Summary
एक प्रयोगात्मक फेफड़ों मेटास्टेसिस और ट्यूमर कोशिकाओं टी सेल बातचीत के विश्लेषण के लिए सीटीएल immunotherapy के माउस मॉडल
Abstract
प्रायोगिक मेटास्टेसिस माउस मॉडल एक सरल और अभी तक physiologically प्रासंगिक मेटास्टेसिस मॉडल है. ट्यूमर कोशिकाओं को इंजेक्शन नसों हैं (iv) माउस पूंछ नसों में और फेफड़ों में उपनिवेश, जिससे ट्यूमर कोशिका सहज मेटास्टेसिस के अंतिम चरणों जैसी: परिसंचरण, और बाहर का अंगों में extravasation उपनिवेशन में अस्तित्व. को देखने के एक चिकित्सकीय बिंदु से, प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस मॉडल सरल और आदर्श मॉडल है के बाद से उपचार के लक्ष्य अक्सर मेटास्टेसिस के अंत बिंदु है: बाहर का अंग में स्थापित metastatic ट्यूमर. Iv इस मॉडल में, ट्यूमर कोशिकाओं माउस पूंछ नसों में इंजेक्शन हैं और उपनिवेश और फेफड़ों में बढ़ने की अनुमति दी. ट्यूमर के विशिष्ट CTLs तो metastases के असर माउस में चार इंजेक्शन. संख्या और फेफड़ों metastases के आकार के ट्यूमर इंजेक्शन जा कोशिकाओं और ट्यूमर के विकास के समय की संख्या के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. इसलिए, मेटास्टेसिस के विभिन्न चरणों, व्यापक मेटास्टेसिस के लिए न्यूनतम मेटास्टेसिस से, मॉडलिंग किया जा सकता है. फेफड़े metastases स्याही के साथ मुद्रास्फीति से विश्लेषण कर रहे हैं, इस प्रकार आसान दृश्य प्रेक्षण और मात्रा का ठहराव की अनुमति.
Protocol
1. प्रायोगिक मेटास्टेसिस माउस मॉडल
- जिस दिन पहले ट्यूमर सेल इंजेक्शन, एक T75 बीज 1 करने के लिए साथ फ्लास्क 10 x 7 CMS4 मौसम RPMI मध्यम युक्त 10% के लिए तेजी से बढ़ रही ट्यूमर कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए सीरम के 10 एमएल में कोशिकाओं. 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस
- इंजेक्शन के दिन, मध्यम हटाने और कोशिकाओं पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला, तो 37 में 0.05% trypsin - EDTA के साथ ट्यूमर कोशिकाओं ° 5 मिनट के लिए सी फसल. RPMI मध्यम युक्त 10% सीरम के 10 एमएल के साथ प्रतिक्रिया बंद करो. एक चोटीदार ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण.
- नीचे कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 1300 rpm पर एक Sorvall लीजेंड आरटी अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं स्पिन. सतह पर तैरनेवाला निकालें. 10 एमएल ताजा 1X HBSS धोने में कोशिकाओं Resuspend, तो फिर नीचे स्पिन और एक ही तरीके से resuspend.
- Hemocytometer पर ट्यूमर कोशिकाओं को गिन लो. HBSS में कोशिकाओं पतला, ताकि प्रत्येक इंजेक्शन के लिए आवश्यक कोशिकाओं 100 μL की कुल मात्रा में resuspended हैं.
- गर्म एक गर्म पानी में डूब पूंछ नस को चौड़ा करना बीकर में 6-8 सप्ताह पुराने BALB / ग चूहों. बेंच पर एक पूंछ नस restrainer पर माउस रखें. एक microsyringe का प्रयोग करें पार्श्व पूंछ नस में ट्यूमर कोशिकाओं के 100 μL इंजेक्षन. सड़न रोकनेवाला तकनीक का प्रयोग करने के लिए संक्रमण से बचने के. इंजेक्शन के बाद, इंजेक्शन साइट पर थोड़ा दबाव लागू होते हैं जब तक खून बह रहा बंद कर दिया है.
- पिंजरे के लिए माउस को लौटें, और ट्यूमर इच्छित चरण के लिए विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं.
2. साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट (सीटीएल) दत्तक स्थानांतरण Immunotherapy
- हस्तांतरण के दिन पर, पिपेट और नीचे शुद्ध टी - लिम्फोसाइटों साइटोटोक्सिक, या CTLs, पाठ में वर्णित के रूप में तैयार resuspend. एक थाली से कोशिकाओं के सभी 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब, स्थानांतरण दे मात्रा अधिक ट्यूब के 2 / 3 से अधिक नहीं.
- शंक्वाकार ट्यूब में एक बाँझ पाश्चर विंदुक डालें और लिम्फोसाइट पृथक्करण मध्यम, या एल एस एम रखना, कोशिकाओं के तहत जब तक कुल मात्रा 14 एमएल nears.
- परतों को परेशान नहीं करने के लिए सावधान रहें. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 2000 rpm पर अपकेंद्रित्र. ब्रेक का उपयोग करने के लिए कताई के बाद रोटर धीमी गति से मत करो.
- एक नया 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब CTLs स्थानांतरण. लगभग 10 एमएल की एक मात्रा के लिए HBSS जोड़ें धोने के लिए.
- कोशिकाओं की गणना. नीचे कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 1300 rpm पर स्पिन. इंजेक्शन के लिए आवश्यक सेल घनत्व HBSS में Resuspend, 100 μL पर इंजेक्शन के अनुसार कुल मात्रा रखते हुए.
- एक ही पूंछ इंजेक्शन तकनीक का उपयोग के रूप में इस वीडियो में पहले देखा ट्यूमर असर चूहों में CTLs इंजेक्षन.
- पिंजरे के लिए माउस को लौटें, और CTLs ट्यूमर के साथ बातचीत करने के लिए अनुमति देते हैं. चूहे आमतौर पर 14-21 दिनों सीटीएल उपचार के बाद विश्लेषण के लिए बलिदान कर रहे हैं.
3. फेफड़े metastases के विज़ुअलाइज़ेशन
- फेफड़ों मेटास्टेसिस कल्पना, एक स्टायरोफोम बोर्ड पर अपनी पीठ पर एक बलिदान माउस जगह है. पिन पैर ट्रेकिआ के लिए unobstructed का उपयोग सुनिश्चित. 70% इथेनॉल के साथ उदर पक्ष स्प्रे.
- मध्य पेट से शुरू, कैंची उपयोग midline साथ कटौती, ribcage के माध्यम से, और लार की गिल्टी की ओर. ट्रेकिआ बेनकाब. संदंश का प्रयोग करें ट्रेकिआ आसपास के ऊतकों को हटाने.
- 200 ट्रेकिआ नीचे μL विंदुक टिप थ्रेड. एक हाथ से होल्डिंग टिप, धीरे ट्रेकिआ उठा और शरीर से दूर.
- 180 मंच घुमाएँ °. एक 50 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग फेफड़ों में ट्रेकिआ के माध्यम से भारत इंक इंजेक्षन. पूरी तरह से स्याही के साथ फेफड़ों बढ़ जब तक आप एक मजबूत प्रतिरोध लग रहा है.
- कैंची का उपयोग करने के ट्रेकिआ में कटौती. फेफड़ों के तहत संदंश की एक जोड़ी स्लाइड और उन्हें लिफ्ट माउस के बाहर. पानी की एक 1L बीकर में फेफड़ों संक्षिप्त कुल्ला.
- एक रासायनिक धूआं हुड में, एक गिलास जगमगाहट Fekete समाधान के 5 एमएल युक्त शीशी फेफड़ों हस्तांतरण. ट्यूमर ऊतक काले फेफड़ों पर सफेद पिंड के रूप में कुछ ही मिनटों के बाद उभरेगा. ट्यूमर अब और गिना जा सकता है Fekete अनिश्चित काल के समाधान में संग्रहीत है.
4. कल्पना फेफड़े में प्रतिनिधि Metastases
- यहाँ, कि स्तन कार्सिनोमा सेल लाइन 4T1 के साथ अंतःक्षिप्त थे चूहों से फेफड़ों सफेद ट्यूमर संकेत स्पॉट दिखाओ. चूहों कि 4T1 एक IRF8 प्रमुख नकारात्मक उत्परिवर्ती K79E के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के साथ अंतःक्षिप्त थे बढ़ाया ट्यूमर कोशिकाओं के metastatic क्षमता दिखाते हैं.
- इन छवियों सीटीएल दत्तक हस्तांतरण immunotherapy की प्रभावकारिता की एक histological विश्लेषण दिखाते हैं. ट्यूमर असर नमक के साथ चूहों अंतःक्षिप्त कई ट्यूमर 6 दिन बाद में पता चला है, पीले तीर (ए) ने संकेत दिया है. ट्यूमर विशेष टी कोशिकाओं के साथ चूहों अंतःक्षिप्त, दूसरे हाथ पर, ट्यूमर (बी) की कमी देखी गई.
- एक ही प्रयोग में, भारत स्याही उपचार सीटीएल दत्तक हस्तांतरण के प्रभाव को मापने के लिए एक सरल तरीका देता है. यहाँ, ट्यूमर असर फेफड़ों पर सफेद ट्यूमर पिंड स्पष्ट रूप से उन्हें फेफड़ों कि सफलतापूर्वक सीटीएल दत्तक हस्तांतरण आया है, और गिनती पिंड से अलग एक डिग्री के लिए अनुमति देता हैऊतक विज्ञान के साथ quantitation के संभव नहीं है.
5. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 प्रयोगात्मक ट्यूमर मेटास्टेसिस और सीटीएल अनुकूली हस्तांतरण immunotherapy के माउस मॉडल के लिए प्रायोगिक योजना . लाल डॉट्स से संकेत मिलता है कि ट्यूमर कोशिकाओं और हरे रंग की डॉट्स CTLs संकेत मिलता है.
चित्रा 2 IRF8 समारोह के विघटन ट्यूमर कोशिकाओं के metastatic क्षमता को बढ़ाया . माउस स्तन कार्सिनोमा सेल लाइन 4T1 stably (4T1.Vector) वेक्टर या सदिश एक प्रमुख नकारात्मक IRF8 उत्परिवर्ती (4T1.IRF8K79E) K79E (15, 16) व्यक्त के साथ ट्रांसफ़ेक्ट था. ट्यूमर कोशिकाओं iv माउस पार्श्व पूंछ नसों में इंजेक्शन थे. ट्यूमर असर फेफड़ों भारत स्याही के साथ फुलाया थे ट्यूमर पिंड की कल्पना कर सकते हैं. ट्यूमर पिंड आसानी से काले फेफड़े के ऊतकों की पृष्ठभूमि पर सफेद धब्बे के रूप में देखा जाता है.
चित्रा 3 सीटीएल दत्तक हस्तांतरण immunotherapy की प्रभावकारिता के histological विश्लेषण. माउस सार्कोमा सेल लाइन CMS4 - मेट iv माउस पार्श्व पूंछ नसों में इंजेक्ट किया गया था. तीन दिन बाद, खारा (ए) या ट्यूमर विशेष टी कोशिकाओं (बी) ट्यूमर असर चूहों में इंजेक्ट किया गया. फेफड़े पारंपरिक एच एंड ई histological धुंधला द्वारा सीटीएल उपचार के बाद छह दिनों विश्लेषण किया गया. ट्यूमर पिंड तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं.
चित्रा 4 भारत स्याही मुद्रास्फीति द्वारा ट्यूमर पिंड के विज़ुअलाइज़ेशन. माउस सार्कोमा सेल लाइन CMS4 - मेट iv माउस पार्श्व पूंछ नसों में इंजेक्ट किया गया था. तीन दिन बाद, खारा (नियंत्रण) या ट्यूमर विशेष टी कोशिकाओं (सीटीएल +) ट्यूमर असर चूहों में इंजेक्ट किया गया. फेफड़े चौदह दिन सीटीएल उपचार के बाद विश्लेषण किया गया. सफेद धब्बे, जो ट्यूमर पिंड हैं सीटीएल उपचार की प्रभावकारिता का आसान मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देते हैं.
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Disclosures
चूहे राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (Friderick एमडी) से खरीदे गए थे और जॉर्जिया पशु सुविधा के मेडिकल कॉलेज में रखे. प्रयोगों और / देखभाल और कल्याण संघीय नियमों के साथ समझौते और जॉर्जिया IACUC समिति के मेडिकल कॉलेज द्वारा एक अनुमोदित प्रोटोकॉल में थे.
Acknowledgments
अनुदान से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के (CA133085 के.एल.) और अमेरिकन कैंसर सोसायटी (के.एल. RSG-09-209-01-TBG) द्वारा समर्थित है.
Materials
Solutions: |
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India Ink Solution (17): |
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Fekete's Solution (17): |
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Fekete's solution is used to bleach India ink-inflated tumor-bearing lungs to distinguish white tumor nodules from the black background of normal tissues. |
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References
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