Experimentelle Metastasierung und CTL adoptiven Transfer Immuntherapie Maus-Modell

Summary

Eine experimentelle Lungenmetastasen und CTL Immuntherapie Mausmodell für die Analyse von Tumorzellen-T-Zell-Interaktion

Abstract

Experimentelle Metastasen Mausmodell ist eine einfache und dennoch physiologisch relevanten Metastasen-Modell. Die Tumorzellen werden intravenös (iv) in Maus-tail Venen gespritzt und besiedeln in der Lunge und damit, ähnlich wie die letzten Schritte der Metastasierung von Tumorzellen spontan: Überleben in der Zirkulation, Extravasation und Kolonialisierung in den distalen Organen. Aus therapeutischer Sicht ist die experimentelle Metastasierung Modell die einfachste und ideale Modell, da das Ziel der Therapien ist oft der Endpunkt der Metastasierung: etablierte metastasierten Tumor in der distalen Orgel. In diesem Modell werden Tumorzellen iv injiziert Maus Schwanzvenen und erlaubt zu kolonisieren und in der Lunge wachsen. Tumor-spezifische CTLs werden dann iv in den Metastasen tragenden Maus injiziert. Die Anzahl und Größe der Lungenmetastasen kann durch die Anzahl der Tumorzellen injiziert werden und die Zeit des Tumorwachstums gesteuert werden. Deshalb verschiedenen Stadien der Metastasierung, von minimal Metastasen zu ausgedehnter Metastasierung, werden modelliert. Lungenmetastasen werden durch die Inflation mit Tinte analysiert, so dass einfacher visueller Beobachtung und Quantifizierung.

Protocol

1. Experimentelle Metastasen Maus-Modell

1. Am Tag vor der Tumorzelle Injektionen, Saatgut ein T75 Kolben mit bis zu 1 x 10 ⁷ CMS4-Met-Zellen in 10 ml RPMI-Medium mit 10% Serum zu den schnell wachsenden Tumorzellen zu erhalten. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C.
2. Am Tag der Injektion, entfernen Sie das Medium und spülen Sie die Zellen einmal mit PBS, dann ernten die Tumorzellen mit 0,05% Trypsin-EDTA bei 37 ° C für 5 Minuten. Stoppen der Reaktion mit 10 ml RPMI-Medium mit 10% Serum. Transfer-Zellen zu einem konischen Rohr.
3. Spin down die Zellen bei 1300 rpm in einem Sorvall Legend RT Zentrifuge für 3 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren der Zellen in 10 mL frisch 1X HBSS zu waschen, dann drehen sich wieder und resuspendieren in der gleichen Weise.
4. Zählen Sie die Tumorzellen auf einer Zählkammer. Verdünnen Sie die Zellen in HBSS, so dass die Zellen bei jeder Injektion erforderlich in einem Gesamtvolumen von 100 ul resuspendiert werden.
5. Warm die 6-8 Wochen alten BALB / c-Mäusen in einem Becherglas in warmes Wasser getaucht, um die Schwanzvene erweitern. Legen Sie die Maus auf eine Schwanzvene restrainer auf der Bank. Verwenden Sie einen Mikrospritze zu 100 ul von Tumorzellen in die laterale Schwanzvene injiziert. Sie aseptisch, um Infektionen zu vermeiden. Nach der Injektion mit leichtem Druck auf die Injektionsstelle, bis die Blutung aufgehört hat.
6. Bringen Sie die Maus, um den Käfig und lassen den Tumor, um zum gewünschten Zeitpunkt zu wachsen.

2. Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) adoptiven Transfer Immuntherapie

1. Am Tag des Übergangs, Pipette auf und ab zu reinigende zytotoxischen T-Lymphozyten oder CTLs, hergestellt, wie im Text beschrieben resuspendieren. Übertragen Sie alle der Zellen von einer Platte auf eine 15 ml konischen Rohr, ließ nicht das Volumen überschreiten mehr als 2 / 3 des Rohres.
2. Legen Sie eine sterile Pasteur Pipette in die konischen Rohr und lag Lymphozyten Trennmedium oder LSM unter den Zellen, bis das Gesamtvolumen nähert 14 mL.
3. Achten Sie darauf, um die Schichten zu stören. Zentrifugation bei 2000 rpm für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Verwenden Sie nicht die Bremse, um den Rotor nach dem Schleudern langsam.
4. Übertragen Sie die CTLs zu einem neuen 15 ml konischen Rohr. Add HBSS auf ein Volumen von ca. 10 mL zu waschen.
5. Zählen Sie die Zellen. Spin down bei 1300 rpm für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Resuspendieren in HBSS auf die gewünschte Zelldichte für Injektionen, halten das Gesamtvolumen pro Injektion bei 100 ul.
6. Verwenden Sie den gleichen Schwanz Injektionstechnik wie zuvor in diesem Video die CTLs in tumortragenden Mäusen injiziert gesehen.
7. Bringen Sie die Maus, um den Käfig, und lassen Sie die CTLs mit dem Tumor zu interagieren. Mäuse sind in der Regel für die Analyse 14-21 Tage nach der CTL der Behandlung getötet.

3. Visualisierung von Lungenmetastasen

1. Zur Visualisierung Lungenmetastasen, statt eines geopferten Maus auf dem Rücken auf einer Styropor-Platte. Pin den Beinen, um einen ungehinderten Zugang zur Luftröhre zu gewährleisten. Spray der Bauchseite mit 70% Ethanol.
2. Ab der Mitte des Bauches, mit einer Schere entlang der Mittellinie geschnitten, durch den Brustkorb, und bis zu den Speicheldrüsen. Expose der Luftröhre. Verwenden einer Pinzette, um Gewebe um die Luftröhre zu entfernen.
3. Thema einem 200 ul Pipettenspitze unter der Luftröhre. Halten Sie die Spitze mit einer Hand, heben die Luftröhre nach oben und weg vom Körper.
4. Drehen Sie die Plattform 180 °. Verwenden Sie eine 50 ml Spritze mit Tusche in die Lunge injiziert über die Luftröhre. Völlig aufblasen der Lunge mit Tinte, bis Sie einen starken Widerstand spüren.
5. Mit einer Schere in die Luftröhre geschnitten. Schieben einer Pinzette unter den Lungen und heben sie aus der Maus. Spülen Sie die Lunge kurz in einer 1L Becher Wasser.
6. In einem Laborabzug, Übertragung der Lunge zu einer Glasszintillationsröhrchen mit 5 ml Fekete-Lösung. Das Tumorgewebe wird als weiße Knötchen auf der schwarzen Lunge nach wenigen Minuten entstehen. Die Tumoren können nun gezählt und gespeichert werden Fekete-Lösung auf unbestimmte Zeit.

4. Vertreter Metastasen in Lunge Visualisierte

1. Hier zeigen Lungen von Mäusen, die mit Mamma-Karzinom-Zelllinie 4T1 injiziert wurden weiße Flecken zeigt Tumoren. Mäuse, die mit 4T1-Zellen mit einem IRF8 dominant-negativen Mutante K79E transfizierten injiziert wurden, zeigen die verbesserten metastatische Potential von Tumorzellen.
2. Diese Bilder zeigen eine histologische Analyse der Wirksamkeit von CTL adoptiven Transfer Immuntherapie. Tumor-tragenden Mäusen mit Kochsalzlösung injiziert zeigten multiple Tumore 6 Tage später, angezeigt durch gelbe Pfeile (A). Mäuse mit Tumor-spezifischen T-Zellen injiziert, auf der anderen Seite, zeigten eine Reduktion von Tumoren (B).
3. In das gleiche Experiment, gibt Tusche Behandlung einen einfacheren Weg, um die Wirksamkeit von CTL adoptiven Transfer zu messen. Hier die weiße Tumorknötchen auf tumortragenden Lunge deutlich von Lunge, die erfolgreich CTL adoptiven Transfer erfahren haben, und das Zählen der Knoten ermöglicht einen Gradder Quantifizierung nicht möglich mit der Histologie.

5. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. Experimental System für den experimentellen Metastasierung und CTL adaptive Transfer Immuntherapie Mausmodell. Rote Punkte zeigen, Tumorzellen und grüne Punkte zeigen CTLs.

Abbildung 2. Unterbrechung der IRF8 Funktion verbessert die metastatische Potential von Tumorzellen. Maus Mammakarzinom-Zelllinie 4T1 wurde stabil mit dem Vektor (4T1.Vector) oder Vektor-Ausdruck einer IRF8 dominant-negativen Mutante K79E (4T1.IRF8K79E) (15, 16) transfiziert. Tumorzellen wurden iv injiziert Maus seitliche Schwanzvene. Tumor-tragende Lungen wurden mit Tusche aufgeblasen, um Tumorknoten zu visualisieren. Tumorknoten sind leicht als weiße Flecken auf der schwarzen Lungengewebes Hintergrund zu sehen.

Abbildung 3. Histologische Analyse der Wirksamkeit von CTL adoptiven Transfer Immuntherapie. Maus-Sarkom-Zelllinie CMS4-Met wurde iv in Maus-laterale Schwanzvene injiziert. Drei Tage später wurden Kochsalzlösung (A) oder Tumor-spezifischer T-Zellen (B) in den Tumor-tragenden Mäusen injiziert. Lungen wurden sechs Tage nach der CTL der Behandlung mit konventionellen H & E histologischen Färbung analysiert. Tumorknoten sind durch Pfeile angedeutet.

Abbildung 4. Visualisierung von Tumorknoten von Tusche Inflation. Maus-Sarkom-Zelllinie CMS4-Met wurde iv in Maus-laterale Schwanzvene injiziert. Drei Tage später wurden Kochsalzlösung (Control) oder Tumor-spezifischer T-Zellen (+ CTL) in den Tumor-tragenden Mäusen injiziert. Lungen wurden 14 Tage nach der CTL-Behandlung untersucht. Die weißen Flecken, die Tumorknoten sind, ermöglichen eine einfache Quantifizierung der Wirksamkeit von CTL Behandlung.

Materials

Solutions:

India Ink Solution (17):

Pour 150 ml of distilled water into a 250 ml flask. Add 4 drops ammonium hydroxide to the distilled water. Add 30 ml India Ink stock (i.e. Sanford Black Magic Waterproof Drawing Ink 4465 Item 44011) to the ammonia and water mixture. Top off with distilled water to a volume of 200 ml. Solution is ready for injection.

Fekete's Solution (17):

Fekete's solution is used to bleach India ink-inflated tumor-bearing lungs to distinguish white tumor nodules from the black background of normal tissues.

Add 350ml 95% EtOH to 1L glass bottle. Add 150ml distilled water Add 50ml formaldehyde Add 25ml glacial acidic acid