Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

الإنبثاث التجريبية وCTL المناعي نقل بالتبني النموذجي ماوس

Published: November 26, 2010 doi: 10.3791/2077
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Medical College of Georgia
* These authors contributed equally

Summary

والانبثاث الرئة التجريبية وCTL نموذج الفأر المناعي لتحليل التفاعل خلية ورم الخلايا التائية

Abstract

الفأر نموذج تجريبي الانبثاث الانبثاث هو نموذج بسيط ولكن ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. يتم حقن الخلايا السرطانية عن طريق الوريد (رابعا) في أوردة الذيل الماوس واستعمار في الرئتين ، وبالتالي ، تشبه الخطوات الأخيرة من خلايا الورم ورم خبيث عفوية : البقاء في التسرب وتداولها والاستعمار في الأجهزة الطرفية. من وجهة نظر علاجية ، والنموذج التجريبي الانبثاث هو النموذج المثالي منذ أبسط والهدف من العلاجات غالبا ما تكون نقطة النهاية في الانبثاث : الورم النقيلي أنشئت في الجهاز البعيد. في هذا النموذج ، يتم حقن الخلايا السرطانية في أوردة الذيل الرابع الماوس ويسمح للاستعمار وتنمو في الرئتين. ثم يتم حقن الورم محددة CTLs الرابع في الماوس الانبثاث الحاملة. يمكن التحكم في عدد وحجم الرئة الانبثاث من قبل عدد من خلايا الورم ليتم حقنه والوقت للنمو الورم. لذلك ، مراحل مختلفة من ورم خبيث ، من الحد الأدنى لالانبثاث الانبثاث واسعة ، يمكن أن تكون على غرار. ويتم تحليل الانبثاث الرئة بسبب التضخم مع الحبر ، مما يتيح سهولة الملاحظة البصرية والكمي.

Protocol

1. التجريبية النموذجية الإنبثاث ماوس

  1. في اليوم قبل حقن الخلايا السرطانية ، والبذور one T75 قارورة مع ما يصل إلى 1 × 10 7 CMS4 التقوا الخلايا في 10 مل من المتوسط ​​RPMI تحتوي على 10 ٪ للحصول على المصل سريعة النمو الخلايا السرطانية. يحضن بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  2. في يوم من الحقن ، وإزالة المتوسطة وشطف خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ، ثم حصاد الخلايا السرطانية مع 0.05 ٪ التربسين - EDTA عند 37 لمدة 5 دقائق درجة مئوية. وقف تفاعل مع 10 مل من المتوسط ​​RPMI يحتوي المصل 10 ٪. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي الشكل.
  3. تدور باستمرار في 1300 دورة في الدقيقة الخلايا في جهاز للطرد المركزي Sorvall RT الأيقونات لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف. Resuspend الخلايا في HBSS 10 مل 1X جديدة ليغسل ، وتدور ثم تراجع مرة اخرى وresuspend بالطريقة نفسها.
  4. عد الخلايا السرطانية على عدادة الكريات. تمييع الخلايا في HBSS ، بحيث يتم معلق الخلايا المطلوبة لكل الحقن في حجم ما مجموعه 100 ميكرولتر.
  5. تدفئة 6-8 الاسبوع القديمة BALB / ج الفئران في كوب مغمورة في الماء الدافئ لتمدد الأوردة الذيل. ضع الماوس على ذيل restrainer الوريد على مقاعد البدلاء. استخدام microsyringe لحقن 100 ميكرولتر من الخلايا السرطانية في الوريد الذيل الأفقي. استخدام تقنية معقمة لتجنب العدوى. بعد الحقن ، وممارسة ضغوط طفيفة في موقع الحقن حتى توقف النزيف.
  6. عودة الماوس إلى القفص ، والسماح للورم أن ينمو الى مرحلة المطلوبة.

2. السامة للخلايا الليمفاوية T - (CTL) نقل المناعي بالتبني

  1. في يوم من النقل ، ماصة صعودا وهبوطا لتنقية resuspend السامة للخلايا الليمفاوية تي ، أو CTLs ، أعد كما هو موضح في النص. نقل كافة الخلايا من واحد لوحة أنبوب مخروطي 15 مل ، عدم السماح للحجم تتجاوز أكثر من 2 / 3 من الأنبوب.
  2. إدراج ماصة معقمة باستور في أنبوب مخروطي الشكل ، وتضع اللمفاويات متوسطة الفاصل ، أو LSM ، تحت الخلايا حتى تقترب من إجمالي حجم 14 مل.
  3. يجب الحرص على عدم تعكير صفو طبقات. الطرد المركزي في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لا تستخدم الفرامل لابطاء الدوار بعد الغزل.
  4. نقل CTLs لأنبوب جديد 15 مل المخروطية. إضافة إلى HBSS وبلغ حجم التداول نحو 10 مل لغسل.
  5. عدد الخلايا. تدور باستمرار في 1300 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. Resuspend في HBSS لكثافة الخلايا المطلوبة لعمليات الحقن ، والحفاظ على الحجم الكلي للحقن في 100 ميليلتر.
  6. استخدام حقن ذيل نفس الأسلوب كما رأينا في وقت سابق من هذا الفيديو لحقن CTLs في الفئران الحاملة للورم.
  7. عودة الماوس إلى القفص ، والسماح للCTLs للتفاعل مع الورم. وعادة ما يتم التضحية الفئران لتحليل 14-21 يوما بعد العلاج CTL.

3. تصور الانبثاث الرئة

  1. لتصور الانبثاث الرئة ، ووضع الفأرة على ظهرها التضحية على لوحة الستايروفوم. دبوس الساقين لضمان الوصول دون عائق الى القصبة الهوائية. رش الجانب البطني مع الايثانول 70 ٪.
  2. بدءا من منتصف البطن ، واستخدام المقص لقطع على طول خط الوسط ، من خلال القفص الصدري ، وحتى تجاه الغدد اللعابية. فضح القصبة الهوائية. استخدام الملقط لإزالة الأنسجة المحيطة القصبة الهوائية.
  3. الصفحات 200 غيض ميكرولتر ماصة أسفل القصبة الهوائية. عقد قمة مع يد واحدة ، ورفع بلطف صعودا والقصبة الهوائية بعيدا عن الجسم.
  4. منصة تدوير 180 درجة. استخدام الحقنة 50 مل لحقن الحبر الهند إلى الرئتين عبر القصبة الهوائية. تضخم الرئتين تماما مع الحبر حتى تشعر أنك على مقاومة قوية.
  5. استخدام مقص لقطع القصبة الهوائية. زوج من الشرائح ملقط تحت الرئتين وانتشالهم من الفأرة. شطف الرئتين لفترة وجيزة في كوب من الماء 1L.
  6. في غطاء الدخان الكيميائية ، ونقل إلى الرئتين قارورة زجاجية تحتوي على 5 التلألؤ مل من محلول Fekete ل. سوف تظهر وكأنها نسيج الورم عقيدات بيضاء على الرئتين سوداء بعد بضع دقائق. ويمكن الآن للأورام تحسب وتخزينها في حل Fekete الى أجل غير مسمى.

4. ممثل الانبثاث في الرئتين متصور

  1. هنا ، والرئتين من الفئران التي حقنت مع سرطان الثدي 4T1 خط الخلية تظهر بقع بيضاء تشير إلى أورام. الفئران التي حقنت بخلايا 4T1 transfected مع K79E المهيمنة سلبية IRF8 متحولة تبرز إمكانات تعزيز المنتشر من الخلايا السرطانية.
  2. هذه الصور تظهر التحليل النسيجي للفعالية العلاج المناعي CTL نقل بالتبني. وأظهرت الفئران الحاملة للورم حقنها بمحلول ملحي أورام متعددة 6 أيام في وقت لاحق ، أشارت بواسطة الأسهم الصفراء (A). فئران حقنت بخلايا T ورم محددة ، من ناحية أخرى ، أظهرت انخفاضا من الأورام (B).
  3. في التجربة نفسها ، الهند علاج الحبر يعطي أبسط طريقة لقياس مدى فعالية نقل بالتبني CTL. هنا ، عقيدات بيضاء على الورم الحاملة للورم الرئة التمييز بوضوح بينها وبين الرئتين التي مرت بنجاح نقل بالتبني CTL ، والعد العقيدات يسمح للحصول على درجةمن الكميات غير ممكن مع الأنسجة.

5. ممثل النتائج

الشكل 1
الشكل 1. مخطط تجريبي لالانبثاث ورم التجريبية وCTL المناعي نقل التكيف نموذج الفأر. النقاط الحمراء تشير إلى الخلايا السرطانية والنقاط الخضراء تشير CTLs.

الشكل 2
تعزيز الشكل 2. IRF8 تعطيل وظيفة المحتملة المتنقل من الخلايا السرطانية. وكان transfected ستابلي الماوس الخلية 4T1 سرطان الثدي مع خط ناقل (4T1.Vector) أو ناقلات إبداء IRF8 المهيمنة سلبية متحولة K79E (4T1.IRF8K79E) (15 ، 16). تم حقن الخلايا السرطانية الرابع في ذيل الفأر الأوردة الجانبية. فقد ضخمت الورم الحاملة الرئتين مع الحبر الهند لتصور العقيدات الورم. وينظر بسهولة العقيدات الورم على شكل بقع بيضاء على خلفية سوداء نسيج الرئة.

الشكل 3
الشكل 3. تحليل النسيجي من فعالية العلاج المناعي CTL نقل بالتبني. تم حقن الخلايا ساركومة خط الماوس CMS4 التقوا الرابع في أوردة الذيل الماوس الجانبية. بعد ثلاثة أيام ، تم حقن المياه المالحة (A) أو ورم محددة الخلايا التائية (B) في الفئران الحاملة للورم. وقد تم تحليل الرئتين بعد ستة أيام من العلاج بواسطة CTL تلطيخ H & E التقليدية النسيجية. يشار العقيدات الورم عن طريق الأسهم.

الشكل 4
الشكل 4. التصور العقيدات الورم عن طريق التضخم الحبر الهند. تم حقن الخلايا ساركومة خط الماوس CMS4 التقوا الرابع في أوردة الذيل الماوس الجانبية. بعد ثلاثة أيام ، تم حقن المياه المالحة (مراقبة) أو ورم محددة الخلايا التائية (+ CTL) في الفئران الحاملة للورم. وقد تم تحليل الرئتين أربعة عشر يوما بعد العلاج CTL. بقع بيضاء ، والتي هي العقيدات الورم ، والسماح للالكمي سهل من فعالية العلاج CTL.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تم شراؤها من الفئران في معهد السرطان الوطني (Friderick ، ​​MD) ، ومقرها في كلية الطب في جورجيا مرفق الحيوانية. وكانت التجارب والرعاية / الرعاية بالاتفاق مع الأنظمة الاتحادية وبروتوكولا وافق عليها كلية الطب في جورجيا IACUC اللجنة.

Acknowledgments

بدعم من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (CA133085 إلى كوالا لمبور) والجمعية الأميركية للسرطان (RSG - 09 - 209 - 01 - TBG إلى كوالا لمبور).

Materials

Solutions:

India Ink Solution (17):
  1. Pour 150 ml of distilled water into a 250 ml flask.
  2. Add 4 drops ammonium hydroxide to the distilled water.
  3. Add 30 ml India Ink stock (i.e. Sanford Black Magic Waterproof Drawing Ink 4465 Item 44011) to the ammonia and water mixture.
  4. Top off with distilled water to a volume of 200 ml. Solution is ready for injection.

Fekete's Solution (17):

Fekete's solution is used to bleach India ink-inflated tumor-bearing lungs to distinguish white tumor nodules from the black background of normal tissues.
  1. Add 350ml 95% EtOH to 1L glass bottle.
  2. Add 150ml distilled water
  3. Add 50ml formaldehyde
  4. Add 25ml glacial acidic acid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ryan, M. H., Bristol, J. A., McDuffie, E., Abrams, S. I. Regression of extensive pulmonary metastases in mice by adoptive transfer of antigen-specific CD8(+) CTL reactive against tumor cells expressing a naturally occurring rejection epitope. J Immunol. 167 (8), 4286-4292 (2001).
  2. Caldwell, S. A., Ryan, M. H., McDuffie, E., Abrams, S. I. The Fas/Fas ligand pathway is important for optimal tumor regression in a mouse model of CTL adoptive immunotherapy of experimental CMS4 lung metastases. J Immunol. 171 (5), 2402-2412 (2003).
  3. Liu, K., Caldwell, S. A., Greeneltch, K. M., Yang, D., Abrams, S. I. CTL Adoptive Immunotherapy Concurrently Mediates Tumor Regression and Tumor Escape. J Immunol. 176 (6), 3374-3382 (2006).
  4. Yang, D., Stewart, T. J., Smith, K. K., Georgi, D., Abrams, S. I., Liu, K. Downregulation of IFN-gammaR in association with loss of Fas function is linked to tumor progression. International journal of cancer. 122 (2), 350-362 (2008).
  5. Pages, F., Berger, A., Camus, M. Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer. N Engl J Med. 353 (25), 2654-2666 (2005).
  6. Galon, J., Costes, A., Sanchez-Cabo, F. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science. 313 (5795), 1960-194 (2006).
  7. Strater, J., Hinz, U., Hasel, C. Impaired CD95 expression predisposes for recurrence in curatively resected colon carcinoma: clinical evidence for immunoselection and CD95L mediated control of minimal residual disease. Gut. 54 (5), 661-665 (2005).
  8. Camus, M., Tosolini, M., Mlecnik, B. Coordination of intratumoral immune reaction and human colorectal cancer recurrence. Cancer research. 69 (6), 2685-2693 (2009).
  9. Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Yang, J. C. Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma. J Clin Oncol. 23 (10), 2346-2357 (2005).
  10. Srivastava, M. K., Sinha, P., Clements, V. K., Rodriguez, P., Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T-cell activation by depleting cystine and cysteine. Cancer research. 70 (1), 68-77 (2010).
  11. Nagaraj, S., Gabrilovich, D. I. Tumor escape mechanism governed by myeloid-derived suppressor cells. Cancer research. 68 (8), 2561-2563 (2008).
  12. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature reviews. 9 (4), 274-284 (2009).
  13. Heijstek, M. W., Kranenburg, O., Rinkes, B. orel, H, I. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Digestive surgery. 22 (1-2), 1-2 (2005).
  14. Yang, D., Ud Din, N., Browning, D. D., Abrams, S. I., Liu, K. Targeting lymphotoxin beta receptor with tumor-specific T lymphocytes for tumor regression. Clin Cancer Res. 13 (17), 5202-5210 (2007).
  15. Yang, D., Thangaraju, M., Browning, D. D. IFN Regulatory Factor 8 Mediates Apoptosis in Nonhemopoietic Tumor Cells via Regulation of Fas Expression. J Immunol. 179 (7), 4775-4782 (2007).
  16. Yang, D., Thangaraju, M., Greeneltch, K. Repression of IFN regulatory factor 8 by DNA methylation is a molecular determinant of apoptotic resistance and metastatic phenotype in metastatic tumor cells. Cancer research. 67 (7), 3301-3309 (2007).
  17. Wexler, H. Accurate identification of experimental pulmonary metastases. Journal of the National Cancer Institute. 36 (4), 641-645 (1966).

Tags

علم المناعة ، العدد 45 ، الإنبثاث ، CTL نقل بالتبني والرئة ، ورم المناعة
الإنبثاث التجريبية وCTL المناعي نقل بالتبني النموذجي ماوس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K.… More

Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model. J. Vis. Exp. (45), e2077, doi:10.3791/2077 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter