Summary
Een experimentele long metastase en CTL immunotherapie muis-model voor de analyse van tumorcellen-T-cel-interactie
Abstract
Experimenteel metastase muismodel is een eenvoudige en toch fysiologisch relevante metastase model. De tumorcellen worden intraveneus geïnjecteerd (iv) in de muis staart aderen en koloniseren in de longen, waardoor, lijkt op de laatste stappen van tumorcellen spontane metastase: overleven in de bloedsomloop, extravasatie en kolonisatie in de distale organen. Vanuit therapeutisch oogpunt, de experimentele metastase model is de eenvoudigste en ideale model, omdat het doel van therapieën is vaak het eindpunt van metastase: opgericht gemetastaseerde tumor in de distale orgel. In dit model worden tumorcellen ingespoten iv in de muis staart aderen en toegestaan om te koloniseren en te groeien in de longen. Tumor-specifieke CTL's worden vervolgens geïnjecteerd in de uitzaaiingen iv-dragende muis. Het aantal en de grootte van de long metastasen kan worden gecontroleerd door het aantal tumorcellen te worden geïnjecteerd en de tijd van tumorgroei. Daarom verschillende stadia van metastase, van minimale metastase tot uitgebreide metastase, kan worden gemodelleerd. Longmetastasen worden geanalyseerd door de inflatie met inkt, waardoor makkelijker visuele waarneming en kwantificering.
Protocol
1. Experimentele Metastase Muis Model
- Op de dag voor de tumorcel injecties, zaad een T75 fles met maximaal 1 x 10 7 CMS4-Met-cellen in 10 ml RPMI medium dat 10% serum op de snel groeiende tumor cellen te verkrijgen. Incubeer overnacht bij 37 ° C.
- Op de dag van de injectie, het medium te verwijderen en een keer spoelen van de cellen met PBS, dan is de oogst van het tumorcellen met 0,05% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Stop de reactie met 10 ml RPMI medium dat 10% serum. Overdracht cellen om een conische buis.
- Spin down de cellen bij 1300 rpm in een Sorvall Legend RT centrifuge gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in 10 ml vers 1X HBSS te wassen, dan weer spin down en resuspendeer op dezelfde manier.
- Tel de tumor cellen op een hemocytometer. Verdun de cellen in HBSS, zodat de cellen die nodig zijn voor elke injectie worden opnieuw gesuspendeerd in een totaal volume van 100 ul.
- Warm de 6-8 week oude BALB / c muizen in een bekerglas ondergedompeld in warm water naar de staart ader te verwijden. Plaats de muis op een staartader restrainer op de bank. Gebruik een micro van 100 ul van tumorcellen te injecteren in de laterale staartader. Gebruik aseptische techniek om infectie te voorkomen. Na injectie van toepassing lichte druk op de injectieplaats tot bloeden is gestopt.
- Zet de muis naar de kooi, en laat de tumor te groeien tot de gewenste podium.
2. Cytotoxische T-lymfocyten (CTL) adoptieve overdracht Immunotherapie
- Op de dag van de overdracht, pipet op en neer naar gezuiverde cytotoxische T-lymfocyten, of CTL, bereid zoals beschreven in de tekst mengen. Overdracht van al de cellen van de ene plaat naar een 15 ml conische buis, niet laten het volume hoger zijn dan meer dan 2 / 3 van de buis.
- Plaats een steriel Pasteur pipet in de conische buis en leg Lymfocyt scheiding Medium, of LSM, onder de cellen tot het totale volume nadert 14 ml.
- Wees voorzichtig niet om de lagen te verstoren. Centrifugeer bij 2000 rpm gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Geen gebruik maken van het rempedaal naar het rotor langzaam na het spinnen.
- Overdracht van de CTL's om een nieuw 15 ml conische buis. Voeg HBSS tot een volume van ongeveer 10 ml te wassen.
- Tel de cellen. Spin neer op 1300 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer in HBSS om de benodigde celdichtheid voor injecties, waarbij het totale volume per injectie op 100 pi.
- Gebruik dezelfde staart injectietechniek zoals eerder in deze video zien op de CTL's injecteren in tumor-dragende muizen.
- Zet de muis naar de kooi, en laat de CTL's om te interageren met de tumor. Muizen zijn meestal opgeofferd voor analyse 14-21 dagen na de CTL behandeling.
3. Visualisatie van longmetastasen
- Te visualiseren longmetastasen, plaats een geofferd muis op zijn rug op een piepschuim bord. Speld de benen om onbelemmerde toegang tot de luchtpijp te verzekeren. Spray de ventrale zijde met 70% ethanol.
- Vanaf het midden van de buik, gebruik van een schaar te snijden langs de middellijn, door middel van de ribbenkast, en omhoog in de richting van de speekselklieren. Expose de luchtpijp. Een tang om weefsels rond de luchtpijp te verwijderen.
- Rijg een 200 pi pipettip onder de luchtpijp. Houd de tip met een hand, til de luchtpijp omhoog en weg van het lichaam.
- Draai het platform 180 °. Gebruik een 50 ml spuit naar India Ink te injecteren in de longen via de luchtpijp. Volledig opblazen van de longen met inkt totdat je voelt een sterke weerstand.
- Gebruik een schaar om de luchtpijp te snijden. Schuif een pincet onder de longen en til ze uit de muis. Kort Spoel de longen in een 1 liter beker water.
- In een chemische dampkap, overdracht van de longen om een glas scintillatie flacon met 5 ml van de oplossing Fekete's. De tumor weefsel zal verschijnen als witte knobbeltjes op de zwarte longen na een paar minuten. De tumoren kunnen nu worden geteld en opgeslagen in oplossing Fekete is voor onbepaalde tijd.
4. Vertegenwoordiger Metastasen in Gevisualiseerde longen
- Hier, de longen van muizen die werden ingespoten met mammacarcinoom cellijn 4T1 tonen witte vlekken geven tumoren. Muizen die werden geïnjecteerd met 4T1 cellen getransfecteerd met een IRF8 dominant-negatieve mutant K79E tonen de verbeterde metastatisch potentieel van tumorcellen.
- Deze beelden tonen een histologische analyse van de werkzaamheid van CTL adoptieve overdracht immunotherapie. Tumor-dragende muizen ingespoten met een zoutoplossing toonde meerdere tumoren 6 dagen later, aangegeven met gele pijlen (A). Muizen geïnjecteerd met tumor-specifieke T-cellen, aan de andere kant, toonde een vermindering van de tumoren (B).
- In hetzelfde experiment, India inkt behandeling geeft een eenvoudiger manier om de werkzaamheid van CTL adoptieve overdracht te meten. Hier, de witte tumor knobbeltjes op tumor-dragende longen duidelijk onderscheiden van de longen die met succes hebben ondergaan CTL adoptieve overdracht, en het tellen van de knollen zorgt voor een diplomavan kwantificering niet mogelijk is met histologie.
5. Representatieve resultaten
Figuur 1. Experimentele regeling voor experimentele tumor metastase en CTL adaptieve overdracht immunotherapie muis model. Rode stippen geven aan tumorcellen en groene stippen aangeven CTL's.
Figuur 2. Verstoring van IRF8 functie verbeterde de metastatisch potentieel van tumorcellen. Muis mammacarcinoom cellijn 4T1 was stabiel getransfecteerd met vector (4T1.Vector) of vector die een IRF8 dominant-negatieve mutant K79E (4T1.IRF8K79E) (15, 16). Tumorcellen werden geïnjecteerd iv in muis laterale staart aderen. Tumor-dragende longen werden opgeblazen met Oost-Indische inkt om tumoren te visualiseren. Tumoren zijn gemakkelijk te zien als witte vlekken op de zwarte longweefsel achtergrond.
Figuur 3. Histologische analyse van de werkzaamheid van CTL adoptieve overdracht immunotherapie. Muis sarcoom cellijn CMS4-Met werd geïnjecteerd in muizen iv laterale staart aderen. Drie dagen later werden de zoutoplossing (A) of tumor-specifieke T-cellen (B) geïnjecteerd in de tumor-dragende muizen. Longen werden geanalyseerd zes dagen na CTL behandeling door middel van conventionele H & E histologische kleuring. Tumoren zijn aangegeven met pijlen.
Figuur 4. Visualisatie van tumoren door de Oost-Indische inkt inflatie. Muis sarcoom cellijn CMS4-Met werd geïnjecteerd in muizen iv laterale staart aderen. Drie dagen later werden zoutoplossing (Control) of tumor-specifieke T-cellen (+ CTL) geïnjecteerd in de tumor-dragende muizen. Longen werden geanalyseerd veertien dagen na de behandeling CTL. De witte vlekken, die tumoren, zorgen voor een gemakkelijke kwantificering van de effectiviteit van CTL behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Muizen werden gekocht bij het National Cancer Institute (Friderick, MD) en gehuisvest in het Medical College of Georgia dier faciliteit. Experimenten en zorg / welzijn waren in overeenstemming met de federale regelgeving en een goedgekeurde protocol door het Medical College of Georgia IACUC commissie.
Acknowledgments
Ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (CA133085 naar KL) en de American Cancer Society (RSG-09-209-01-TBG naar KL).
Materials
Solutions: |
|||
India Ink Solution (17): |
|||
|
|||
Fekete's Solution (17): |
|||
Fekete's solution is used to bleach India ink-inflated tumor-bearing lungs to distinguish white tumor nodules from the black background of normal tissues. |
|||
|
References
- Ryan, M. H., Bristol, J. A., McDuffie, E., Abrams, S. I. Regression of extensive pulmonary metastases in mice by adoptive transfer of antigen-specific CD8(+) CTL reactive against tumor cells expressing a naturally occurring rejection epitope. J Immunol. 167 (8), 4286-4292 (2001).
- Caldwell, S. A., Ryan, M. H., McDuffie, E., Abrams, S. I. The Fas/Fas ligand pathway is important for optimal tumor regression in a mouse model of CTL adoptive immunotherapy of experimental CMS4 lung metastases. J Immunol. 171 (5), 2402-2412 (2003).
- Liu, K., Caldwell, S. A., Greeneltch, K. M., Yang, D., Abrams, S. I. CTL Adoptive Immunotherapy Concurrently Mediates Tumor Regression and Tumor Escape. J Immunol. 176 (6), 3374-3382 (2006).
- Yang, D., Stewart, T. J., Smith, K. K., Georgi, D., Abrams, S. I., Liu, K. Downregulation of IFN-gammaR in association with loss of Fas function is linked to tumor progression. International journal of cancer. 122 (2), 350-362 (2008).
- Pages, F., Berger, A., Camus, M. Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer. N Engl J Med. 353 (25), 2654-2666 (2005).
- Galon, J., Costes, A., Sanchez-Cabo, F. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science. 313 (5795), 1960-194 (2006).
- Strater, J., Hinz, U., Hasel, C. Impaired CD95 expression predisposes for recurrence in curatively resected colon carcinoma: clinical evidence for immunoselection and CD95L mediated control of minimal residual disease. Gut. 54 (5), 661-665 (2005).
- Camus, M., Tosolini, M., Mlecnik, B. Coordination of intratumoral immune reaction and human colorectal cancer recurrence. Cancer research. 69 (6), 2685-2693 (2009).
- Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Yang, J. C. Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma. J Clin Oncol. 23 (10), 2346-2357 (2005).
- Srivastava, M. K., Sinha, P., Clements, V. K., Rodriguez, P., Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T-cell activation by depleting cystine and cysteine. Cancer research. 70 (1), 68-77 (2010).
- Nagaraj, S., Gabrilovich, D. I. Tumor escape mechanism governed by myeloid-derived suppressor cells. Cancer research. 68 (8), 2561-2563 (2008).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature reviews. 9 (4), 274-284 (2009).
- Heijstek, M. W., Kranenburg, O., Rinkes, B. orel, H, I. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Digestive surgery. 22 (1-2), 1-2 (2005).
- Yang, D., Ud Din, N., Browning, D. D., Abrams, S. I., Liu, K. Targeting lymphotoxin beta receptor with tumor-specific T lymphocytes for tumor regression. Clin Cancer Res. 13 (17), 5202-5210 (2007).
- Yang, D., Thangaraju, M., Browning, D. D. IFN Regulatory Factor 8 Mediates Apoptosis in Nonhemopoietic Tumor Cells via Regulation of Fas Expression. J Immunol. 179 (7), 4775-4782 (2007).
- Yang, D., Thangaraju, M., Greeneltch, K. Repression of IFN regulatory factor 8 by DNA methylation is a molecular determinant of apoptotic resistance and metastatic phenotype in metastatic tumor cells. Cancer research. 67 (7), 3301-3309 (2007).
- Wexler, H. Accurate identification of experimental pulmonary metastases. Journal of the National Cancer Institute. 36 (4), 641-645 (1966).
