Experimentell Metastas och CTL adoptiv transfer Immunterapi musmodell

Summary

En experimentell lungmetastaser och CTL immunterapi musmodell för analys av tumörceller-T-cell interaktion

Abstract

Experimentell metastaser musmodell är en enkel och ändå fysiologiskt relevanta metastaser modell. Tumörcellerna injiceras intravenöst (iv) i vener mus svans och kolonisera i lungorna, vilket, som liknar de sista stegen i tumörcellen spontana metastaser: överlevnad i cirkulationen, extravasering och kolonisation i distala organ. Från en terapeutisk synvinkel är den experimentella metastas modellen enklaste och ideala modellen eftersom målet av terapier är ofta slutpunkten för metastas: etablerade metastaserande tumör i distala orgel. I denna modell är tumörcellerna injiceras iv i mus svans vener och tillåtas att kolonisera och växa i lungorna. Tumör-specifik CTL sedan injiceras iv i metastaser bärande mus. Antalet och storleken på lungmetastaser kan styras av antalet tumörceller som ska injiceras och tidpunkten för tumörtillväxt. Därför är olika stadier av metastaser, från minimal metastaser till omfattande metastasering, kan modelleras. Lungmetastaser analyseras genom inflation med bläck, vilket gör det lättare att visuell observation och kvantifiering.

Protocol

1. Experimentell Metastas musmodell

1. Dagen innan tumörceller injektioner, utsäde en T75 kolv med upp till 1 x 10 ⁷ CMS4-Met celler i 10 ml RPMI medium som innehåller 10% serum för att få snabbväxande tumörceller. Inkubera över natten vid 37 ° C.
2. På dagen för injektionen, ta bort mediet och skölj cellerna en gång med PBS, sedan skörda tumörceller med 0,05% trypsin-EDTA vid 37 ° C i 5 minuter. Stoppa reaktionen med 10 ml RPMI medium som innehåller 10% serum. Överför celler till ett koniskt rör.
3. Snurra ned cellerna vid 1300 rpm i en Sorvall Legend RT centrifug i 3 minuter vid rumstemperatur. Avlägsna supernatanten. Resuspendera cellerna i 10 ml färsk 1X HBSS att tvätta, sedan snurra ner igen och återsuspendera på samma sätt.
4. Räkna tumörceller på en hemocytometer. Späd cellerna i HBSS, så att cellerna som krävs för varje injektion är suspenderade i en total volym på 100 mikroliter.
5. Värm 6-8 veckor gamla BALB / c möss i en bägare nedsänkt i varmt vatten för att vidga svansvenen. Placera musen på en svansvenen restrainer på bänken. Använd en mikrospruta att injicera 100 mikroliter av tumörceller i den laterala svansvenen. Använd aseptisk teknik för att undvika infektion. Efter injektion, applicera lätt tryck på injektionsstället tills blödningen har slutat.
6. Återgå musen till buren, och låt tumören att växa till önskad scen.

2. Cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) adoptiv transfer Immunterapi

1. På dagen för överlåtelsen, pipettera upp och ned för resuspendera renade cytotoxiska T-lymfocyter, eller CTL, beredda som beskrivs i texten. Överför alla celler från en tallrik till en 15 ml koniska rör, inte låta volymen överstiga mer än 2 / 3 av röret.
2. Sätt i en steril pasteurpipett i den koniska röret och lägga Lymphocyte Separation Medium eller LSM, enligt cellerna tills den totala volymen närmar sig 14 ml.
3. Var noga med att inte störa lager. Centrifugera vid 2000 rpm i 20 minuter i rumstemperatur. Använd inte bromsen för att bromsa rotorn efter spinning.
4. Överför CTL till ett nytt 15 ml koniska rör. Lägg HBSS till en volym av ca 10 ml för att tvätta.
5. Räkna celler. Spin ner på 1300 rpm i 5 minuter i rumstemperatur. Resuspendera i HBSS till den önskade cellen densitet för injektioner, hålla den totala volymen per injektion på 100 mikroliter.
6. Använd samma teknik svansen injektion som sett tidigare i den här videon för att injicera CTL till tumör-bärande möss.
7. Återgå musen till buren, och låt CTL att interagera med tumören. Möss är oftast offras för analys 14-21 dagar efter CTL behandling.

3. Visualisering av lungmetastaser

1. Att visualisera lungmetastaser, placera en offrade musen på rygg på en frigolit ombord. Nåla fast benen för att garantera obehindrad tillgång till luftstrupen. Spraya ventrala sidan med 70% etanol.
2. Från mitten av buken, använd sax för att klippa längs mittlinjen, genom bröstkorgen, och upp mot spottkörtlarna. Exponera luftstrupen. Använd pincett för att ta bort vävnad som omger luftstrupen.
3. Trä på en 200 mikroliter pipettspets under luftstrupen. Håll spetsen med en hand, försiktigt lyfta luftstrupen uppåt och bort från kroppen.
4. Rotera plattformen 180 °. Använd en 50 ml spruta för att injicera tusch in i lungorna via luftstrupen. Helt blåsa lungorna med bläck tills du känner ett starkt motstånd.
5. Använd sax för att klippa luftstrupen. Skjut en pincett i lungorna och lyfta dem ur musen. Skölj lungorna kort stund i en 1L bägare med vatten.
6. I en kemisk dragskåp, överföring lungorna till ett glas scintillation injektionsflaska innehållande 5 ml av Fekete lösning. I tumörvävnad kommer att dyka upp som vita knutor på den svarta lungor efter några minuter. De tumörer kan nu räknas och lagras i Fekete lösning på obestämd tid.

4. Representant metastaser i visualiseras Lungor

1. Här lungor från möss som injicerades med bröst linje cancer cell 4T1 visar vita fläckar tyder på tumörer. Möss som injicerades med 4T1 celler transfekterade med en IRF8 dominant-negativ mutant K79E visar den förbättrade metastaserande potential tumörceller.
2. Dessa bilder visar en histologisk analys av effekten hos CTL adoptiv transfer immunterapi. Tumör-bärande möss injicerades med saltlösning visade flera tumörer 6 dagar senare, vilket indikeras av gula pilar (A). Möss injiceras med tumör-specifika T-celler, å andra sidan visade en minskning av tumörer (B).
3. I samma experiment ger tusch behandling ett enklare sätt att mäta effekten av CTL adoptiv transfer. Här, det vita tumörnoduli på tumör-bärande lungorna tydligt skiljer dem från lungorna som framgångsrikt har genomgått CTL adoptiv transfer, och räkna knutor möjliggör en examenför kvantifiering inte är möjligt med histologi.

5. Representativa resultat

Figur 1. Experimentella system för experimentella tumörer metastaser och CTL adaptiv överföra immunterapi musmodell. Röda prickar visar tumörceller och gröna prickarna visar CTL.

Figur 2. Rubbning av IRF8 funktion ökat metastaserande potential tumörceller. Mus bröstcancer cellinje 4T1 var stabilt transfererats med vektor (4T1.Vector) eller vektor som uttrycker en IRF8 dominant-negativ mutant K79E (4T1.IRF8K79E) (15, 16). Tumörceller injicerades iv in musen i sidled svans ådror. Tumör-bärande lungor var uppblåst med tusch för att visualisera tumören knölar. Tumörnoduli ses gärna som vita fläckar på den svarta lungvävnad bakgrund.

Figur 3. Histologiska analysen av effekten hos CTL adoptiv transfer immunterapi. Mus sarkom cellinje CMS4-Met injicerades iv i musen i sidled svans ådror. Tre dagar senare var koksaltlösning (A) eller tumör-specifika T-celler (B) sprutas in i tumören-bärande möss. Lungor analyserades sex dagar efter CTL behandling med konventionella H & E histologiska färgning. Tumörnoduli indikeras med pilar.

Figur 4. Visualisering av tumörnoduli med tusch inflationen. Mus sarkom cellinje CMS4-Met injicerades iv i musen i sidled svans ådror. Tre dagar senare var koksaltlösning (Control) eller tumör-specifika T-celler (+ CTL) sprutas in i tumören-bärande möss. Lungor analyserades fjorton dagar efter CTL behandling. Den vita fläckar, som är tumörnoduli, möjliggör enkel kvantifiering av effekten av CTL behandling.

Materials

Solutions:

India Ink Solution (17):

Pour 150 ml of distilled water into a 250 ml flask. Add 4 drops ammonium hydroxide to the distilled water. Add 30 ml India Ink stock (i.e. Sanford Black Magic Waterproof Drawing Ink 4465 Item 44011) to the ammonia and water mixture. Top off with distilled water to a volume of 200 ml. Solution is ready for injection.

Fekete's Solution (17):

Fekete's solution is used to bleach India ink-inflated tumor-bearing lungs to distinguish white tumor nodules from the black background of normal tissues.

Add 350ml 95% EtOH to 1L glass bottle. Add 150ml distilled water Add 50ml formaldehyde Add 25ml glacial acidic acid