Summary
종양 세포 - T 세포 상호 작용의 분석을 위해 실험적인 폐 전이와 CTL immunotherapy 마우스 모델
Abstract
실험 전이 마우스 모델은 생리학 관련 아직 간단하고 전이 모델입니다. 종양 세포는 마우스 꼬리 정맥에 (4) 정맥 주사하고 종양 세포 자발적인 전이의 마지막 단계를 닮은, 따라서, 폐 이식과 같습니다 말초 장기의 순환, 넘쳐 흐름과 식민지에서 생존합니다. 말초 기관에서 설립 전이성 종양 : 요법의 목표는 종종 전이의 끝 지점이기 때문에보기의 치료 시점에서 실험적 전이 모델은 가장 간단한 이상적 모델입니다. 이 모델에서, 종양 세포는 마우스 꼬리 정맥에 주입 IV 및 폐의 이식과 성장을 사용할 수 있습니다. 종양 특정 CTLs은 다음 metastases 베어링 마우스에 IV를 주입하고 있습니다. 폐 metastases의 번호와 크기는 주입으로 종양 세포의 수와 종양 성장의 시간에 의해 제어하실 수 있습니다. 따라서, 전이의 여러 단계, 광범위한 전이에 최소한의 전이에서 모델 수 있습니다. 룽 metastases 따라서 쉽게 시각 관측 및 부량를 허용, 잉크와 인플레이션에 의해 분석됩니다.
Protocol
1. 실험 전이 마우스 모델
- 당일 전에 종양 세포 주사, 최대 1과 씨앗 하나 T75 플라스크 X 10 7 CMS4 - 메트 빠르게 성장하는 종양 세포를 얻기 위해 혈청 10 %를 포함하는 RPMI 매체의 10 ML에 세포를. 37 밤새 품어 ° C.
- 주사 당일, 미디어를 제거하고 PBS로 세포를 한 번 씻어 후 37 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)으로 종양 세포를 수확 ° C를 5 분. 10 % 혈청이 포함된 RPMI 매체 10 ML로 반응을 중지합니다. 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다.
- 상온에서 3 분 Sorvall 전설 RT의 원심 분리기에서 1,300 rpm으로 세포를 스핀 다운. 뜨는을 제거합니다. 세차 10 ML 신선한 1X HBSS에있는 세포를 Resuspend, 다시 스핀 다운과 같은 방식으로 resuspend.
- hemocytometer에서 종양 세포를 계산합니다. 각각의 주사에 필요한 세포 100 μL의 총 볼륨 resuspended되도록, HBSS에있는 세포를 희석.
- 꼬리 정맥을 팽창하기 위해 따뜻한 물에 잠겨 비커에 6~8주 이전 BALB / C 마우스를 따뜻하게. 벤치에 꼬리 정맥 restrainer에 마우스를 놓습니다. 측면 꼬리 정맥에 종양 세포 100 μL를 주입하는 microsyringe을 사용합니다. 감염을 피하기 위해 무균 기술을 사용합니다. 출혈이 멈출 때까지 주입 후, 주사 사이트에 약간의 압력을 적용합니다.
- 새장에 마우스를 반환하고, 종양이 원하는 단계로 성장할 수 있습니다.
2. 세포 독성 T - 림프구 (CTL) 입양 전송 Immunotherapy
- 송금 당일, 정화 T - lymphocytes 세포 독성, 또는 CTLs, 텍스트에서 설명한대로 준비를 resuspend하기 위해 아래 피펫합니다. 볼륨이 더 튜브의 2 / 3 이상을 초과 두지 않을, 15 ML 원뿔 관 한 접시의 세포를 모두 전송합니다.
- 원뿔 관에 멸균 파스퇴르 피펫을 넣고 총 부피 14 ML을 nears 때까지 세포에서 림프구 분리 매체, 또는 LSM 있다고 믿는다.
- 레이어를 방해하지 않도록주의하십시오. 실온에서 20 분 동안 2,000 rpm으로 원심 분리기. 회전 후 회전자을 늦추기 위해 브레이크를 사용하지 마십시오.
- 새로운 15 ML 원뿔 관에 CTLs을 전송합니다. 씻어 약 10 ML의 볼륨 HBSS를 추가합니다.
- 세포를 계산합니다. 실온에서 5 분간 1300 rpm으로 스핀 다운. 100 μL에 주입 당 총 볼륨을 유지, 주사에 필요한 세포 밀도에 HBSS에 Resuspend.
- 종양 - 베어링 생쥐에 CTLs를 삽입하는 이전이 비디오에서 볼 같은 꼬리 사출 기술을 사용합니다.
- 새장에 마우스를 반환하고, CTLs이 종양과 상호 작용 수 있습니다. 마우스는 일반적으로 14-21일 CTL 치료 후 분석을 위해 희생하고 있습니다.
3. 룽 Metastases의 시각화
- 폐 metastases를 시각화하기 위해 스티로폼 보드의 뒷면에 희생 마우스를 놓으십시오. 기관에 가리지 접근을 보장하기 위해 다리를 핀. 70 % 에탄올로 복부 측면을 스프레이.
- 중간 복부에서 시작, 침샘쪽으로 최대 ribcage 통해 정중선을 따라 잘라, 및 가위를 사용합니다. 기관을 폭로. 기관 주위 조직을 제거하는 집게를 사용하십시오.
- 기관 밑에 200 μL 피펫 팁을 실. 한손으로 팁을 개최하는 것은 부드럽게 신체의기도를 들어갑니다.
- 플랫폼 180도 회전 °. 기관을 통해 폐로 인도 잉크를 주입하기 위해 50 ML의 주사기를 사용합니다. 당신은 강한 저항을 느낄 때까지 완전히 잉크와 폐가 팽창.
- 기관를 잘라 가위를 사용합니다. 폐 아래 포셉 한 쌍의 슬라이드 그들을 마우스 밖으로 리프트. 물 1L 비커에 간단히 폐가 린스.
- 화학 펌 모자, Fekete의 솔루션의 5 ML를 포함하는 유리 섬광 약병에 폐을 전송하기만하면됩니다. 종양 조직은 몇 분 후에 검은 폐에 흰색 nodules로 등장할 것입니다. 종양은 이제 계산하고 무기한 Fekete의 솔루션에 저장할 수 있습니다.
4. 시각 폐에 대표 Metastases
- 여기, 내유 암종 세포 라인 4T1로 주입했다 생쥐의 폐 종양을 나타내는 흰 반점을 보여줍니다. IRF8 지배 - 부정적인 돌연변 K79E와 transfected 4T1 세포로 주입했다 생쥐는 종양 세포의 향상된 전이성 잠재력을 보여줍니다.
- 이러한 이미지는 CTL 입양 전송 immunotherapy의 효능 histological 분석을 보여줍니다. 식염수에 주입 종양 베어링 마우스는 노란색 화살표 (A)로 표시, 6 일 후 여러 종양을 보여주었다. 종양 특정 T 세포로 주입 생쥐는 반면에, 종양의 감소 (B)를 보여주었다.
- 같은 실험에서, 인도 잉크 치료 CTL 입양 전송의 효능을 측정하는 간단한 방법을 제공합니다. 여기, 종양 - 베어링 폐에 하얀 종양의 nodules 확실히 성공적으로 CTL 입양 전송받은, 그리고 nodules을 계산해야 폐가에서 그들을 구분하는 것은 학위 허용조직학과 quantitation의 수 없습니다.
5. 대표 결과
그림 1. 실험 종양 전이 및 CTL 적응 전송 immunotherapy 마우스 모델 실험 계획. 레드 점들은 종양 세포와 녹색 점들은 CTLs를 나타냅니다 나타냅니다.
그림 2. IRF8 기능의 장애는 종양 세포의 전이성 잠재력을 향상. 마우스 내유 암종 세포 라인 4T1은 안정 벡터 (4T1.Vector) 또는 벡터 IRF8 지배 - 부정적인 돌연변이 K79E (4T1.IRF8K79E)를 (15, 16) 표현과 transfected했다. 종양 세포는 마우스 측면 꼬리 정맥에 주입 IV했다. 종양 베어링 폐에 종양 nodules을 시각화하기 위해 인도 잉크로 비정상적으로 증가했다. 종양 nodules 쉽게 검은 폐 조직 배경에 흰색 반점으로 볼 수 있습니다.
그림 3. CTL 입양 전송 immunotherapy의 효능 Histological 분석. 마우스 육종 세포 라인 CMS4 - 메트는 마우스 측면 꼬리 정맥에 주입 IV를했다. 사흘 후, 호수 (A) 또는 종양 특정 T 세포 (B)은 종양 베어링 생쥐에 주입했다. 폐 6 일 기존의 H & E histological 얼룩하여 CTL 치료 후 분석했다. 종양 nodules는 화살표로 표시됩니다.
그림 4. 인도 잉크 인플레이션에 의해 종양 nodules의 시각화. 마우스 육종 세포 라인 CMS4 - 메트는 마우스 측면 꼬리 정맥에 주입 IV를했다. 사흘 후, 생리 (컨트롤) 또는 종양 특정 T 세포는 (+ CTL) 종양 베어링 생쥐에 주입했다. 폐가 십사일 CTL 치료 후에 분석했다. 종양 nodules있는 하얀 명소, CTL 치료의 효능에 대해 쉽게 부량 수 있습니다.
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Disclosures
생쥐는 국립 암 연구소 (Friderick, MD)에서 구입 조지아 동물 시설의 메디컬 칼리지 안에 보관되어 있었다. 실험 및 의료 / 복지 연방 규정 계약 및 조지아 IACUC위원회의 메디컬 칼리지에 의해 승인된 프로토콜되었습니다.
Acknowledgments
국립 보건원 (KL에 CA133085)와 미국 암 협회에서 부여 (KL에 RSG - 09 - 209-01 - TBG) 지원.
Materials
Solutions: |
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India Ink Solution (17): |
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Fekete's Solution (17): |
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Fekete's solution is used to bleach India ink-inflated tumor-bearing lungs to distinguish white tumor nodules from the black background of normal tissues. |
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References
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