実験的転移とCTLの養子移入免疫療法のマウスモデル

Summary

腫瘍細胞- T細胞相互作用の分析のための実験的肺転移とCTL免疫療法のマウスモデル

Abstract

実験的転移のマウスモデルは、生理学的に関連はまだシンプルと転移モデルです。循環の生存率、遠位臓器の血管外漏出と植民地化：腫瘍細胞は腫瘍細胞自然転移の最後のステップに似て、それによって、マウスの尾静脈に（IV）静脈内に注射し、肺に植民地化されています。遠位臓器で確立された転移性腫瘍：治療の目標はしばしば転移のエンドポイントであるので、治療的観点から、実験的転移モデルは最も単純で理想的なモデルです。このモデルでは、腫瘍細胞は、マウスの尾静脈に静脈注射し、肺に植民地化と拡張されます。腫瘍特異的CTLは、その後、転移、担癌マウスに静脈注射されています。肺転移の数と大きさが注入される腫瘍細胞の数と腫瘍の成長の時間によって制御することができます。したがって、転移の様々な段階では、広範な転移への最小限の転移から、モデル化することができます。肺転移は、このように簡単に目視観察および定量を可能に、インクでインフレによって分析されています。

Protocol

1。実験的転移モデルマウス

1. 腫瘍細胞の注射の前日に、シードone T75フラスコ上で1 × 10 ^7〜急成長中の腫瘍細胞を得るために、10％血清を含むRPMI培地10mLに細胞をCMS4 - MET。 37℃で一晩インキュベート℃、
2. 注射の日に、培地を除去し、PBSで細胞を1回洗い流した後、37℃で0.05％トリプシン- EDTAで腫瘍細胞を収穫℃で5分間。 10％血清を含むRPMI培地10mlで反応を停止します。コニカルチューブに細胞を移す。
3. 室温で3分間ソーバルレジェンドRT遠心機で1300 rpmで細胞をスピンダウン。上清を取り除く。洗浄に10mLの新鮮な1X HBSSで細胞を再懸濁し、再度スピンダウンと同じように再懸濁します。
4. 血球計算板上で腫瘍細胞を数える。それぞれの注入に必要な細胞を100μLの全体積に再懸濁しているように、HBSSで細胞を希釈する。
5. 尾静脈を拡張させるために温水に浸漬ビーカーに6〜8週齢のBALB / cマウスを温める。ベンチ上で尾静脈の現像抑制剤の上にマウスを置きます。外側尾静脈内に腫瘍細胞を100μLを注入するためにマイクロシリンジを使用してください。感染を避けるために、無菌操作を使用してください。出血が停止するまで注入した後、注射部位にわずかな圧力を適用する。
6. ケージにマウスを返し、そして腫瘍が目的の段階に成長することができます。

2。細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の養子移入免疫療法

1. 移転の日に、精製されたT -リンパ球細胞傷害性、またはCTLは、テキストで説明したように調製を再懸濁するために上下にピペッティングし。つのプレートから15 mLコニカルチューブに細胞のすべてを譲渡する、ボリュームがチューブの2 / 3以上を超えてさせることではない。
2. コニカルチューブに滅菌パスツールピペットを挿入し、総容量は14 mLのに近づくまで、セルの下に、リンパ球分離媒体、またはLSMを置く。
3. 層を乱さないように注意してください。室温で20分間2000rpmで遠心する。スピンした後ローターを減速させるブレーキを使用しないでください。
4. 新しい15 mLコニカルチューブにCTLを転送する。洗浄に約10mlの体積にHBSSを追加。
5. 細胞を数える。室温で5分間1300 rpmでスピンダウン。 100μLに注入あたりの​​総容積を保ち、注射のために必要な細胞密度にHBSSに再懸濁します。
6. 担癌マウスにCTLを注入する前のこのビデオで見たのと同じテールのインジェクションの手法を使用してください。
7. ケージにマウスを返す、とCTLsは腫瘍と対話することができます。マウスは、通常14-21日CTL治療後の分析のために犠牲にされています。

3。肺転移の可視化

1. 肺転移を可視化するために、発泡スチロールのボードに、その裏に犠牲にマウスを置きます。気管に遮るもののないアクセスを確保するために足を固定。 70％エタノールで腹側を吹き付けます。
2. 半ば腹部から始まる、正中線に沿って、胸郭を介して、とまで唾液腺に向かってカットするはさみを使用してください。気管を公開。気管の周囲の組織を削除するには、ピンセットを使用してください。
3. 気管の下に200μLピペットの先端を通します。片手で先端を保持する、静かに体から気管を持ち上げて。
4. プラットフォームを180 °回転させる。気管から肺にインドのインクを注入するために50mLのシリンジを使用してください。あなたが強い抵抗を感じるまで、完全にインクで肺を膨らませる。
5. 気管をカットするはさみを使用してください。肺の下にピンセットをスライドさせ、それらをマウスから持ち上げます。水の1Lビーカーに簡単に肺をすすいでください。
6. 化学煙フードでは、フェケテの液5 mLを含有するガラスシンチレーションバイアルに肺を転送する。腫瘍組織は、数分後に黒の肺に白い結節として現れるだろう。腫瘍は、現在カウントし、無期限にフェケテのソリューションに格納することができます。

4。視覚による肺の代表的な転移

1. ここでは、乳癌細胞株4T1を注入したマウスからの肺には腫瘍を示す白い斑点を示す。 IRF8ドミナントネガティブ変異体K79Eでトランスフェクトした4T1細胞を注入したマウスは、腫瘍細胞の拡張された転移能を示す。
2. これらのイメージは、CTLの養子移入免疫療法の有効性の組織学的分析を示しています。生理食塩水を注射した担癌マウスでは、黄色の矢印（）で示される、6日後に複数の腫瘍を認めた。腫瘍特異的T細胞を注射したマウスは、その一方で、腫瘍（B）の減少を示した。
3. 同じ実験では、インドのインクの治療は、CTL養子免疫伝達の有効性を測定する簡単な方法を提供します。ここでは、担癌肺の白い腫瘍結節は、明らかに成功したCTLの養子移入を受けた肺からそれらを区別し、結節を数える度を可能に組織学と定量の可能性ではない。

5。代表的な結果

図1実験的な腫瘍転移およびCTL適応転送免疫療法のマウスモデルの実験スキーム。赤い点は、腫瘍細胞と緑のドットはCTLを示して示している。

図2。IRF8機能の破壊は、腫瘍細胞の転移能を増強した。マウス乳癌細胞株4T1は安定してベクトル（4T1.Vector）またはIRF8ドミナントネガティブ変異体K79E（4T1.IRF8K79E）（15,16）を発現ベクターでトランスフェクトした。腫瘍細胞は、マウスの外側尾静脈に静脈注射された。腫瘍のある肺は腫瘍結節を視覚化するインドのインクで膨らませていた。腫瘍結節は、簡単に黒の肺組織の背景に白い斑点として見られている。

図3。CTLの養子移入免疫療法の有効性の組織学的分析。マウス肉腫細胞株CMS4 - Metはマウス側面尾静脈に静脈注射した。三日後、生理食塩水（）または腫瘍特異的T細胞は、（B）担癌マウスに注入した。肺は6日、従来のH＆E組織染色により、CTL治療後に分析した。腫瘍結節は、矢印で示されている。

図4。水墨インフレによる腫瘍結節の可視化。マウス肉腫細胞株CMS4 - Metはマウス側面尾静脈に静脈注射した。三日後、生理食塩水（コントロール）または腫瘍特異的T細胞は、（+ CTL）担癌マウスに注入した。肺は14日CTL治療後に分析した。腫瘍結節ている白い点は、、CTL治療の有効性を簡単に定量化が可能になります。

Materials

Solutions:

India Ink Solution (17):

Pour 150 ml of distilled water into a 250 ml flask. Add 4 drops ammonium hydroxide to the distilled water. Add 30 ml India Ink stock (i.e. Sanford Black Magic Waterproof Drawing Ink 4465 Item 44011) to the ammonia and water mixture. Top off with distilled water to a volume of 200 ml. Solution is ready for injection.

Fekete's Solution (17):

Fekete's solution is used to bleach India ink-inflated tumor-bearing lungs to distinguish white tumor nodules from the black background of normal tissues.

Add 350ml 95% EtOH to 1L glass bottle. Add 150ml distilled water Add 50ml formaldehyde Add 25ml glacial acidic acid