La metástasis experimentales y CTL Modelo inmunoterapia adoptiva de transferencia de ratón

Summary

Una metástasis de pulmón y el modelo experimental de ratón para CTL inmunoterapia análisis de la interacción de las células tumorales las células-T

Abstract

Modelo experimental de ratón metástasis es un modelo de metástasis simple y fisiológicamente relevantes. Las células tumorales se inyectan por vía intravenosa (iv) en las venas de la cola de ratón y colonizar en los pulmones, por lo tanto, semejante a los últimos pasos de la metástasis de células tumorales espontáneas: la supervivencia en la circulación, la extravasación y la colonización en los órganos distales. Desde el punto de vista terapéutico, el modelo experimental de metástasis es el modelo más simple y es ideal ya que el objetivo de las terapias es a menudo el punto final de la metástasis: tumor metastásico establecido en el órgano distal. En este modelo, las células tumorales se inyectan en las venas iv cola de ratón y se deja colonizar y crecer en los pulmones. Tumor-específica CTL se inyecta vía intravenosa en el ratón portador de metástasis. El número y tamaño de las metástasis pulmonares pueden ser controlados por el número de células tumorales a inyectar y el tiempo de crecimiento del tumor. Por lo tanto, las distintas etapas de la metástasis, las metástasis mínima a la metástasis extensa, se puede modelar. Las metástasis pulmonares son analizados por la inflación con la tinta, permitiendo así más fácil la observación visual y la cuantificación.

Protocol

1. Metástasis modelo experimental de ratón

1. El día antes de la inyección de células tumorales, las semillas de un frasco T75 con un máximo de 1 x 10 ⁷ CMS4-Met células en 10 ml de medio RPMI con 10% de suero para obtener rápido crecimiento de las células tumorales. Incubar toda la noche a 37 ° C.
2. En el día de la inyección, se elimina el medio y lavar las células una vez con PBS, luego de la cosecha de las células tumorales con el 0,05% de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 5 minutos. Detener la reacción con 10 ml de medio RPMI con 10% de suero. La transferencia de células a un tubo cónico.
3. Centrifugar las células a 1300 rpm en una centrífuga Sorvall Legend TA durante 3 minutos a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante. Resuspender las células en 10 ml de 1X HBSS fresca para lavar, y luego girar de nuevo y volver a suspender la misma manera.
4. Contar con las células tumorales en un hemocitómetro. Diluir las células en HBSS, para que las células necesarias para cada inyección se resuspenden en un volumen total de 100 mL.
5. Caliente las 6-8 semanas de edad ratones Balb / c en un vaso sumergido en agua caliente para dilatar la vena de la cola. Coloque el ratón sobre un limitador de vena de la cola en el banco. El uso de una microjeringa para inyectar 100 L de células tumorales en la vena lateral de la cola. Utilice una técnica aséptica para evitar la infección. Después de la inyección, aplicar una ligera presión al sitio de la inyección hasta que la hemorragia se ha detenido.
6. Devolver el ratón de la jaula, y permitir el crecimiento del tumor a la etapa deseada.

2. Los linfocitos T citotóxicos (CTL) Inmunoterapia transferencia adoptiva

1. En el día de la transferencia, la pipeta hacia arriba y abajo para volver a suspender citotóxica de los linfocitos T purificados, o CTL, preparado como se describe en el texto. La transferencia de todas las células de una placa a un tubo cónico de 15 ml, no dejar que el volumen exceda de más de 2 / 3 del tubo.
2. Inserte una pipeta Pasteur estéril en el tubo cónico y laicos medio de separación de linfocitos, o LSM, en las células hasta que el volumen total se acerca a 14 ml.
3. Tenga cuidado de no molestar a las capas. Centrifugar a 2000 rpm durante 20 minutos a temperatura ambiente. No use el freno para frenar el rotor tras hacer un trompo.
4. Transferir el CTL para un nuevo tubo de 15 mL cónico. Añadir HBSS a un volumen de aproximadamente 10 ml de lavar.
5. Contar las células. Centrifugar a 1300 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Volver a suspender en HBSS a la densidad celular necesaria para la inyección, manteniendo el volumen total por la inyección de 100 mL.
6. Utilice la técnica de inyección de cola igual que vimos anteriormente en este vídeo para inyectar el CTL en ratones portadores de tumores.
7. Devolver el ratón de la jaula, y permitir que el CTL para interactuar con el tumor. Los ratones suelen ser sacrificados para el análisis de 14-21 días después del tratamiento CTL.

3. Visualización de las metástasis pulmonares

1. Para visualizar las metástasis pulmonares, lugar de un ratón sacrificado en su parte posterior en una tabla de espuma de poliestireno. Pin de las piernas para garantizar el acceso sin obstáculos a la tráquea. Rocíe la parte ventral con el 70% de etanol.
2. A partir de la mitad del abdomen, use tijeras para cortar a lo largo de la línea media, a través de la caja torácica, y hasta a las glándulas salivales. Exponer la tráquea. El uso de fórceps para extraer los tejidos que rodean la tráquea.
3. Enhebrar una punta de pipeta 200 l por debajo de la tráquea. Sujetando la punta con una mano, levante suavemente la tráquea y del cuerpo.
4. Gire la plataforma 180 º. Use una jeringa de 50 ml para inyectar tinta china en los pulmones a través de la tráquea. Inflar los pulmones por completo con tinta hasta que sienta una fuerte resistencia.
5. Use las tijeras para cortar la tráquea. Deslizar un par de pinzas en los pulmones y sacarlos del ratón. Enjuague los pulmones brevemente en un vaso de 1 litro de agua.
6. En una cabina de humos química, la transferencia de los pulmones a un vial de centelleo de vidrio que contiene 5 ml de solución de Fekete. El tejido del tumor va a surgir como nódulos blancos en los pulmones negro después de unos minutos. Los tumores pueden ahora ser contados y almacenados en una solución de Fekete de forma indefinida.

4. Las metástasis en los pulmones representante visualizados

1. Aquí, los pulmones de los ratones que fueron inyectados con carcinoma mamario 4T1 línea celular muestran manchas blancas que indican los tumores. Los ratones que fueron inyectados con células 4T1 transfectadas con un IRF8 dominante negativo K79E mutantes muestran el mayor potencial metastásico de las células tumorales.
2. Estas imágenes muestran un análisis histológico de la eficacia de la inmunoterapia CTL transferencia adoptiva. Portadores de tumores de ratones inyectados con solución salina mostró múltiples tumores 6 días más tarde, indicado por las flechas amarillas (A). Los ratones inyectados con células T específicas del tumor, por su parte, mostró una reducción de los tumores (B).
3. En el mismo experimento, el tratamiento de la tinta china ofrece una manera más sencilla de medir la eficacia de la transferencia adoptiva CTL. Aquí, los nódulos tumorales en blanco con tumores pulmones distinguirlos claramente de los pulmones que han superado con éxito la transferencia adoptiva CTL, y contando los nódulos permite un gradode cuantificación no es posible con la histología.

5. Resultados representante

Figura 1. Plan experimental para la metástasis de tumores experimentales y la transferencia de adaptación CTL modelo murino de inmunoterapia. Los puntos rojos indican las células tumorales y puntos verdes indican CTL.

Figura 2. La alteración de la función IRF8 aumentado el potencial metastásico de las células tumorales. Carcinoma mamario de ratón 4T1 línea celular se transfectadas establemente con el vector (4T1.Vector) o vector de expresión de un IRF8 dominante negativo mutante K79E (4T1.IRF8K79E) (15, 16). Las células tumorales se inyectaron en las venas iv lateral de la cola del ratón. Portadores del tumor pulmones se inflaron con tinta china para visualizar los nódulos tumorales. Nódulos tumorales son fácilmente visibles como manchas blancas sobre el fondo negro del tejido pulmonar.

Figura 3. El análisis histológico de eficacia de la inmunoterapia CTL transferencia adoptiva. Sarcoma de ratón línea celular CMS4-Met fue inyectado en las venas del ratón iv lateral de la cola. Tres días más tarde, la solución salina (A) o un tumor específico de células T (B) se inyectaron en los ratones portadores de tumores. Los pulmones se analizaron seis días después del tratamiento CTL mediante la tinción H & E convencional histológico. Nódulos tumorales se indican con flechas.

Figura 4. Visualización de los nódulos tumorales por la inflación tinta china. Sarcoma de ratón línea celular CMS4-Met fue inyectado en las venas del ratón iv lateral de la cola. Tres días más tarde, la solución salina (control) o un tumor específico de células T (+ CTL) fueron inyectadas en los ratones portadores de tumores. Los pulmones se analizaron catorce días después del tratamiento CTL. Las manchas blancas, que son los nódulos tumorales, permite una sencilla cuantificación de la eficacia del tratamiento CTL.

Materials

Solutions:

India Ink Solution (17):

Pour 150 ml of distilled water into a 250 ml flask. Add 4 drops ammonium hydroxide to the distilled water. Add 30 ml India Ink stock (i.e. Sanford Black Magic Waterproof Drawing Ink 4465 Item 44011) to the ammonia and water mixture. Top off with distilled water to a volume of 200 ml. Solution is ready for injection.

Fekete's Solution (17):

Fekete's solution is used to bleach India ink-inflated tumor-bearing lungs to distinguish white tumor nodules from the black background of normal tissues.

Add 350ml 95% EtOH to 1L glass bottle. Add 150ml distilled water Add 50ml formaldehyde Add 25ml glacial acidic acid