på tassar skyms, eller om djuret bryter bit, eftersom kortare bitar förändra hantering mönster.
9. Vissa råttor och möss gör genomgående fler justeringar med en tass än det andra. För ensidiga CNS skada modeller är lateralized funktionsnedsättningar mer känsligt upptäckas om skadorna påverkar tassen som gjorde fler justeringar innan skadan testning (Allred et al., 2008).
10. Möss droppe ibland pastan bit i mitten av att äta, och efter en kort paus, plocka upp det och fortsätta äta. Detta är vanligast i den sista rättegången mot den dagen, möjligen på grund av partiell mättnad och förlust av fokus på att äta. Eftersom detta är vanligt även i intakta möss, inte utelämna vi inte dessa studier. Dock är den tid som pjäsen släpps subtraheras från den sammanlagda äta tid.
11. Hos intakta råttor släppa bitar är atypisk och återupptas i att äta är ofta mycket försenat eller frånvarande. Sådana studier utelämnas från analysen av justeringar och äta tid.
12. Justeringar innan äter uppkomsten räknas inte. Pre-ätande hantering beteenden påverkas av CNS-skador (t ex Whishaw et al, 1992;.. Whishaw et al, 1986), men vi har ännu inte förlängt kvantitativa metoder för framtassarna anpassningar av denna period.
13. Dessa data kan sammanfattas som: (a) det genomsnittliga antalet justeringar per tass per styck, (b) Den genomsnittliga tiden per styck och (c) graden av justeringar (justeringar / äter tid).

5. Video analys med atypiska hantera mönster

1. Atypiska hantering mönster kan skilja mellan olika CNS skadetyper hos råttor (Allred et al., 2008) och RECORDIng dessa beteenden kan vara bra som en kompletterande analys.
2. Hantering mönster anses atypiska om de är sällsynta fall observerats hos intakta djur. Intakta djur normalt initiera äta med en tass, den "grepp tass", placerade lägre på pasta, och "guide tass" är sedan placeras nära munnen (Fig. 3A, C). Samma tass är oftast grepp tass i alla försök. Råttor ofta ställning tassar långt ifrån varandra längs pastan först, och flytta dem tillsammans som pjäsen förkortar. Möss ställning vanligtvis både tassar nära munnen, med grepp och lemmar guide hålls nära varandra, även i början av att äta. I båda arter, tassar flytta in mer symmetrisk positioner, sida vid sida eller med siffror inföll när pjäsen är mycket kort (Fig. 3B, D). Båda tassar används kontinuerligt för att styra, hålla eller föra pastan under äta.
3. Atypiska mönster i tass position i råttor och möss är: (a) placera tassarna tillsammans, i en symmetrisk håll, när pastan pjäsen är lång (mer än hälften av den ursprungliga längd), (B.) att inte flytta tassar in en symmetrisk position innan pjäsen är helt förbrukas och (c) byta positioner av guiden och lemmar ta tag i mitt av att äta.
4. Ytterligare två atypiska beteenden hos råttor och möss är: (a) inte att kontakta pasta pjäs med en tass under en längre tid att äta ("underlåtenhet att kontakta") och (B.) med munnen för att dra pastan genom tassar för att flytta dem ("mun dra").
5. Två beteenden anses vara atypiska för råttor, men är typiska för möss: (a) krökt kroppshållning och (B.) släppa pastan bit efter maten börjar. Dock kan frekvensen av droppar i möss öka efter CNS-skada. Därför registrerar vi släppa frekvens i båda arterna.
6. Andra atypiska beteende har sett i en råtta ensidigt striatala dopaminsystemet utarmning modell: (a) ett "järngrepp", där grepp lem hålls i en orörlig, stel position under att äta, (B.) upprepade rörelser guiden tass runt den styva grepp tassen, och (c) och extrem lutning av huvudet som pastan är vinklad i munnen (Allred et al, 2008;. se även Whishaw et al 1997.).
7. Vi har konstaterat att åldern möss ofta gör justeringar som är ineffektiva för att flytta pastan i munnen. Därför är justeringar som inte resulterar i en synlig rörelse pasta bit i munnen separat.
8. Växla guiden och ta tag lemmar, fel att kontakta, droppar, och mun dra registreras per händelse, medan alla andra atypiska beteenden registreras en gång per rättegång.

6. Representativa resultat

Resultaten från videoanalys bör inkludera antal justeringar av varje tass per rättegången och tid att äta varje pasta bit. Resultat från råttor med sensomotoriska kortikala lesioner eller cerebral ischemi visar att djur gör färre justeringar med nedsatt (kontraindikationer-to-lesion) lem, en effekt som varar i minst en månad efter skador. Ensidig dopamin utarmning resulterar i både en minskning av justeringar med kontralaterala extremiteter och en ökning av justeringar med ipsilaterala extremiteterna (Allred et al., 2008). Resultat från möss visar att äldre djur tar längre tid att äta pasta bitar, och göra mer justeringar som inte leder till framsteg för pasta i munnen, jämfört med unga vuxna möss (Tennant et al., 2009). Analysen av dessa tester kan också innehålla observationer av atypiska hantering beteenden. Striatala skador och mellersta cerebral artärocklusion resulterade dessutom i ökad frekvens av onormala äta beteenden (Allred et al., 2008).

Figur 1. Pasta hantering hållning (A) råttor och (B) möss. Observera att råttorna luta sig tillbaka på sina lår medan möss föraning över pastan, kräver placering av en spegel under musen för att se tass rörelser. (C) Exempel på pasta bitar förberedas för provning.

Figur 2. Ett exempel på framtassarna justering av (AC) en råtta och (DF) en mus. Den första panelen visar djur innan justeringen visar mittpanelen på framtassarna anpassning med en asterisk som anger att justera tassen (s), och den sista panelen visar ersättningskörkortet på pasta pjäsen.

Figur 3. Guide och förstå lem positioner av råttor och möss när pastan är (A, C) lång och (B, D) kort.

Discussion

I denna video visar vi hur spån och Capellini Tester Hantering utförs på råttor och möss, respektive. Dessa tester är ett enkelt och kvantitativt sätt att studera tassen och siffran funktion i normala djur, efter skador på motoriska system i hjärnan, eller under åldrandet. Slow-motion video analys av tassen och siffran rörelser används för att hantera små bitar av okokta pastaprodukter tillåter forskaren att kvantifiera de justeringar som gjorts med varje tass, samt observera onormala beteenden som kan ses efter experimentellt inducerad CNS-skador. Provning sessioner kan göras flera gånger på olika dagar och de flesta djur slutföra alla prövningar av en session inom några minuter. Således är testet lämpligt för montering i ett större testbatteri eller experimentell design. Testerna kan också användas vid studier av motorisk inlärning (Xu et al., 2009), men här presenterar vi ett protokoll till analys förändringar i en etablerad kompetens över tiden.

För närvarande skickliga når tester är de vanligaste tester av händiga forelimb funktionen hos råttor (t ex Whishaw et al, 1986;. Ballermann et al, 2001;. Montoya et al, 1991.) Och möss (Farr & Whishaw, 2002; Tennant & Jones, 2009; Baird et al, 2001).. Nå tester tillåter isolerade provning av varje lem, medan pasta hanteringen är en bimanual uppgift. Trots de tester som är likartade i sin känslighet för nedskrivningar i kvalificerade framtassarna funktion och förvärvet av färdighet för båda testerna innebär plasticitet i forelimb representation av motoriska cortex (Xu et al., 2009). Vår erfarenhet är att nå tester är mer komplicerade och arbetskrävande att utföra och, för vissa experimentella frågor kan de nuvarande testerna ge ett effektivare alternativ. Men till skillnad från de prov som beskrivs här, har skickliga nå tester använts i decennier (Peterson, 1934) och de nu inkluderar en mångsidig uppsättning mycket känsliga åtgärder och parametrar test (Ballermann et al, 2001;. Farr & Whishaw, 2002; Montoya et al, 1991;. Whishaw et al, 1992).. Däremot spån och Capellini Tester Hantering sträcker sig från relativt ny karakteriseringar av skickliga livsmedelshantering beteende råttor (Whishaw och Coles, 1996). I både administration och analys, kan dessa prov utan tvekan ytterligare förfinas och utvidgas, t.ex. att mer exakt kvantifiera fin siffra och bimanual rörelsemönster och att kvantifiera koordinerade rörelser i tungan, munnen och käken.