Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Определение дизрегуляции Гены индуцированные саркомы связанных герпеса Капоши (KSHV)

Published: September 14, 2010 doi: 10.3791/2078

Summary

Факторов клетки-хозяина играет важную роль в установлении и поддержании саркома Капоши (СК). Мы выделяем методы выявления факторов клетки-хозяина изменены KSHV-инфицированных DMVEC клеток, и в ткани опухоли KS. Сотовая гены изменены вирус будет служить потенциальной мишенью (ы) для терапии романа.

Abstract

В настоящее время КС является наиболее преобладающим вопросам ВИЧ / СПИДа злокачественности в Южной Африке и, следовательно, мира. 1,2 Он характеризуется как angioproliferative опухоли сосудистых эндотелиальных клеток и производит редкие ячейки B лимфопролиферативных заболеваний в виде плеврального выпота лимфомы (PEL) и некоторые формы болезни многоцентровое Кастельмана. 3-5 Только 1-5% клеток в KS поражения активно поддерживать литической репликации саркомой Капоши связанные герпеса (KSHV), этиологическим агентом связанные с КС, и ясно, что клеточные факторы должны взаимодействовать с вирусными факторами в процессе онкогенеза и опухолевой прогрессии. 6,7 Выявление новых хост-фактора детерминанты, которые способствуют KS патологии имеет важное значение для разработки прогностических маркеров для прогрессирования опухоли и метастазов, а также для разработки новых терапевтических средств для лечения KS 8. сопровождающих детали видео методы мы используем, чтобы идентифицировать клетки-хозяина экспрессии генов программ изменены в кожных капилляров эндотелиальные клетки (DMVEC) после заражения KSHV и в опухолевой ткани KS. 9 После дизрегуляции генов идентифицированы с помощью анализа микрочипов, изменения в экспрессии белка являются подтверждается иммуноблота и двойной помечены иммунофлюоресценции. Изменения в экспрессии транскрипционных генов дизрегуляции подтверждены в пробирке количественными реальном времени полимеразной цепной реакции (QRT-PCR). Проверка в пробирке результаты, используя архивные опухоли KS ткани, проводится методом двойной помечены иммунохимии и тканей микрочипов. 8,10 Наш подход к определению дизрегуляции генов в ткани опухоли микроокружения KS позволит развития в пробирке, а затем в естественных условиях модельных систем для обнаружение и оценка потенциальных терапевтических роман для лечения КС.

Protocol

1. KSVH Выращивание и Заражение DMVEC

  1. BCBL-1 клеточная линия, первоначально выделенные из человеческого тела полости основаны лимфома, культивируют в полной RPMI 1640 средств массовой информации (Gibco, Grand Island, NY). BCBL-1 клетки удаляются из жидкого азота, перевозимых на сухой лед, и быстро талых в течение 1 минуты при температуре 37 ° C. 50 мкл BCBL-1 клеток при плотности 1х10 4 клеток / мл добавляют 500 мл RPMI 1640 среде с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1x пенициллина / стрептомицина и распространяется в 175 колб см, при 50 мл / флакон .
  2. Колбы BCBL-1 Затем клетки инкубировали при 37 ° С в атмосфере 5% CO 2, пока плотность клеток достигла 3x106 кл / мл. Литические репликации вируса цикла индуцирована добавлением ТПА на 20ng / мл и натрия бутират на 0,3 нг / мл.
  3. Двадцать четыре часа клетки после индукции дважды промывают PBS pH7.4 в объеме 40 мл путем центрифугирования при 1500 оборотов в минуту в центрифуге Sorvall Легенда РТ (для удаления бутират), и индукции продолжается с ТПА при 20 нг / мл RPMI 1640 в течение 5 дней.
  4. Сотовые свободный вирус выделяют и концентрируют путем дифференциального центрифугирования. Короче говоря, клеток и клеточных обломков сначала осаждали при 10000 оборотов в минуту в Sorvall RC-6 Plus центрифуге при 4 ° С в течение 30 минут. Супернатант, содержащий вирус удаляется и бесклеточных вирус гранулированный в Beckman Coulter Optima L-90K ультрацентрифуге при 4 ° С в течение 1 часа при 25000 оборотах в минуту.
  5. Вирусов супернатант удаляют, а вирусные гранулы ресуспендировали в замораживании средств массовой информации (10% диметилсульфоксида и 90% эмбриональной телячьей сыворотки) и хранили при -80 ° C до необходимости.

    KSHV инфекции первичной DMVEC клеток.
  6. DMVEC клетки при прохождении 2-5 уровня высевают на начальной плотностью 1 X 10 5 в 100x20mm культуры тканей посуду или камеры слайды, и поддерживаются в полном EMB-2 средства массовой информации (Lonza, Базель, Швейцария) при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2. У 80% слияния, DMVEC инфицированных в МВД 0,01; макет инфицированных (СМИ только) клетки используются в качестве контрольных. Свежий СМИ добавляют к клеткам каждые 2 дня.
  7. DMVEC ячейки монослоев и камерные слайды рассматриваются в день в течение признаков инфекции как отмечает шпинделя формированию клеток. После первых признаках шпинделя формированию клеток (7-14 дней), мы прекратить СМИ изменений. Тем не менее, больше времени инкубации свыше 15-21 дней без предоставления свежей информации могут нарушить целостность DMVEC клетки в результате чего клетки умирают или отрывая культуры блюдо.
  8. В точке максимального тонкое и высокое дерево во время инфекции, клеточных монослоев собирают для подготовки клеточных гранулы для белок или РНК добычи. Зараженные DMVEC клеток на камеру слайдов дважды промывают 1 мл / окно с подогретого PBS рН 7,4. Ячейки камеры слайды собирают после мытья 2 раза с PBS рН 7,4. Позволило им полностью высохнуть, прежде чем снимать камерами и размещения слайдов в 100% метанола состоялась при температуре -20 ° С до необходимой для иммунофлуоресцентного окрашивания (IFA).

2. Всего изоляции РНК и производство кДНК из Мок и KSHV Зараженные DMVEC

  1. Всего РНК извлекается из KSHV-инфицированных DMVEC и издеваться над инфицированной клетки, используя Qiagen RNesay Mini Kit (Qiagen, Валенсия, Калифорния). Протокол производителя для обработки тканей животных используется, но без гомогенизации меры, если культивируемые клетки являются источником используется для изоляции РНК.
  2. Выберите опцию предлагают для лечения РНК с DNAseI на колонке с использованием Qiagen РНК свободной ДНКазы Kit, в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя, расположенного в приложении к инструкции по эксплуатации. DNAaseI унижает любого загрязнения геномной или вирусной ДНК от подготовки РНК. Лечение DNAseI имеет решающее значение для приложений вниз поток в том числе RT-PCR, QRT-PCR и микрочипов анализа.
  3. РНК промывается в соответствии с инструкциями и остаточного этанола в промывочный буфер удаляется путем центрифугирования столб больше времени, чем предложенные производителем. Остаточная этанола компромиссы чистоты РНК после элюирования.
  4. После последней промывки дополнительный шаг центрифугирование выполняется перед РНК может быть вымывают из колонки. РНК вымывается из колонки с 30 мкл РНКазы воду бесплатно. РНК затем количественно и проанализированы для чистоты на Eppendorf AG-6131 Bio-фотометр. Коэффициент оптического плотности (260/280 нм) должен быть between1.8-2.0, который является типичным для РНК высокой чистоты.
  5. Для анализа микрочипов, РНК анализируется на Agilent 2100 Bioanalyzer с использованием алгоритма RIN программного обеспечения. Анализ на bioanalyzer предоставляет Вам Количество РНК Целостность (РИН) от 1-10, однако РИН номера с 7-10, оказалось, выход последовательной и более надежные результаты для микрочипов или QRT-PCR анализа. Среднее число РИН для РНК IsolaТед с комплектом Qiagen RNAeasy в наших руках колеблется от 7.5-9.
  6. Количественное определение РНК достигается путем добавления 1 мкл РНК элюировали из колонки до 99 мкл 10 мМ Трис-ЭДТА рН 7,6. РНК и буфера смешивают с пипеткой и добавляется к чистой кюветы для спектрофотометрического анализа с Эппендорф Био-фотометр.
  7. РНК в один микрограмм каждого образца загрунтовать с использованием случайных гексамеров предоставленной производителем, до обратной транскрипции с высокой емкости кДНК комплект транскрипции обратном (Applied Biosystems, Foster City, CA.).


    синтеза кДНК

  8. Для синтеза одноцепочечной кДНК из общей РНК мы используем большой емкости кДНК Kit Транскрипция Обратный от Applied Biosystems и действовать в соответствии с инструкциями производителя.
  9. 2x Mix Master реагентов производится и от 0,5 до 1 мкг РНК в объеме 10 мкл добавляют 10 мкл 2x смесь реагентов мастера. В результате 1x решение осторожно перемешивают и обратной транскрипции осуществляется в BioRad MJ Mini-themal циклер в соответствии с инструкциями производителя.
  10. До двух мкг тотальной РНК может быть использована в 20 мкл реакции. КДНК количественно при 260 нм в Eppendorf AG-6131 Bio-фотометр и хранили при -80 ° С до необходимой для QRT-PCR.

3. Microarray Сравнительный анализ Мок и KSHV Зараженные клетки DMVEC

Наша лаборатория проводит анализ микрочипов в Университете Вандербильта медицинский центр Microarray Общие основных ресурсов Фонда на плату за услугу основе. Мы сравниваем выходных файлов для транскрипционной регуляции генов в KSHV инфицированные клетки DMVEC издеваться над инфицированными клетками контроля. Дизрегуляции транскрипции генов в KSHV инфицированных клеток, которые имеют отношение к ангиогенез, пролиферацию клеток, которые представляют или метастатического биомаркерами проверяются в пробирке использованием KSHV инфицированных DMVEC клеток с использованием ПЦР в реальном времени, западные помарки, и двойной IFA; результаты сравниваются с выводами в архивных опухоли KS ткани.

4. Количественный ПЦР-анализ транскрипции дизрегуляции генов, найденных в Макет и KSHV-инфицированных DMVEC

  1. ПЦР в реальном времени выполняется в 96-оптические пластины (Sorenson Bioscience, Inc) с помощью обратной транскриптазы порожденных кДНК, происходящих из образцов очищенной РНК и используя MyiQ Один цвет Real Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Калифорния) и 25 мкл реакции. Эта процедура проводится в кабинете биологической безопасности, чтобы избежать возможного загрязнения посторонними ДНК / кДНК, которые могут присутствовать в зале.
  2. Мастер смесь готовят в 1,5 мл трубы для каждого праймера набор (в соответствии с инструкциями производителя) с использованием SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) и отдельных прямого и обратного праймеров для каждого гена, при концентрации 250 нм на лунку, сделанные в РНКазой азы свободного H 2 O. Каждый образец должно быть сделано в трех экземплярах.
  3. Грунтовка последовательности для QRT-PCR для генов клетки-хозяина включают грунтовки последовательности для KSHV LANA, который является вирус задержка связана ядерного антигена, которая очень выраженное в KSHV инфицированных DMVEC клеток и KS опухолей.
  4. 10 нг / ул кДНК акций от макета инфицированных и инфицированных KSHV DMVEC клетки разводят 1:03 использовании РНКазой азы свободного H 2 O; 3μL этого разведения добавляли в каждую лунку. Управление скважин заменить воду для кДНК.
  5. 96 ячейках запечатывается с оптическим уплотнительная лента (Bio-Rad Laboratories), осторожно перемешивают и центрифугируют в течение 2 минут при 1000 оборотов в минуту, при комнатной температуре, чтобы собрать реакционной смеси в нижней части скважины. Bio-Rad MyiQ Система обнаружения и включения лампы в это время, чтобы обеспечить 10-минутной разминки перед началом запуска.
  6. Центрифугировали 96 ячейках, затем ввести в Bio-Rad M IQ Один цвет система реального времени обнаружения ПЦР, программа цикла последовательности вошел и спасен, и работать начали.
  7. Езда на велосипеде последовательность выглядит следующим образом: 95 ° C в течение 3 минут, 95 ° С в течение 15 секунд, 60 ° С в течение 1 минуты, 95 ° С в течение 1 минуты, 55 ° С в течение 1 минуты и 55 ° С в течение 30 секунд 81 циклов общего количества. Расплава кривой включены в эту программу в качестве проверки для грунтовки эффективности. Набор GAPDH грунтовки усиливается, и включены для нормализации.
  8. Анализ данных осуществляется с Bio-Rad iQ5 Оптическая версия программного обеспечения системы 2.

5. Двойной Маркированный иммунофлуоресценции Анализ KSHV Зараженные клетки DMVEC

  1. Палата слайдов (удаляются из камеры), содержащие как сливной зараженных и незараженных DMVEC дважды промывали PBS, рН 7,4, сушат на воздухе и фиксируется в -20 ° С предварительно охлажденное абсолютного метанола в течение 10 минут и выдерживают при температуре -20 ° С.
  2. Слайды с клетки-йан сушат на воздухе в течение 15 минут, и помещается в банку Коплин на льду содержащие трис физиологический раствор (0,05 М Трис рН 7,4) в течение 5 минут. Затем клетки инкубировали в течение 1 часа при температуре 37 ° С в увлажненной камере со смесью моноклональных антител к KSHV LANA на 1:50 разведением в PBS рН 7,4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA), а также козы поликлональных антител (1: 100 разведением в PBS рН 7,4) против белка хост фактор оказался dyregulated путем использования микрочипов KSHV инфицированных DMVEC клеток.
  3. Клетки затем промывают 3 раза с Трис солевой раствор (никогда не позволит клетки высыхают), а затем выдерживают в течение 30 минут смесь вторичных осла против мышиного IgG антитела, конъюгированного с родамин красный-X и осел по борьбе с козьим антителом, конъюгированным с FITC (Jackson ImmunoResearch, Запад-Гров, штат Пенсильвания), как на 1:100 разведения в PBS.
  4. Клетки позже мыть 3x в трис физиологического раствора в банке Коплин и в то время как слайды по-прежнему сыро, слайды монтируются с Vectashield монтажа средств массовой информации (Vector Laboratories, Burlingame, CA), содержащий 1,5 г / мл DAPI и покровное.
  5. Флуоресценция наблюдается и изображения сфотографироваться с Nikon TE 2000S флуоресцентный микроскоп с установленными на приборах с зарядовой связью (ПЗС) камеры. Фотографии, сделанные с использованием 20-кратным задачей общее увеличение 200x.
  6. Отдельные фотографии при том же увеличении используется для DAPI (200x), принимаются освещения usinge УФ, с зеленым фильтром для родамин и синего фильтров для FITC. Изображения впоследствии слилась использованием бесплатного программного обеспечения Nikon.

6. Двойной Маркированный Immunohistochemistry на Ks тканей и Microarrays Ks тканей для KSHV Лана и эндотелиальных маркеров сотовый Pecam-1/cd31

  1. Двойной помечены иммуногистохимии осуществляется с DAKO strepavidin ABC дуэт окрашивания комплект для KSHV LANA и те белки клетки-хозяина установлено, изменено после вирусной инфекции. IHC осуществляется на архивных СПИД-КС ткани фиксировали в формалине и заливали в парафин.
  2. Пять микрон разделы резать микротома и помещены на слайдах chemate до иммунной окраски.
  3. Парафин слайды deparaffinzed в ксилоле в течение 10 минут под вытяжным шкафом, а затем клетки обезвоживания в серии градуированных этанола на 100%, 95% и 70% в течение пяти минут каждый. Слайды затем помещаются в воде в течение 10 минут до разоблачения антигена (также известный как антиген поиска).
  4. Для иммунной, антиген разоблачения выполняется в микроволновой печи в 50 мМ цитрата буфера рН 6,0 при 95 ° С в течение 15 минут. Короче говоря, слайды, содержащие клетки погружены в 95 ° буфера цитрата С в течение 15 минут, затем сразу же поместить в дистиллированную воду при комнатной температуре.
  5. Тушение эндогенной пероксидазы осуществляется путем инкубации слайды на 30 минут в тушении решение. Короче говоря, добавить 47 мл 95% этанола, 50 мл коническую трубку, добавить 11,2 мл PBS, рН 7,4 и 1,8 мл 3% перекиси водорода на общую сумму 60 мл.
    Тушение решения осуществляется непосредственно перед использованием.
  6. Клетки затем промывают 3 раза в ФСБ рН 7,4 в течение 5 минут при комнатной температуре. Блокирующий раствор (12,5 мл 95% этанола, 1,4 мл нормальной козьей сывороткой, 140 мг бычьего сывороточного альбумина, и 2 капли Твин-20) получают для предотвращения неспецифического связывания антител. Место на лед перед использованием. (Это блокирующий раствор можно хранить при температуре 4 ° С, а на срок до 1 недели).
  7. Блокировка раствор добавляют к образцу на слайде, а затем покрыта полоса парафином (чтобы избежать высыхания образца) и помещен в увлажненной камере и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.
  8. Первичного моноклональных или поликлональных антител к вирусным антигеном готовится в блокировании решения в 1:50 разбавления, смешанного с пипеткой и помещали на лед, пока это необходимо. Пятьдесят до 100 мкл раствора антител будут необходимы в ткани образца в зависимости от размера образцов и количество слайдов.
  9. Сразу же после инкубации блокирование взбалтывают за пределы слайда и 50-100 мкл первичных антител добавляется в ткани образца, который затем покрывается полосой парафин. Образцы инкубировали в течение 1-2 часов во влажной камере при комнатной температуре.
  10. Слайды содержащие образцы затем промыть 3 раза в течение 5 минут каждый в ФСБ рН 7,4, к которой добавляется вторичный биотинилированного козьего анти-мышиного антитела в разведении 1:100 в PBS рН 7,4, и инкубировали во влажной камере при комнатной температуре в течение 30 - 45 минут.
  11. Примерно 30 минут перед использованием, пероксидазы сопряженным-strepavidin в ФСБ рН 7,4 готовят. Использование Дуэт Kit Cytomation DAKO, добавить 50 мкл раствора до 5 мл ФСБ рН 7,4, вихрь, а затем добавить 50 мкл раствора B и снова перемешать.
  12. После инкубации антител в шаге 6.10 в полной, слайды промываются 3 раза в ФСБ рН 7,4, а затем только что прepared пероксидазой хрена сопряженных-strepavidin решение и инкубируют при комнатной температуре в течение 30-45 минут во влажной камере.
  13. После инкубации слайды промываются 3 раза в ФСБ рН 7,4 при комнатной температуре. За пять минут до стиральной завершено, 3, 3-диамино-бензидин (DAB, SIGMA) раствора субстрата (20 мл ФСБ рН 7,4, 25 мкл 3% перекиси водорода и 1 таблетку DAB) получают. После таблетка DAB полностью растворяется, коричневато цветной раствор фильтруют через фильтр 0,45 шприц микрона. Фильтруется DAB решение будет добавлен в образцах после последней промывки и цвета развития KSHV LANA в инфицированных клетках наблюдается в режиме реального времени под освещение светлого использовании Nikon Eclipse E200 микроскоп. Как только нужный цвет развитие будет достигнуто, реакция гасится путем инкубации в дистиллированной воде в течение 5 минут.
  14. Для двойной помечены IHC, после инкубации в воде слайды содержащие образцы ставятся через IHC протокола во второй раз, начиная с шага антиген извлечения (6,4). Однако протокол изменений на шаг субстрата пероксидазы (6,11) тем, что вместо пероксидазой хрена сопряженных-strepavidin, щелочной фосфатазы strepavidin сопряженных работает
  15. Второй маркировки достигается за счет дополнительного шага поиска антигена в микроволновой печи, как описано выше, плюс второй иммуноокрашивания с моноклональными антителами к клеточным белком оказался дизрегуляции (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Клетки затем промывают, а затем инкубировали с биотинилированного козьего anti-mouse/rabbit IgG антитела (DAKO) в разведении 1:100 затем щелочной фосфатазы-strepavidin сопряженных (Vector Labs, Burlingame, CA) на 1:500 разбавления. Цвет развитие достигается путем инкубации клеток с красной подложкой вектора с использованием векторного Красной щелочной субстрат Комплект фосфат (Vector Laboratories, Burlingame, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Счетчик окрашивания, при желании, могут быть выполнены с orecin или гематоксилином. Ткань образцы затем крепиться с permount монтажа сред с покровного стекла. Изображения взяты под освещение светлого с Nikon TE-2000S микроскоп смонтированы с ПЗС-камерой.

7. Гена Доставка аденовирус трансдукции DMVEC Клетки

  1. Нормальные клетки DMVEC выращиваются в камере слайды на покрытие плотностью 2,5 X10 5 клеток на камеру ДМ-2 полный СМИ.
  2. DMVEC клетки выращивают до 80% слияния (с 3-5 дней), после чего 5 мкл / камера слайд окна аденовируса выражения EGFP в Титр 1X 10 10 частиц / мл.
  3. Живая DMVEC культурах клеток с аденовирус добавил были исследованы на EGFP флуоресценции 18 часов после добавления вируса.
  4. Индивидуальные фазы и флуоресцентные фотографии были сделаны на общее увеличение 200X и объединены на NIKON TE 2000S установлен флуоресцентный микроскоп с ПЗС-камерой.

8. Представитель Результаты

Рисунок 1
Рисунок 1. Первичная DMVEC клетки Lonza корпорации были сохранены в ДМ-2 средства массовой информации и были инфицированы BCBL-1 вирус на мои 0,01. После заражения монослоев DMVEC ячейки были рассмотрены в день. Через десять дней после заражения макет инфицированных клеток шоу-булыжник, как морфология и KSHV инфицированных клеток выставлены типа шпинделя морфологии клеток характеристика веретенообразную форму эндотелиальные клетки обнаружены инфицированные KSHV в ткани опухоли KS. Фотографии были сделаны с NIKON TE 2000S микроскоп смонтированы с ПЗС-камерой на общее увеличение 100X.

Рисунок 2
Рисунок 2. Двойной помечены непрямой иммунофлюоресценции окрашивание проводилось на KSHV инфицированных DMVEC клетки в 10 дней после инфекции. Зараженные клетки двойной окрашивали моноклональными антителами к KSHV LANA и коз поликлональных антител к специфическим белком клетки-хозяина оказались изменены после заражения KSHV. Смеси вторичного осла анти-мышь и осла анти-козьими антителами конъюгированных с FITC родамин и были добавлены. Клетки были рассмотрены с Nikon TE2000S флуоресцентный микроскоп оснащен ПЗС-камерой. Монтаж сред с DAPI используются для визуализации ядер. Все фотографии были сделаны на общее увеличение 200x. Инфицированной клетки выражения белка вируса LANA (родамин витражи), локализованных в ядре показывают снижение экспрессии клетки-хозяина специфического белка (FITC витражи), локализованных в цитоплазме.

Рисунок 3
Рисунок 3. IHC в KS опухолевой ткани для LANA и PECAM-1 / CD31. СПИДом KS опухолевую ткань окрашивали по одним и двумя помечены IHC для KSHV LANA и PECAM-1 / СD31. ) Показывает KS ткань окрашивали моноклональными антителами к LANA и контрастно гематоксилином. LANA положительных клеток определяются белыми стрелками. Б). К. С. ткань окрашивали моноклональными антителами к PECAMI/CD31 и окрашивание появляется специфичны для эндотелия вокруг сосудов изображены белые стрелки. С) Показывает KS ткани двойного окрашивают в течение LANA (вектор красный) и CD31 (коричневый) изображены черными стрелками для LANA белый для окрашивания клетки положительным для CD31. D) показывает нижнюю увеличением области из того же слайда в панели С. изображений Светлое фотографировались на микроскоп NIKON TE2000S на общее увеличение 600x 200x переменного тока и для группы D.

Рисунок 4
Рисунок 4. Временные выражение KSHV LANA по QRT-PCR 10 дней после инфекции по сравнению с макета инфицированных клеток контроля. Все значения для KSHV инфицированных клеток DMVEC нормированы на GAPDH. Существовал никаких доказательств LANA кДНК усиления в макет инфицированных клеток.

Рисунок 5
Рисунок 5. К. С. опухолевой ткани микрочипов. Микрочипов ткани (TMA) представляет собой 0,6 миллиметра ядра ткани выстроил на одном слайде. Каждая ткань ядро ​​представляет собой образец KS опухоли из другого пациента. ТМА стали доступны через образец со СПИДом Рак ресурсов (ASCR) от Леона Айерс-MD в Университете штата Огайо. Парафин KS опухолевой ткани, а также соответствует нормальным и позитивным тканей управления были размещены на стеклах. Образцы тканей KS были взяты из рта, кожи, мягкого неба, языка и шеи масс. У всех пациентов были ВИЧ-положительными.

Рисунок 6
Рисунок 6. Ткани окрашивали микрочипов для KSHV LANA по иммуногистохимии и анализировали с помощью микроскопии светлого. Цвет развития для LANA был проведен с DAB, как пероксидаза субстрата и LANA позитивные клетки визуализируется интенсивным коричневым окрашиванием. Различные количества вирусной нагрузки и регионов шпинделя ячейка может быть соблюдены. ) Представляет собой координационный вирусной инфекции в определенной области опухоли. В) представляет диссеминированной инфекции с высокой вирусной нагрузки, что примерно коррелирует с числом шпинделей клетки присутствуют. Витражи ядер ткани наблюдается при 200x увеличением.

Рисунок 7
Рисунок 7. DMVEC клетки культивируют в ДМ-2 полный СМИ при плотности 2,5 X10 5 клеток на лунку были трансдуцированных с 5 мкл аденовируса в Титр 1.0X10 10. Клетки были исследованы на EGFP флуоресценции 18 часа после трансдукции. Обе фазы и флуоресцентные изображения были взяты на микроскоп Nikon TE 2000S на общее увеличение 200X. Трансфекция первичных DMVEC клетках оказалось проблематично, поэтому мы выделили вирусные векторы, которые позволят нам предоставлять fibulin-2 и galetin-3 очень эффективно в начальной DMVEC. Мы обнаружили, что аденовирус выражения EGFP может эффективно преобразовывать первичные DMVEC. Мы также обнаружили, что лентивирусов вектор мы получили от Lentigen корпорация была одинаково эффективна для трансдуцирующих первичной DMVEC клеток (данные не приведены).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методологий, используемых в этом отчете могут быть выполнены в различных лабораторных условиях. Они требуют специального оборудования или доступ к основным объектов. Надлежащие меры предосторожности должны быть приняты при выполнении экспериментов инфекционных вирусных патогенов, как KSHV, которые могут потребовать использования уровня biosaftey 3 (BSL-3) объекты. Ткань приобретений также должны быть утверждены соответствующие институциональные наблюдательные советы (IRBs).

Эти методологии вместе могут обеспечить основу для определения генов, которые дизрегуляции в выражении в пробирке и обеспечить определенные методы для прижизненного проверки измененных профилей экспрессии генов, а также стратегий для доставки генов в клетках эндотелия. Эти данные в совокупности может помочь выяснить биохимических путей, которые подвергаются воздействию инфекции KSHV а впоследствии конкретных вирусных генов. Понимание того, как онкогенные вирусы, как KSHV прерывания конкретных молекулярных путей, может дать ответ в разработке новых методов лечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарим Джеймса К. Хилдрет, Мехарри медицинский колледж, за его советы и обзор этой рукописи. Мы также благодарим Диана Marver для редактирования рукописи. Эта работа была поддержана Мехарри Вандербильта Центр исследований СПИДа (NIH грант P30 AI054999-05); Центра исследований СПИДа неравенствам в отношении здоровья, NIH грант 5U54 RR019192-05; Мехарри Центра клинических исследований, грант NIH P20RR011792, а к NIH грант P01 CA113239. DJA частично финансировалась пилот гранты от Вандербильт-Мехарри Центра исследований СПИДа (CFAR) и Мехарри Центра клинических исследований (КПР).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Invitrogen 05-0001DJ
TPA Sigma-Aldrich P1585
PBS pH 7.4 Invitrogen 10010-023
Sodium butyrate Sigma-Aldrich 19364 (FLUKA)
EBM-2 media Lonza Inc. CC-3156 + bullet kits supplement
DMVEC cells (HMVEC) Lonza Inc. CC2543
Fetal calf serum Hyclone SH30066.03
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140-122
Chamber slides Nalge Nunc international 154461
KSHV LANA Mab Vector Laboratories VP-H913 1:50 dilution/IFA
Galectin-3 goat pAb R&D Systems AF1154
Donkey-anti-goat FITC Jackson ImmunoResearch 705-095-1
Donkey-anti-goat Rho Jackson ImmunoResearch 705-295-003 1:100 dilution/IFA
Mounting media Vector Laboratories H 1500 Vectashield with DAPI
BCA Protein Assay Kit Pierce, Thermo Scientific 23235
Nitrocellulose Bio-Rad 161-0112
Donkey-anti-goat-conj. Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC 2020
Western substrate Pierce, Thermo Scientific 34075
Biotin-rabbit-anti goat Dako 305-065-045
AP-Strepavidin conj. Dako K 0492 (kit)
RNase DNase Free Set Qiagen 79254
MJ Mini Cycler Bio-Rad PTC-1148C
Bio-Photometer Eppendorf 952000006
RC 6 Plus Centrifuge Sorvall, Thermo Scientific 46910
Coulter Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter Inc. 392052
MYiQ iCycler Real Time PCR Detection System Bio-Rad 170-9770
TE 2000S Fluorescent microscope Nikon Instruments TE2000S
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938C
Eclipse E 200 Nikon Instruments E 200
Sorvall Legend RT Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Inc. 75004377

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sitas, F., Newton, R. Kaposi's sarcoma in South Africa. J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).
  2. Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. Field's Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).
  3. Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles, D. M., Moore, P. S. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
  4. Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P., Said, J. W., Knowles, D. M., M, D. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N Engl J Med. 18, 1186-1191 (1995).
  5. Cesarman, E., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: a lymphotropic human herpesvirus associated with Kaposi's sarcoma, primary effusion lymphoma, and multicentric Castleman's disease. Semin Diagn Pathol. 14, 54-66 (1997).
  6. Chiou, C. J., Poole, L. J., Kim, P. S., Ciufo, D. M., Cannon, J. S., ap Rhys, C. M., Alcendor, D. J., Zong, J. C., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J Virol. 76, 3421-3439 (2002).
  7. Staskus, K. A., Zhong, W., Gebhard, K., Herndier, B., Wang, H., Renne, R., Beneke, J., Pudney, J., Anderson, D. J., Ganem, D., Haase, A. T., T, A. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus gene expression in endothelial (spindle) tumor cells. J Virol. 71, 715-719 (1997).
  8. Alcendor, D. J., Zhu, W. Q., Desai, P., Vigil, H. E., Hayward, G. S. KSHV downregulation of galectin-3 in kaposi's sarcoma. Glycobiology. , (2009).
  9. Ciufo, D. M., Cannon, J. S., Poole, L. J., Wu, F. Y., Murray, P., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Spindle cell conversion by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: formation of colonies and plaques with mixed lytic and latent gene expression in infected primary dermal microvascular endothelial cell cultures. J Virol. 75, 5614-5626 (2001).
  10. Long, E., Ilie, M., Hofman, V., Havet, K., Selva, E., Butori, C., Lacour, J. P., Nelson, A. M., Cathomas, G., Hofman, P. LANA-1, Bcl-2, Mcl-1 and HIF-1alpha protein expression in HIV-associated Kaposi sarcoma. Virchows Arch. 2, 159-170 (2009).

Tags

Иммунологии выпуск 43 вирусологии саркома Капоши микрочипы инфекции микроскопия
Определение дизрегуляции Гены индуцированные саркомы связанных герпеса Капоши (KSHV)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alcendor, D., Knobel, S. Identifying More

Alcendor, D., Knobel, S. Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV). J. Vis. Exp. (43), e2078, doi:10.3791/2078 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter