Summary
תא גורמים מארח לשחק תפקיד קריטי בהקמת ותחזוקה של סרקומה של קפוסי (KS). אנו המתאר שיטות לזיהוי התא המארח גורמים להשתנות KSHV תאים הנגועים DMVEC, וכן רקמת הגידול KS. גנים נייד שינו ידי וירוס תשמש יעד פוטנציאלי (ות) עבור הרפוי הרומן.
Abstract
נכון לעכשיו KS הוא השולט ביותר HIV / איידס ממאירות הקשורות בדרום אפריקה, ולכן את העולם. 1,2 הוא מאופיין כגידול angioproliferative לתאי אנדותל של כלי הדם ומייצר נדיר מחלות B תא lymphoproliferative בצורה של לימפומה השתפכות pleural (פל) וכמה צורות של המחלה multicentric של קסלמן. 3-5 רק 1-5% של תאים KS נגעים תומכים באופן פעיל שכפול ממס של קפוסי סרקומה הקשורים של וירוס ההרפס (KSHV), סוכן האטיולוגית הקשורים KS, וברור כי גורמים הסלולר חייב אינטראקציה עם גורמים ויראליים בתהליך של oncogenesis התקדמות הגידול. 6,7 זיהוי מארח גורם רומן הגורמים אשר תורמים KS הפתולוגיה חיונית לפיתוח סמנים פרוגנוסטיים להתקדמות גרורות הגידול, כמו גם לפיתוח הרפוי הרומן לטיפול KS . 8 הפרטים הווידאו המלווה את השיטות בהם אנו משתמשים כדי לזהות את התא המארח הגן ביטוי בתוכניות להשתנות עורי לתאי אנדותל כלי הדם (DMVEC) לאחר ההדבקה KSHV ועל רקמת הגידול KS. 9 לאחר גנים dysregulated מזוהים על ידי ניתוח microarray, שינויים בביטוי החלבונים הם אושר על ידי immunoblot ו immunofluorescence שכותרתו כפול. שינויים בביטוי של גנים תעתיק dysregulated הם אישרו במבחנה על ידי כמותי תגובה בזמן אמת שרשרת פולימרז (qRT-PCR). אימות של הממצאים במבחנה באמצעות ארכיוני KS רקמת הגידול מתבצע גם על ידי immunochemistry שכותרתו כפולה microarrays רקמות. 8,10 הגישה שלנו זיהוי גנים dysregulated ב microenvironment רקמת הגידול KS יאפשר פיתוח של במבחנה ולאחר מכן במערכות מודל עבור vivo גילוי והערכה של פוטנציאל טיפולית חדשנית לטיפול KS.
Protocol
1. KSVH טיפוח זיהום של DMVEC
- הקו BCBL-1 תא, במקור מבודד לימפומה חלל גוף האדם מבוסס, הוא בתרבית להשלים RPMI 1640 מדיה (Gibco, גרנד איילנד, ניו יורק). BCBL-1 תאים יוסרו חנקן נוזלי, מועבר על קרח יבש, מופשר במהירות במשך דקה 1 ב 37 ° C. Aliquot 50 μL של BCBL-1 התאים בצפיפות 1x10 4 תאים / מ"ל נוסף של 500 מ"ל RPMI 1640 מדיה בתוספת 10% עגל בסרום עוברי, 1x פניצילין / סטרפטומיצין ומופץ לתוך צלוחיות 175 ס"מ, על 50 מ"ל / בקבוק .
- צלוחיות של BCBL-1 תאים מודגרת אז ב 37 ° C באווירה של 5% CO 2 עד צפיפות התאים הגיעו 3x106 תאים / מ"ל. שכפול הנגיף ממס מחזור הוא המושרה על ידי הוספת TPA ב בוטיראט 20ng / mL ונתרן ב 0.3 נ"ג / מ"ל.
- עשרים וארבע שעות אינדוקציה תאים הודעה נשטפים פעמיים בהיקף של 40 מ"ל ידי צנטריפוגה בסל"ד 1500 ב צנטריפוגה מקרא RT Sorvall (כדי להסיר בוטיראט) ב-PBS pH7.4, ואינדוקציה הוא המשיך עם TPA ב 20 ng / mL ב RPMI 1640 למשך 5 ימים נוספים.
- וירוס סלולרי חינם מבודד ומרוכז על ידי צנטריפוגה ההפרש. בקצרה, תאים ופסולת תא pelleted הראשון 10,000 סל"ד ב RC-6 פלוס צנטריפוגות ב 4 ° C Sorvall במשך 30 דקות. Supernatant המכילים את הנגיף יוסר וירוס בחינם תא pelleted ב ultracentrifuge Beckman Coulter L-90k אופטימה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ב 25,000 סל"ד.
- מווירוסים supernatant מוסר לבין גלולה ויראלי resuspended בתקשורת הקפאה (sulfoxide דימתיל 10% ו 90% עגל בסרום עוברי) ומאוחסנים ב -80 ° C עד הצורך.
KSHV זיהום של תאים DMVEC העיקרי. - תאים DMVEC ב 2-5 ברמת המעבר הם מצופה בצפיפות ראשונית של 1 X 10 5 100x20mm תרבות מנות רקמה או שקופיות קאמרית, ומתוחזקים ב EMB-2 מדיה מלאה (Lonza, באזל, שוויץ) ב 37 מעלות אווירה של 5% CO 2. באותו מפגש 80%, DMVEC נגועים ב moi של 0.01; מדומה נגוע (מדיה בלבד) התאים משמשים שולטת. התקשורת טריים מתווסף תאים כל 2 ימים.
- Monolayers DMVEC התא שקופיות קאמרית נבחנים מדי יום עדות לזיהום כאמור על ידי יצירת תא ציר. לאחר סימנים ראשונים של היווצרות תא כישור (7-14 ימים) נפסיק שינויים התקשורת. עם זאת, פעמים הדגירה כבר עודף של 15-21 ימים מבלי לספק מדיה טריים יכולים להתפשר על שלמות התאים DMVEC וכתוצאה מכך תאים מתים או מרימים את צלחת תרבות.
- בשלב של spindling מקסימאלית במהלך ההדבקה, monolayers תא נקצרים להכנת כדורי תא לחלבון או מיצוי RNA. תאים נגועים DMVEC בשקופיות קאמרית נשטפים פעמיים עם מ"ל 1 / חלון עם טרום חימם PBS pH 7.4. תאים בשקופיות קאמרית נקצרים לאחר שטיפה 2X עם PBS pH 7.4. מותר להם להתייבש לחלוטין לפני הסרת לשכות הצבת שקופיות מתנול 100% שהתקיימה -20 ° C עד הדרוש מכתים immunofluorescent (IFA).
2. בבידוד מוחלט RNA והפקה של cDNA מ מוק ו KSHV אינפקטד DMVEC
- סך RNA מופק DMVEC KSHV-נגוע תאים נגועים מדומה באמצעות RNesay Qiagen מיני KIT (Qiagen, ולנסיה, CA). הפרוטוקול של היצרן עבור עיבוד רקמות חיות מועסק אך ללא צעדים homogenization, אם תאים בתרבית הם המקור המשמשים לבידוד RNA.
- בחר את האפשרות הציע לטפל RNA עם DNAseI על העמוד באמצעות RNA Qiagen חינם DNAse קיט, לפי המלצות היצרן נמצא בנספח של המדריך הדרכה. DNAaseI מדרדרת כל גנומית לזהם או ה-DNA הנגיפי של הכנת RNA. הטיפול DNAseI היא קריטית עבור יישומים זרם למטה כולל RT-PCR, qRT-PCR ומנתח microarray.
- RNA הוא נשטף על פי ההוראות וכל אתנול שיורית למאגר לשטוף יוסר על ידי centrifuging העמודה פעם אחת יותר הציע ידי היצרן. אתנול שיורית פשרות על טוהר של RNA לאחר elution.
- לאחר לשטוף את הצעד הסופי צנטריפוגה נוסף מבוצע לפני RNA יכול להיות eluted מהעמודה. RNA היא eluted מהעמודה עם 30 μL מים חינם RNAse. RNA היא לכמת אז ונותחו על טוהר על פוטומטר-Bio-AG 6131 Eppendorf. יחס צפיפות אופטית (260/280 ננומטר) צריך להיות between1.8-2.0 האופייני עבור RNA של טוהר גבוהה.
- לניתוח microarray, RNA הוא ניתח על 2100 Agilent Bioanalyzer באמצעות אלגוריתם תוכנה רין. ניתוח על bioanalyzer מספק לכם מספר Integrity RNA (רין) 1-10, אולם המספרים רין 7-10 הוכיחו להניב תוצאות עקביות ואמינות יותר מנתח microarray או qRT-PCR. המספר הממוצע של רין RNA Isolaטד עם ערכת Qiagen RNAeasy בידינו טווחי 7.5-9.
- Quantitation של רנ"א מושגת על ידי הוספת 1 μL של RNA eluted מהעמודה כדי μL 99 של ה-pH 10mm טריס-EDTA 7.6. RNA ו חיץ הוא מעורבב עם טפטפת והוסיף קובט נקי לניתוח spectrophotometric עם Eppendorf ביו פוטומטר.
- RNA שליח של מיקרוגרם אחד של כל דגימה היא ערוכה באמצעות hexamers אקראי המסופקים על ידי היצרן, לפני שעתוק הפוכה עם ערכת cDNA קיבולת גבוהה שעתוק לאחור (Biosystems יישומית, פוסטר סיטי, קליפורניה.).
cDNA סינתזה - כדי לסנתז יחיד תקועים cDNA מ-RNA סך אנו משתמשים בקיבולת גבוהה הפוך cDNA תמלול קיט מ Applied Biosystems והמשך לפי הוראות היצרן.
- לערבב מאסטר 2x של ריאגנטים מורכב ו 0.5-1 מיקרוגרם של רנ"א בהיקף של 10 μL מתווסף μL 10 של תמהיל מאסטר 2x מגיב. הפתרון 1x וכתוצאה מכך הוא מעורב בעדינות שעתוק לאחור מתבצע Cycler MJ-Mini-themal BIORAD על פי הוראות היצרן.
- עד שני מיקרוגרם של רנ"א הכל יכול לשמש לכל תגובה 20 μL. CDNA הוא ונרשמת ב 260 ננומטר AG-6131 Eppendorf ביו פוטומטר, ומאוחסנים ב -80 ° C עד הדרוש qRT-PCR.
3. Microarray ניתוח השוואתי של תאים מוק ו KSHV DMVEC מאשרום
המעבדה שלנו מבצעת ניתוח microarray באוניברסיטת ונדרבילט מרכז רפואי מתקן microarray משאבים משותפים Core על בסיס עמלה תמורת שירות. אנו משווים קבצי פלט עבור dysregulation תעתיק של גנים בתאים נגועים KSHV DMVEC ללעוג תאים נגועים מלאה. גנים dysregulated תעתיק בתאים נגועים KSHV שרלוונטיות שגשוג, אנגיוגנזה התא או המייצגים סמנים גרורתי מאומתים במבחנה באמצעות תאים KSHV DMVEC נגועים באמצעות PCR בזמן אמת, כתמים המערבי, IFA כפול; התוצאות לעומת הממצאים הגידול KS ארכיוני רקמות.
4. RT-PCR כמותי וניתוח גנים תעתיק Dysregulated נמצאו DMVEC מוק ו KSHV נגועים
- זמן PCR נדל מבוצעת היטב 96 צלחות אופטי (סורנסון Bioscience, Inc) באמצעות transcriptase הפוכה שנוצר cDNA שמקורו מדגם מטוהרים רנ"א באמצעות יחיד MyiQ בזמן אמת צבע איתור PCR System (Bio-Rad Laboratories, הרקולס, CA) ואת תגובה 25 כרכים μL. הליך זה נעשה בארון בטיחות ביולוגית, כדי למנוע זיהום אפשרי על ידי DNA זרים / cDNA שעשוי להיות נוכח בחדר.
- לערבב מאסטר מוכן ב 1.5 צינורות מ"ל עבור כל צבע יסוד (על פי הוראות היצרן) באמצעות SYBR גרין Supermix (Bio-Rad Laboratories, הרקולס, CA) ואת נבחרת קדימה primers הפוך עבור כל גן של עניין, בריכוז של 250 nM לכל טוב, תוצרת RNAase DNAase חינם H 2 O. מדגם כל צריך להיעשות בשלושה עותקים.
- רצפים פריימר עבור qRT-PCR עבור גנים התא המאכסן כוללים רצפים פריימר עבור KSHV לנה, שהיא חביון וירוס הקשורים אנטיגן הגרעיני מתבטא ביותר בתאים נגועים KSHV DMVEC וגידולים KS.
- 10 ng / cDNAs מניות ul מן התאים הנגועים KSHV מדומה DMVEC נגועים הם בדילול 01:03 משתמש RNAase DNAase חינם H 2 O; 3μL של דילול זה מתווסף כל טוב. בקרת בארות מים תחליף cDNA.
- צלחת 96 גם הוא חתום עם הקלטת איטום אופטי (Bio-Rad Laboratories), מעורבת centrifuged בעדינות במשך 2 דקות ב 1000 סל"ד, בטמפרטורת החדר, כדי לאסוף את תערובת התגובה בתחתית הבארות. מערכת Bio-Rad MyiQ איתור המנורה מופעלת בשלב זה, כדי לאפשר פרק זמן 10 דקות חימום לפני תחילת הריצה.
- צלחת centrifuged 96 גם היא לשים אז לתוך ביו רד M IQ צבע יחיד נדל מערכת איתור זמן PCR, התוכנית של רצפי מחזור נכנס והציל, ולהפעיל את העבודה.
- רצף רכיבה על אופניים היא כדלקמן: 95 ° C במשך 3 דקות, 95 ° C למשך 15 שניות, 60 ° C למשך דקה 1, 95 ° C למשך דקה 1, 55 ° C עבור 1 דקה, 55 ° C למשך 30 שניות עבור 81 מחזורים בסך הכל. עקומת להמיס נכלל בתוכנית זו כבדיקה ליעילות פריימר. סט פריימר GAPDH מוגבר, וכלל לנורמליזציה.
- ניתוח הנתונים נעשה עם Bio-Rad iQ5 גרסת תוכנה אופטי מערכת 2.
5. Dual ניתוח immunofluorescence תווית של תאים נגועים KSHV DMVEC
- מגלשות הקאמרית (להסיר תאים) המכיל שני DMVEC נגוע נגוע ומחוברות נשטפים פעמיים עם PBS pH 7.4, מיובשים באוויר, קבוע מתנול -20 ° C טרום צונן מוחלט למשך 10 דקות וקבע ב -20 ° C.
- שקופיות עם תאים הen אוויר יבש במשך 15 דקות, והניח לצנצנת Coplin על קרח המכיל טריס מלוחים (0.05M טריס pH 7.4) במשך 5 דקות. תאים מודגרת אז 37 לשעה 1 ° C בתא humidified בתערובת של נוגדנים חד שבטיים כדי KSHV לנה בדילול 1:50 ב PBS pH 7.4 (וקטור מעבדות, Burlingame, CA) בתוספת נוגדן עז polyclonal (1: 100 דילול ב PBS pH 7.4) כנגד חלבון המארח גורם יימצא dyregulated ידי microarray באמצעות תאים KSHV DMVEC נגועים.
- התאים נשטפים אז 3x עם טריס מלוחים (לא מאפשרים לתאים להתייבש) ו מודגרות אז במשך 30 דקות בתערובת של נוגדן חמור משני אנטי עכבר IgG מצומדות עם נוגדן אנטי אדום עז rhodamine-X ו חמור מצומדות כדי FITC (ג'קסון ImmunoResearch, גרוב המערבית, הרשות הפלסטינית), הן דילול 1:100 ב PBS.
- התאים נשטפים מאוחר יותר 3x ב טריס מלוחים בצנצנת Coplin ובעוד שקופיות עדיין לח, השקופיות הן רכוב עם Vectashield הרכבה מדיה (וקטור מעבדות, Burlingame, CA) המכיל 1.5 גרם / מ"ל של DAPI ו coverslip.
- Fluorescence הוא ציין ותמונות להצטלם עם מיקרוסקופ TE -2000 Nikon פלורסנט רכוב עם מצלמה תשלום מצמידים התקן (CCD). תמונות יילקחו באמצעות המטרה 20x עבור הגדלה כוללת של 200x.
- תמונות בהגדלה נפרדת באותו המשמש DAPI (200x), נלקחים UV תאורה usinge, עם פילטר ירוק rhodamine ומסנן כחול FITC. התמונות הן התמזגו מאוחר יותר באמצעות תוכנה חינמית של ניקון.
6. אימונוהיסטוכימיה תווית כפולה על Ks רקמות microarrays Ks רקמות עבור KSHV לנה ואת מרקר תא האנדותל Pecam-1/cd31
- אימונוהיסטוכימיה שכותרתו כפול מבוצע עם ערכת strepavidin DAKO ABC דואט מכתים עבור KSHV לנה ושל התא המארח חלבונים נמצא שינו לאחר ההדבקה בנגיף. IHC מבוצעת על רקמת איידס KS ארכיוני קבוע בפורמלין, ו מוטבע פרפין.
- חמישה קטעים מיקרון נחתכים עם microtome והניח בשקופיות chemate לפני immunostaining.
- מגלשות פרפין המוטבע deparaffinzed ב קסילן במשך 10 דקות מתחת למכסה המנוע קטר, ואז התאים hydrated בסדרה אתנול מדורגת של 100%, 95% ו 70% במשך חמש דקות כל אחד. שקופיות ממוקמות אז במשך 10 דקות לפני חשיפת אנטיגן (הידוע גם בשם אחזור אנטיגן) במים.
- עבור immunostaining, חשיפת אנטיגן מבוצע במיקרוגל ב 50 ציטראט חיץ mM 6.0 pH על 95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. בקצרה, מגלשות המכיל תאים שקועות חיץ ציטראט 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן הניח מיד במים מזוקקים המוחזקים בטמפרטורת החדר.
- מרווה של peroxidase אנדוגני מבוצע על ידי דוגרים שקופיות במשך 30 דקות בתמיסה מרווה. בקצרה, להוסיף 47 מ"ל של אתנול 95% ל צינור חרוטי 50 מ"ל, הוסיפו 11.2 מ"ל PBS pH 7.4 ו - 1.8 מ"ל של מי חמצן 3% עבור סכום כולל של 60 מ"ל.
הפתרון מרווה נעשית רק לפני השימוש. - התאים נשטפים אז 3x ב PBS pH 7.4 במשך 5 דקות כל בטמפרטורת החדר. הפתרון חוסם (12.5 מ"ל של אתנול 95%, 1.4 מ"ל של סרום עז רגיל, 140 מ"ג אלבומין בסרום שור, ו 2 טיפות Tween 20) מוכן למנוע מחייב ספציפי של נוגדנים. מניחים על קרח לפני השימוש. (זה פתרון חסימת יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד שבוע 1).
- חסימת פתרון נוסף הדגימה בשקופית והוא מכוסה אז עם רצועת פרפין (כדי למנוע התייבשות של הדגימה) והניח בתא humidified וטופחו במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
- נוגדנים חד שבטיים או polyclonal העיקרי האנטיגן הנגיפי מוכן בחסימת פתרון בדילול 01:50, מעורבב עם טפטפת והניח על הקרח עד הצורך. חמישים עד 100 μL של פתרון נוגדן יהיה צורך בכל דגימה רקמה תלוי בגודל של דגימות ומספר של שקופיות.
- מיד לאחר דגירה הפתרון חוסם הוא ניער מעליו את שקופיות 5-10 μL של הנוגדן העיקרי הוא הוסיף הדגימה רקמות שמכוסה אז עם רצועת פרפין. דוגמאות מודגרת במשך 1-2 שעות בתא humidified בטמפרטורת החדר.
- שקופיות המכילות דגימות הן מכן לשטוף 3x 5 דקות כל אחד PBS pH 7.4 אשר מתווסף נוגדן משנית biotinylated אנטי עכבר עז על דילול 1:100 ב PBS pH 7.4, ו מודגרות בתא humidified בטמפרטורת החדר למשך 30 - 45 דקות.
- כ -30 דקות לפני השימוש, peroxidase מצומדות strepavidin ב-PBS pH 7.4 מוכנה. באמצעות ערכת דואט Cytomation DAKO, להוסיף 50 μL של פתרון 5 מ"ל של PBS pH 7.4, מערבולת, ולאחר מכן להוסיף 50 μL של B פתרון ומערבבים שוב.
- לאחר דגירה את הנוגדן 6.10 צעד שלם, השקופיות נשטפים 3x ב PBS pH 7.4 ואז יח"צ טריepared חזרת מצומדות-strepavidin פתרון peroxidase הוא הוסיף מודגרות בטמפרטורת החדר למשך 30-45 דקות בתא humidified.
- לאחר דגירה, מגלשות נשטפים 3x ב PBS pH 7.4 בטמפרטורת החדר. חמש דקות לפני הכביסה הסתיימה, 3, 3-diamino-benzidine (DAB, SIGMA) פתרון המצע (20 מ"ל של PBS pH 7.4, 25 μL של מי חמצן 3%, ו 1 DAB לוח) מוכנה. אחרי לוח DAB הוא נמס לגמרי, הפתרון בצבע חום מסוננת דרך פילטר מיקרון 0.45 מזרק. הפתרון DAB סינון נוסף ואז את הדגימות לאחר לשטוף הסופי ופיתוח צבע KSHV לנה בתאים נגועים הוא ציין בזמן אמת תחת תאורה brightfield באמצעות מיקרוסקופ Eclipse ניקון E200. לאחר התפתחות הצבע הרצוי מושגת, התגובה היא הרווה ידי הדגירה במים מזוקקים למשך 5 דקות.
- עבור IHC שכותרתו כפול, אחרי דגירה במים השקופיות המכילות דגימות עוברים את פרוטוקול IHC בפעם השנייה החל לשלב אנטיגן אחזור (6.4). עם זאת השינויים פרוטוקול בשלב peroxidase המצע (6.11) ב שבמקום peroxidase חזרת מצומדות-strepavidin, אלקליין phosphatase strepavidin המצומד הוא מועסק
- תיוג השני מושגת על ידי צעד נוסף אחזור אנטיגן במיקרוגל כמתואר לעיל בתוספת immunostaining השני עם נוגדנים חד שבטיים לחלבון הסלולר נמצא dysregulated (וקטור מעבדות, Burlingame, CA). תאים נשטפים לאחר מכן, ו מודגרות אז דילול 1:100 ואחריו אלקליין phosphatase-strepavidin המצומד (וקטור Labs, Burlingame, CA) בדילול 1:500 עם עז biotinylated anti-mouse/rabbit IgG נוגדנים (DAKO). התפתחות צבע מושגת על ידי תאים דוגרים עם אדום המצע וקטור באמצעות וקטור אדום המצע אלקליין פוספט Kit (וקטור מעבדות, Burlingame, CA) על פי הוראות היצרן. מכתים מונה, אם רוצים, ניתן לבצע עם orecin או hematoxylin. דגימות רקמה אז הם רכוב לצמיתות עם התקשורת הרכבה permount עם כוס לכסות. תמונות נלקחים תחת תאורה brightfield עם מיקרוסקופ Nikon TE-2000s רכוב עם מצלמת CCD.
7. ג'ין מסירה על ידי התמרה של תאים adenovirus DMVEC
- רגיל תאים DMVEC מעובדות בשקופיות קאמרית בבית ציפוי של 2.5 צפיפות X10 5 תאים לכל תא EBM-2 מדיה מלאה.
- התאים גדלים DMVEC אל מפגש 80% (לוקח 3-5 ימים) לאחר 5 ul / שקופיות קאמרית חלון EGFP adenovirus להביע בבית titer 1X 10 10 החלקיקים / mL.
- חיים בתרביות תאים DMVEC עם adenovirus הוסיף נבדקו עבור EGFP הקרינה 18 שעות לאחר הוספת וירוס.
- שלב הפרט וצילומים פלורסנט צולמו בהגדלה סך של 200X ו הממוזג על גבי מיקרוסקופ TE -2000 NIKON פלורסנט רכוב עם מצלמת CCD.
8. נציג תוצאות
באיור 1. תאים DMVEC ראשונית של חברת Lonza נשמרו ב EBM-2 התקשורת היו נגועים בנגיף ב BCBL 1-moi של 0.01. לאחר ההדבקה DMVEC monolayers תא נבדקו מדי יום. עשרה ימים זיהום הודעה תאים נגועים מדומה להראות המרוצף כמו מורפולוגיה תאים נגועים KSHV הציג תא ציר סוג המורפולוגיה האופיינית לתאי אנדותל ציר בצורת נמצא נגוע KSHV בתוך רקמת הגידול KS. התמונות צולמו עם מיקרוסקופ TE -2000 NIKON רכוב עם מצלמת CCD בהגדלה סך של 100x.
איור 2. מכתים Dual שכותרתו immunofluorescence עקיף בוצע על תאים KSHV DMVEC נגוע ב 10 הימים שלאחר זיהום. תאים נגועים היו מוכתמים כפול עם נוגדנים חד שבטיים כדי KSHV לנה ו נוגדן polyclonal עז אל חלבון ספציפי בתא המארח נמצא להשתנות לאחר ההדבקה KSHV. תערובת של החמור משני אנטי עכבר ואנטי עז חמור נוגדנים מצומדות כדי rhodamine ו FITC נוספו. תאים נבדקו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי Nikon TE2000S מצויד במצלמת CCD. התקשורת הרכבה עם DAPI שימש לדמיין גרעינים. כל התמונות צולמו בהגדלה סך של 200x. תאים נגועים המבטא את החלבון וירוס לנה (rhodamine מוכתם) מקומי לגרעין להראות מופחת הביטוי של החלבון מארח תאים ספציפיים (FITC מוכתם) אל הציטופלסמה מקומי.
איור 3. IHC ברקמת הגידול KS עבור לנה ו PECAM-1 / CD31. איידס KS רקמת הגידול היה מוכתם על ידי IHC שכותרתו יחיד כפול עבור KSHV לנה ו PECAM-1 / CD31. א) מראה מוכתם KS הרקמה עם נוגדן חד שבטי אל לנה ו counterstained עם hematoxylin. תאים לנה חיובי מזוהים חצים לבנים. B). רקמה KS מוכתם נוגדן חד שבטי כדי PECAMI/CD31 והכתים מופיע ספציפית אנדותל סביב כלי מתואר על ידי חצים לבנים. ג) מראה מוכתם KS רקמות כפול עבור לנה (וקטור אדום) CD31 (חום) מתואר על ידי חיצים שחורים לנה לבן עבור תאים מכתים חיובית CD31. ד) מציג בהגדלה נמוכה יותר של שטח משקופית אותו בלוח התמונות ג brightfield צולמו על מיקרוסקופ NIKON TE2000S בהגדלה הכולל של AC ו 600x 200x עבור לוח ד
איור 4. הביטוי הזמני של KSHV לנה ידי זיהום qRT-PCR 10 ימים שלאחר לעומת מדומה תאים נגועים מלאה. כל הערכים של תאים נגועים KSHV DMVEC היו מנורמל ל GAPDH. לא היו כל ראיות של לנה cDNA הגברה בתאים נגועים מדומה.
איור 5. רקמת הגידול KS microarrays. Microarray רקמות (TMA) מייצג 0.6 ליבות רקמה מילימטר ערוכים בשקופית אחת. כל ליבה רקמות מייצג טיפוס הגידול KS מחולה אחרת. TMA נעשו זמינים באמצעות המשאבים הדגימה סרטן ואיידס (ASCR) מ ליאונה איירס MD באוניברסיטת אוהיו. פרפין מוטבע KS רקמת הגידול יחד עם התאמה מלאה רקמות נורמליות חיובית הונחו על שקופיות הזכוכית. דגימות KS רקמות שנלקחו הפה, העור, החיך הרך, הלשון ההמונים הצוואר. כל החולים היו נשאיות.
איור 6. Microarrays רקמות הוכתמו על ידי לנה KSHV אימונוהיסטוכימיה ו נותחו על ידי מיקרוסקופיה brightfield. התפתחות צבע עבור לנה בוצעה עם DAB כמו מצע peroxidase ותאי לנה חיובית היו דמיינו ידי דפוס מכתים חום אינטנסיבי. כמויות שונות של עומס ויראלי תא האזורים ציר ניתן לצפות. ) מייצג זיהום ויראלי מוקד באזור מוגדר של הגידול. ב) מייצג זיהום המופץ עם עומס נגיפי גבוה כי הוא בערך בקורלציה עם מספר תאים ציר ההווה. ליבות רקמה צבעונית נצפו בהגדלה 200x.
איור 7. תאים DMVEC מעובדות EBM-2 התקשורת להשלים בצפיפות של 2.5 X10 5 תאים לכל גם היו transduced עם μL 5 של adenovirus ב כייל של 1.0X10 10. תאים שנבדקו עבור התמרה EGFP הקרינה 18 שעות הודעה. שלב שני ותמונות פלורסנט נלקחו על מיקרוסקופ TE -2000 Nikon בהגדלה סך של 200X. Transfection של תאים DMVEC העיקרי הוכיחה להיות בעייתי וקטורים ויראליים ולכן זיהינו שיאפשר לנו לספק fibulin-2-3 ו galetin מאוד ביעילות DMVEC העיקרי. מצאנו כי adenovirus להביע EGFP ביעילות transduce DMVEC העיקרי. מצאנו גם כי וקטור lentiviral אנו המתקבל Lentigen Corporation היה יעיל באותה מידה עבור transducing תאים DMVEC הראשי (מידע לא מוצג).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטות השתמשו בדוח זה יכול להתבצע במגוון רחב של הגדרות מעבדה. הם דורשים ציוד מיוחד או גישה למתקני הגרעין. אמצעי זהירות נאות יש לנקוט כאשר עושים ניסויים מעורבים גורמי מחלה ויראלית מדבקת כמו KSHV אשר עשויה לדרוש את השימוש ברמה biosaftey 3 (BSL-3) המתקנים. רכישות רקמות חייב להיות מאושר על ידי הלוחות המתאימים סקירה מוסדיים (IRBs).
מתודולוגיות אלה ביחד יכולים להוות בסיס לזיהוי גנים dysregulated בביטוי במבחנה לספק שיטות שהוגדר עבור אימות ב vivo של פרופילי ביטוי גנים שונה, כמו גם אסטרטגיות למסירה גנים בתאי האנדותל. ממצאים אלה יחדיו עשויים לעזור להבהיר הביוכימיים המושפעים מזיהום KSHV ולאחר מכן על ידי הגנים ויראלי ספציפי. הבנה של האופן שבו וירוסים בשעור כמו KSHV לקטוע מסלולים מולקולריים ספציפיים יכול לספק תובנות בפיתוח של רומן הרפוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים ג'יימס EK הילדרת, Meharry Medical College, לעצתו וסקירה של כתב היד הזה. אנו מודים גם דיאנה Marver לעריכה של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי ונדרבילט Meharry המרכז לחקר האיידס (NIH מענק AI054999 P30-05); המרכז לחקר בריאות איידס פערים, NIH מענק 5U54 RR019192-05; Meharry המרכז למחקר קליני, NIH גרנט P20RR011792, ועל ידי NIH מענק P01 CA113239. DJA מומן בחלקו על ידי מענקים ממרכז טייס ואנדרבילט-Meharry לאיידס מחקר (כפר) והמרכז Meharry למחקר קליני (CRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| PBS pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | 19364 (FLUKA) | |
| EBM-2 media | Lonza Inc. | CC-3156 | + bullet kits supplement |
| DMVEC cells (HMVEC) | Lonza Inc. | CC2543 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SH30066.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Chamber slides | Nalge Nunc international | 154461 | |
| KSHV LANA Mab | Vector Laboratories | VP-H913 | 1:50 dilution/IFA |
| Galectin-3 goat pAb | R&D Systems | AF1154 | |
| Donkey-anti-goat FITC | Jackson ImmunoResearch | 705-095-1 | |
| Donkey-anti-goat Rho | Jackson ImmunoResearch | 705-295-003 | 1:100 dilution/IFA |
| Mounting media | Vector Laboratories | H 1500 | Vectashield with DAPI |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce, Thermo Scientific | 23235 | |
| Nitrocellulose | Bio-Rad | 161-0112 | |
| Donkey-anti-goat-conj. | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC 2020 | |
| Western substrate | Pierce, Thermo Scientific | 34075 | |
| Biotin-rabbit-anti goat | Dako | 305-065-045 | |
| AP-Strepavidin conj. | Dako | K 0492 (kit) | |
| RNase DNase Free Set | Qiagen | 79254 | |
| MJ Mini Cycler | Bio-Rad | PTC-1148C | |
| Bio-Photometer | Eppendorf | 952000006 | |
| RC 6 Plus Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 46910 | |
| Coulter Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 392052 | |
| MYiQ iCycler Real Time PCR Detection System | Bio-Rad | 170-9770 | |
| TE 2000S Fluorescent microscope | Nikon Instruments | TE2000S | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938C | |
| Eclipse E 200 | Nikon Instruments | E 200 | |
| Sorvall Legend RT Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75004377 |
References
- Sitas, F., Newton, R. Kaposi's sarcoma in South Africa. J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).
- Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. Field's Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).
- Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles, D. M., Moore, P. S. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P., Said, J. W., Knowles, D. M., M, D. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N Engl J Med. 18, 1186-1191 (1995).
- Cesarman, E., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: a lymphotropic human herpesvirus associated with Kaposi's sarcoma, primary effusion lymphoma, and multicentric Castleman's disease. Semin Diagn Pathol. 14, 54-66 (1997).
- Chiou, C. J., Poole, L. J., Kim, P. S., Ciufo, D. M., Cannon, J. S., ap Rhys, C. M., Alcendor, D. J., Zong, J. C., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J Virol. 76, 3421-3439 (2002).
- Staskus, K. A., Zhong, W., Gebhard, K., Herndier, B., Wang, H., Renne, R., Beneke, J., Pudney, J., Anderson, D. J., Ganem, D., Haase, A. T., T, A. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus gene expression in endothelial (spindle) tumor cells. J Virol. 71, 715-719 (1997).
- Alcendor, D. J., Zhu, W. Q., Desai, P., Vigil, H. E., Hayward, G. S. KSHV downregulation of galectin-3 in kaposi's sarcoma. Glycobiology. , (2009).
- Ciufo, D. M., Cannon, J. S., Poole, L. J., Wu, F. Y., Murray, P., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Spindle cell conversion by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: formation of colonies and plaques with mixed lytic and latent gene expression in infected primary dermal microvascular endothelial cell cultures. J Virol. 75, 5614-5626 (2001).
- Long, E., Ilie, M., Hofman, V., Havet, K., Selva, E., Butori, C., Lacour, J. P., Nelson, A. M., Cathomas, G., Hofman, P. LANA-1, Bcl-2, Mcl-1 and HIF-1alpha protein expression in HIV-associated Kaposi sarcoma. Virchows Arch. 2, 159-170 (2009).
