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Immunology and Infection

Dysregulated Kaposi है sarcoma-जुड़े herpesvirus (KSHV) द्वारा प्रेरित जीन की पहचान

Published: September 14, 2010 doi: 10.3791/2078
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology & Immunology and the Center for AIDS Health Disparities Research, Meharry Medical College

Summary

होस्ट सेल कारकों Kaposi है sarcoma (एस) की स्थापना और रखरखाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. हम तरीकों रूपरेखा करने के लिए मेजबान कोशिका KSHV से संक्रमित DMVEC कोशिकाओं में बदल कारकों की पहचान करने के लिए, और के एस ट्यूमर ऊतक में. सेलुलर वायरस से बदल जीन संभावित लक्ष्य (ओं) के रूप में उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के लिए की सेवा करेंगे.

Abstract

केएस वर्तमान में सबसे प्रमुख दक्षिणी अफ्रीका में एचआईवी / एड्स से संबंधित द्रोह है और इसलिए दुनिया 1,2 यह संवहनी endothelial कोशिकाओं की एक angioproliferative ट्यूमर के रूप में विशेषता है और फुफ्फुस बहाव lymphomas के रूप में दुर्लभ बी सेल lymphoproliferative रोग (PEL ) का उत्पादन और बहु है Castleman रोग के कुछ रूपों. 3-5 केएस में केवल 1-5% कक्षों की सक्रिय Kaposi है sarcoma जुड़े (KSHV) herpesvirus, etiological के एस के साथ जुड़े एजेंट के lytic प्रतिकृति का समर्थन घावों, और यह स्पष्ट है कि सेलुलर कारकों चाहिए oncogenesis और ट्यूमर प्रगति की प्रक्रिया में वायरल कारकों के साथ बातचीत 6,7 पहचान उपन्यास मेजबान कारक निर्धारकों जो केएस विकृति के लिए योगदान के रूप में अच्छी तरह के एस के उपचार के लिए उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए ट्यूमर प्रगति और मेटास्टेसिस के लिए शकुन मार्करों के विकास के लिए आवश्यक है. 8 साथ वीडियो विवरण तरीकों हम मेजबान कोशिका जीन अभिव्यक्ति KSHV संक्रमण के बाद और केएस ट्यूमर ऊतक में त्वचीय microvascular endothelial कोशिकाओं (DMVEC) में बदल कार्यक्रमों की पहचान का उपयोग. 9 एक बार dysregulated जीन माइक्रोएरे विश्लेषण द्वारा की पहचान कर रहे हैं, प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन कर रहे हैं immunoblot और दोहरी लेबल immunofluorescence द्वारा की पुष्टि की. Dysregulated जीनों के transcriptional अभिव्यक्ति में परिवर्तन इन विट्रो में मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (QRT पीसीआर) के द्वारा पुष्टि कर रहे हैं . इन विट्रो अभिलेखीय केएस ट्यूमर ऊतक का उपयोग कर निष्कर्ष में की मान्यता भी दोहरी लेबल immunochemistry और ऊतक प्रोटीन के द्वारा किया जाता है 8,10 हमारा दृष्टिकोण केएस ट्यूमर के ऊतक microenvironment में dysregulated जीन की पहचान के विकास के लिए इन विट्रो में और बाद में vivo मॉडल प्रणाली में की अनुमति देगा. और के एस के इलाज के लिए संभावित उपन्यास चिकित्सात्मक की खोज और मूल्यांकन.

Protocol

1. KSVH और DMVEC की खेती और संक्रमण

  1. BCBL-1 कोशिका लाइन, एक मानव शरीर गुहा आधारित लिंफोमा मूल रूप से अलग, पूरा RPMI 1640 मीडिया (Gibco, ग्रांड द्वीप, NY) में सभ्य है. BCBL-1 कोशिकाओं तरल नाइट्रोजन से हटा रहे हैं, सूखी बर्फ पर ले जाया, और 37 पर जल्दी से 1 मिनट के लिए thawed डिग्री सेल्सियस BCBL 1-कोशिकाओं के घनत्व 1x10 4 कोशिकाओं / एमएल पर एक 50 μL विभाज्य RPMI 1640 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक है और 175 सेमी बोतल में वितरित मीडिया के 500 एमएल के 50 एमएल / फ्लास्क में जोड़ा जाता है , .
  2. BCBL 1-कोशिकाओं की बोतल तो 37 में incubated हैं ° सी 5% सीओ 2 के माहौल में जब तक सेल घनत्व 3x106 कोशिकाओं / एमएल पहुंचे . Lytic चक्र वायरस प्रतिकृति 0.3 एनजी / एमएल / 20ng एमएल और सोडियम butyrate में टीपीए जोड़कर प्रेरित है.
  3. चौबीस घंटे पोस्ट प्रेरण कोशिकाओं दो बार pH7.4 पीबीएस में धो रहे हैं एक Sorvall लीजेंड आरटी अपकेंद्रित्र में 1500 आरपीएम (butyrate निकालने के लिए) पर centrifugation द्वारा 40 एमएल मात्रा में और प्रेरण टीपीए के साथ 20 एनजी / एमएल पर जारी है अधिक 5 दिनों के लिए 1640 RPMI.
  4. सेल मुक्त वायरस पृथक और अंतर centrifugation द्वारा ध्यान केंद्रित है. संक्षेप में, कोशिकाओं और सेल मलबे 10,000 rpm पर 30 मिनट के लिए पहली बार pelleted एक Sorvall RC-6 प्लस अपकेंद्रित्र 4 ° सी में हैं. वायरस युक्त सतह पर तैरनेवाला हटा दिया है और सेल मुक्त वायरस pelleted के Beckman कल्टर ऑप्टिमा एल 90K ultracentrifuge में 4 ° C में 25,000 rpm पर 1 घंटे के लिए.
  5. वायरस - मुक्त सतह पर तैरनेवाला निकाल दिया है और वायरल गोली ठंड मीडिया में resuspended की (10% डाइमिथाइल sulfoxide और 90% भ्रूण बछड़ा सीरम) और -80 पर संग्रहीत डिग्री सेल्सियस जब तक आवश्यक है.

    KSHV प्राथमिक DMVEC कोशिकाओं के संक्रमण.
  6. बीतने के स्तर 2-5 पर DMVEC कोशिकाओं 1 एक्स 10 100x20mm टिशू कल्चर व्यंजन या कक्ष स्लाइड्स में 5 के एक प्रारंभिक घनत्व पर चढ़ाया जाता है, और 37 पर पूरा EMB-2 मीडिया में बनाए रखा (Lonza, बेसल, स्विट्जरलैंड) ° C एक में 5% के वातावरण CO 2. 80% के संगम पर, DMVEC .01 के moi में संक्रमित कर रहे हैं, नकली संक्रमित कोशिकाओं (केवल मीडिया) के नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है. ताजा मीडिया कोशिकाओं को हर 2 दिनों जोड़ा जाता है.
  7. DMVEC सेल monolayers और चैम्बर स्लाइड्स दैनिक संक्रमण के सबूत के रूप में धुरी सेल के गठन द्वारा नोट के लिए जांच कर रहे हैं. (7-14 दिन) धुरी सेल के गठन का पहला संकेत के बाद हम मीडिया परिवर्तन को बंद. हालांकि, अब ताजा मीडिया को उपलब्ध कराने के बिना 15-21 दिनों से अधिक में ऊष्मायन बार DMVEC मरने या बंद उठाने संस्कृति डिश कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं की अखंडता के साथ समझौता कर सकते हैं.
  8. संक्रमण के दौरान अधिक से अधिक उंचा और पतला के बिंदु पर, सेल monolayers प्रोटीन या शाही सेना निकासी के लिए सेल छर्रों की तैयारी के लिए harvested रहे हैं. चैम्बर स्लाइड्स पर संक्रमित DMVEC कोशिकाओं में दो बार 1 / पूर्व गर्म पीबीएस पीएच 7.4 के साथ एमएल खिड़की के साथ धो रहे हैं. चैम्बर स्लाइड्स पर कक्ष पीबीएस पीएच 7.4 के साथ 2X धोने के बाद काटा जाता है. उन कक्षों को हटाने और -20 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित जब तक immunofluorescent धुंधला (यूके) के लिए आवश्यक 100% मेथनॉल में स्लाइड्स रखने से पहले पूरी तरह से सूखे के लिए अनुमति दी.

2. कुल शाही सेना अलगाव और नकली और KSHV संक्रमित DMVEC से सीडीएनए का उत्पादन

  1. कुल शाही सेना KSHV से संक्रमित DMVEC और नकली संक्रमित कोशिकाओं Qiagen RNesay मिनी किट (Qiagen, वालेंसिया, सीए) का उपयोग से निकाला जाता है. पशु ऊतक प्रसंस्करण के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल पर homogenization कदम के बिना कार्यरत है, अगर संवर्धित कोशिकाओं शाही सेना के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया स्रोत हैं.
  2. Qiagen आरएनए मुक्त DNase किट का उपयोग कर स्तंभ पर DNAseI के साथ शाही सेना के इलाज की पेशकश अनुदेश मैनुअल के परिशिष्ट में स्थित निर्माता की सिफारिशों के अनुसार, इस विकल्प का चयन करें. DNAaseI किसी भी contaminating या शाही सेना तैयारी से वायरल डीएनए जीनोमिक degrades. DNAseI उपचार RT-पीसीआर, QRT-पीसीआर और माइक्रोएरे विश्लेषण सहित डाउन स्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है.
  3. शाही सेना निर्देश और बफर धोने में कोई अवशिष्ट इथेनॉल स्तंभ एक अधिक समय से निर्माता द्वारा सुझाए centrifuging द्वारा हटा दिया है के अनुसार धोया जाता है. अवशिष्ट इथेनॉल elution के बाद शाही सेना की शुद्धता समझौता.
  4. अंतिम धोने के बाद एक अतिरिक्त centrifugation कदम पहले शाही सेना स्तंभ से eluted किया जा सकता है है किया जाता है. शाही सेना RNase मुफ्त पानी के 30 μL के साथ स्तंभ से eluted है. शाही सेना और फिर मात्रा निर्धारित है एक Eppendorf एजी-6131 बायो - photometer पर शुद्धता के लिए विश्लेषण. ऑप्टिकल घनत्व अनुपात (260/280 एनएम) between1.8-2.0 जो उच्च शुद्धता की शाही सेना के लिए विशिष्ट है होना चाहिए.
  5. माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए, शाही सेना एक Agilent Bioanalyzer 2100 पर RIN सॉफ्टवेयर एल्गोरिथ्म का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया है. bioanalyzer पर विश्लेषण आप 1-10 से एक शाही सेना वफ़ादारी संख्या (RIN) के साथ प्रदान करता है, लेकिन 7-10 से RIN संख्या माइक्रोएरे या QRT-पीसीआर विश्लेषण के लिए लगातार और अधिक विश्वसनीय परिणाम साबित किया है. के लिए औसत RIN संख्या आरएनए इसोलाहमारे हाथ में Qiagen RNAeasy किट के साथ टेड 7.5-9 से पर्वतमाला.
  6. शाही सेना के quantitation स्तंभ से 10mm Tris EDTA पीएच 7.6 99 μL eluted शाही सेना के 1 μL जोड़कर हासिल की है. शाही सेना और बफर एक विंदुक के साथ मिश्रित है और एक Eppendorf जैव - photometer के साथ spectrophotometric विश्लेषण के लिए एक साफ क्युवेट जोड़ा.
  7. दूत शाही सेना प्रत्येक नमूने की एक माइक्रोग्राम में यादृच्छिक hexamers निर्माता द्वारा प्रदान का उपयोग करने के लिए primed है, पूर्व के लिए एक उच्च क्षमता सीडीएनए रिवर्स प्रतिलेखन किट (एप्लाइड Biosystems, फोस्टर शहर, सीए.) के साथ प्रतिलेखन रिवर्स.


    सीडीएनए संश्लेषण

  8. Synthesize करने के लिए एकल कुल शाही सेना से हम एक उच्च क्षमता एप्लाइड Biosystems से सीडीएनए रिवर्स प्रतिलेखन किट का उपयोग करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार आगे बढ़ना सीडीएनए फंसे.
  9. अभिकर्मकों की एक 2x मास्टर मिश्रण बनाया है और 10 μL की मात्रा में 0.5 से 1 शाही सेना के μg 2x मास्टर अभिकर्मक मिश्रण के 10 μL जोड़ा जाता है. परिणामस्वरूप 1x समाधान धीरे मिलाया जाता है और रिवर्स प्रतिलेखन BIORAD एम.जे. मिनी themal cycler में निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया जाता है.
  10. कुल शाही सेना के दो micrograms प्रति 20 μL प्रतिक्रिया इस्तेमाल किया जा सकता है. सीडीएनए एक Eppendorf एजी 6131 बायो - photometer में 260 एनएम quantitated है, और -80 पर संग्रहीत ° जब तक सी QRT-पीसीआर के लिए की जरूरत है.

3. माइक्रोएरे नकली और KSHV संक्रमित DMVEC कक्ष का तुलनात्मक विश्लेषण

हमारी प्रयोगशाला Vanderbilt विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर माइक्रोएरे एक शुल्क के लिए सेवा के आधार पर साझा संसाधन कोर सुविधा पर माइक्रोएरे विश्लेषण करता है. हम KSHV संक्रमित DMVEC संक्रमित नियंत्रण कक्ष नकली कोशिकाओं में जीन के transcriptional dysregulation के लिए आउटपुट फाइल की तुलना करें. KSHV संक्रमित कोशिकाओं में transcriptional dysregulated जीन है कि angiogenesis, सेल प्रसार के लिए प्रासंगिक हैं या कि metastatic बायोमार्कर का प्रतिनिधित्व इन विट्रो KSHV संक्रमित DMVEC वास्तविक समय पीसीआर, पश्चिमी blots, और दोहरी आइएफए का उपयोग कर कोशिकाओं का उपयोग करने में मान्य हैं, परिणाम अभिलेखीय केएस ट्यूमर में निष्कर्षों की तुलना में कर रहे हैं ऊतक.

4. मात्रात्मक RT-पीसीआर transcriptional विश्लेषण dysregulated जीन नकली और KSHV से संक्रमित DMVEC में मिला

  1. वास्तविक समय पीसीआर 96 अच्छी तरह से ऑप्टिकल प्लेटें (Sorenson बायोसाइंस, इंक) में किया जाता है, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस एक शुद्ध शाही सेना नमूना से उद्भव और एक एकल रंग MyiQ रीयल टाइम पीसीआर जांच प्रणाली (जैव रेड प्रयोगशालाओं, हरक्यूलिस, सीए) का उपयोग सीडीएनए उत्पन्न और का उपयोग 25 μL प्रतिक्रिया संस्करणों. यह प्रक्रिया एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाता है बाहरी डीएनए / सीडीएनए उस कमरे में मौजूद हो सकता है के द्वारा संभव संक्रमण से बचने के लिए.
  2. एक मास्टर मिश्रण प्रत्येक प्राइमर सेट के लिए 1.5 एमएल ट्यूब (निर्माता के निर्देशों के अनुसार) SYBR ग्रीन Supermix (जैव रेड प्रयोगशालाओं, हरक्यूलिस, सीए) और आगे चयनित और ब्याज की प्रत्येक जीन के लिए रिवर्स प्राइमरों का उपयोग में तैयार की एकाग्रता पर, अच्छी तरह से प्रति 250 एनएम, RNAase DNAase मुफ्त एच 2 ओ में बनाया प्रत्येक नमूना तीन प्रतियों में किया जाना चाहिए.
  3. मेजबान कोशिका के जीन के लिए QRT-पीसीआर के लिए प्राइमर अनुक्रम KSHV लाना है, जो वायरस परमाणु प्रतिजन जुड़े विलंबता है कि अत्यधिक KSHV संक्रमित DMVEC कोशिकाओं और के एस ट्यूमर में व्यक्त किया है है के लिए प्राइमर दृश्यों में शामिल हैं.
  4. 10 एनजी / उल शेयर cDNAs नकली संक्रमित और KSHV संक्रमित DMVEC कोशिकाओं से 01:03 RNAase DNAase मुफ्त एच 2 हे का उपयोग कर पतला कर रहे हैं, 3μL इस कमजोर पड़ने से प्रत्येक में अच्छी तरह से जोड़ा जाता है. सीडीएनए के लिए नियंत्रण कुओं स्थानापन्न पानी.
  5. 96 अच्छी तरह से थाली ऑप्टिकल सील टेप (बायो - रेड प्रयोगशालाओं) के साथ बंद है, धीरे मिश्रित और 1000 आरपीएम, कमरे के तापमान, कुओं के नीचे प्रतिक्रिया मिश्रण जमा पर 2 मिनट के लिए centrifuged. जैव रेड MyiQ जांच प्रणाली और दीपक पर इस समय चालू है चलाने के लिए शुरू करने से पहले एक 10 मिनट की अवधि के वार्म अप के लिए अनुमति देने के लिए.
  6. centrifuged 96 अच्छी तरह से थाली तो एक जैव रेड एम बुद्धि एकल रंग रीयल टाइम पीसीआर जांच प्रणाली में डाल दिया है, चक्र दृश्यों के कार्यक्रम में प्रवेश किया और बचाया, और चलाने शुरू कर दिया.
  7. साइकिल चालन के अनुक्रम के रूप में इस प्रकार है: 95 ° सी 3 मिनट के लिए, 95 ° सी 15 सेकंड के लिए, 60 ° सी 1 मिनट के लिए, 95 ° सी 1 मिनट के लिए, 55 ° सी 1 मिनट और 55 के लिए डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड के लिए के लिए कुल 81 चक्र. एक पिघल वक्र प्राइमर दक्षता के लिए एक चेक के रूप में इस कार्यक्रम में शामिल है. एक GAPDH प्राइमर सेट परिलक्षित है, और सामान्य के लिए शामिल है.
  8. डेटा विश्लेषण जैव रेड iQ5 ऑप्टिकल सिस्टम सॉफ्टवेयर संस्करण 2 के साथ किया जाता है.

5. दोहरी KSHV संक्रमित DMVEC कक्ष के immunofluorescence विश्लेषण लेबल

  1. दोनों मिला हुआ संक्रमित और uninfected DMVEC युक्त चैंबर स्लाइड्स (कक्षों से हटा) पीबीएस पीएच 7.4 के साथ दो बार धो रहे हैं, हवा में सूखे, और -20 डिग्री सेल्सियस पूर्व 10 मिनट के लिए ठंडा निरपेक्ष मेथनॉल में तय है और -20 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित
  2. कोशिकाओं के साथ स्लाइड वें रहे हैंएन हवा 15 मिनट के लिए सूखे, और Tris खारा (0.05M Tris पीएच 7.4) युक्त 5 मिनट के लिए बर्फ पर एक Coplin जार में रखा. कक्ष फिर 37 पर 1 घंटे के लिए incubated ° सी पीबीएस पीएच 7.4 में 1:50 कमजोर पड़ने (वेक्टर प्रयोगशालाओं, Burlingame, CA) प्लस एक बकरी पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (1 KSHV लाना मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का एक मिश्रण के साथ एक humidified कक्ष में: पीबीएस पीएच 7.4 में KSHV संक्रमित DMVEC कोशिकाओं का उपयोग माइक्रोएरे द्वारा dyregulated हो पाया मेजबान कारक प्रोटीन के खिलाफ 100) कमजोर पड़ने.
  3. कोशिकाओं तो Tris खारा (कोशिकाओं को बाहर शुष्क करने की अनुमति कभी नहीं) के साथ 3x धोया और फिर एक माध्यमिक गधा विरोधी माउस आईजीजी rhodamine लाल एक्स और गधा विरोधी बकरी एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित एंटीबॉडी का एक मिश्रण के साथ 30 मिनट के लिए संयुग्मित के लिए incubated FITC (जैक्सन ImmunoResearch, पश्चिम Grove, PA), पीबीएस में 1:100 कमजोर पड़ने पर दोनों.
  4. कोशिकाओं बाद Tris खारा में कर रहे हैं 3x और एक Coplin जार में धोया है जबकि स्लाइड्स अभी भी नम हैं, स्लाइड Vectashield बढ़ते मीडिया (वेक्टर प्रयोगशालाओं, Burlingame, CA) 1.5 ग्राम / एमएल DAPI और coverslip युक्त के साथ बढ़ रहे हैं.
  5. प्रतिदीप्ति मनाया और एक Nikon ते 2000s फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के साथ फोटो खिंचवाने छवियों एक आरोप डिवाइस युग्मित कैमरा (सीसीडी) के साथ मुहिम शुरू की. फोटो 200x की कुल आवर्धन के लिए एक 20x उद्देश्य का उपयोग कर लिया जाता है.
  6. ही DAPI (200x) के लिए प्रयोग किया जाता बढ़ाई अलग तस्वीरें, usinge यूवी रोशनी rhodamine के लिए एक हरे रंग फिल्टर और FITC के लिए एक नीले रंग फिल्टर के साथ लिया जाता है. छवियों के बाद Nikon फ्रीवेयर सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए विलय कर रहे हैं.

6. KSHV लाना और Endothelial सेल मार्कर Pecam-1/cd31 के लिए दोहरी एस ऊतक और एस ऊतक प्रोटीन पर लेबल immunohistochemistry

  1. दोहरी लेबल immunohistochemistry DAKO strepavidin KSHV लाना और उन मेजबान सेल वायरस के संक्रमण के बाद बदल पाया प्रोटीन के लिए एबीसी युगल धुंधला किट के साथ किया जाता है. आईएचसी अभिलेखीय एड्स केएस formalin में तय ऊतक पर किया जाता है, और पैराफिन में एम्बेडेड है.
  2. पांच माइक्रोन एक सूक्ष्म तक्षणी वर्गों के साथ काट रहे हैं और पहले immunostaining chemate स्लाइड्स पर रखा.
  3. आयल एम्बेडेड स्लाइड एक धूआं हुड के नीचे 10 मिनट के लिए xylene में deparaffinzed हैं, और फिर कोशिकाओं को 100%, 95%, और पांच मिनट के लिए 70% की एक वर्गीकृत श्रृंखला में इथेनॉल हाइड्रेटेड हैं. स्लाइड्स तो प्रतिजन अनमास्किंग (भी प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के रूप में जाना जाता है) के लिए पहले 10 मिनट के लिए पानी में रखा.
  4. Immunostaining के लिए, प्रतिजन अनमास्किंग एक माइक्रोवेव ओवन में 15 मिनट के लिए 50 मिमी साइट्रेट पीएच 6.0 95 ° C पर बफर में किया जाता है. संक्षेप में, युक्त कोशिकाओं में 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस साइट्रेट बफर जलमग्न कर रहे हैं, तो तुरंत कमरे के तापमान पर आयोजित आसुत पानी में रखा स्लाइड.
  5. अंतर्जात peroxidase के शमन एक शमन समाधान में 30 मिनट के लिए स्लाइड्स incubating द्वारा किया जाता है. संक्षेप में, एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 95% के लिए इथेनॉल के 47 एमएल जोड़ने, 11.2 एमएल पीबीएस पीएच 7.4 और 60 एमएल की कुल के लिए 1.8 एमएल 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के जोड़.
    शमन समाधान सिर्फ पहले उपयोग करने के लिए किया जाता है.
  6. कोशिकाओं तो पीबीएस पीएच 7.4 में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 3x धोया. एक अवरुद्ध समाधान (95% इथेनॉल के 12.5 एमएल, सामान्य बकरी सीरम की 1.4 एमएल, 140 मिलीग्राम गोजातीय सीरम albumin, और 2 बीच 20 बूँदें) एंटीबॉडी के nonspecific बंधन को रोकने के लिए तैयार है. उपयोग करने से पहले बर्फ पर रखें. (यह अवरुद्ध समाधान 4 डिग्री सेल्सियस और 1 सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है).
  7. समाधान अवरुद्ध स्लाइड पर नमूना में जोड़ा जाता है और है तो आयल की एक स्ट्रिप (नमूना के बाहर सुखाने से बचने के) के साथ कवर किया और humidified कक्ष में रखा और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए incubated.
  8. एक कमजोर पड़ने 1:50 पर समाधान अवरुद्ध में प्राथमिक मोनोक्लोनल या पॉलीक्लोनल वायरल प्रतिजन एंटीबॉडी तैयार है, एक विंदुक के साथ मिश्रित और बर्फ पर रखा जब तक जरूरत है. एंटीबॉडी समाधान के पचास से 100 μL प्रति ऊतक नमूनों के आकार और स्लाइड्स की संख्या के आधार पर नमूना की जरूरत होगी.
  9. तुरंत ऊष्मायन के बाद अवरुद्ध समाधान बंद स्लाइड हिल रहा है और प्राथमिक एंटीबॉडी के 50-100 μL ऊतक नमूना है जो तब आयल की एक स्ट्रिप के साथ कवर किया जाता है करने के लिए जोड़ा जाता है. नमूने 1-2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक humidified कक्ष में incubated हैं.
  10. नमूनों युक्त स्लाइड्स तो 5 मिनट पीबीएस पीएच 7.4 में प्रत्येक के लिए जो पीबीएस पीएच 7.4 में एक 1:100 कमजोर पड़ने पर एक माध्यमिक biotinylated बकरी प्रतिरक्षी विरोधी माउस जोड़ा है, और 30 के लिए एक कमरे के तापमान पर humidified कक्ष में incubated के लिए 3x धो - 45 मिनट.
  11. लगभग 30 मिनट का उपयोग करने से पहले, पीबीएस पीएच 7.4 में संयुग्मित - strepavidin peroxidase तैयार है. DAKO Cytomation युगल किट का प्रयोग, समाधान का 50 μL जोड़ने पीबीएस 7.4 पीएच, भंवर, 5 एमएल और फिर समाधान बी के 50 μL जोड़ने के लिए और फिर मिश्रण.
  12. कदम 6.10 में पूरा में एंटीबॉडी ऊष्मायन के बाद, स्लाइड पीबीएस पीएच 7.4 में 3x धो रहे हैं और उसके बाद हौसले जनसंपर्कepared हॉर्सरैडिश peroxidase संयुग्मित - strepavidin समाधान जोड़ा है और एक humidified कक्ष में 30-45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubated.
  13. ऊष्मायन के बाद, स्लाइड पीबीएस पीएच 7.4 में 3x कमरे के तापमान पर धो रहे हैं. धोने से पहले पांच मिनट पूरा हो गया है, 3, 3 diamino benzidine (थपका, सिग्मा) (पीबीएस पीएच 7.4, 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 25 μL और 1 थपका गोली के 20 एमएल) सब्सट्रेट समाधान है तैयार. थपका गोली के बाद पूरी तरह भंग है, भूरा रंग का समाधान एक .45 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर्ड है. फ़िल्टर थपका समाधान तो नमूनों के लिए जोड़ा जाता है के बाद अंतिम धोने और संक्रमित कोशिकाओं में रंग विकास KSHV लाना के लिए वास्तविक समय में brightfield एक Nikon ग्रहण E200 माइक्रोस्कोप का उपयोग कर रोशनी के तहत मनाया जाता है. एक बार इच्छित रंग विकास हासिल की है, प्रतिक्रिया आसुत जल में ऊष्मायन से 5 मिनट के लिए बुझती है.
  14. दोहरी लेबल आईएचसी के लिए पानी में ऊष्मायन के बाद नमूनों युक्त स्लाइड्स आईएचसी प्रोटोकॉल के माध्यम से एक दूसरे प्रतिजन पुनर्प्राप्ति कदम (6.4) में प्रारंभ समय के लिए डाल रहे हैं. हालांकि peroxidase सब्सट्रेट कदम (6.11) में प्रोटोकॉल परिवर्तन कि हॉर्सरैडिश peroxidase की बजाय संयुग्मित strepavidin, एक alkaline फॉस्फेट strepavidin संयुग्म कार्यरत है
  15. दूसरा लेबलिंग माइक्रोवेव में एक अतिरिक्त प्रतिजन पुनर्प्राप्ति कदम के रूप में ऊपर वर्णित से अधिक सेलुलर dysregulated (वेक्टर प्रयोगशालाओं, Burlingame, CA) पाया प्रोटीन के लिए एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ एक दूसरे immunostaining से हासिल की है. कक्ष बाद में धो रहे हैं, और फिर एक 1:100 एक alkaline फॉस्फेट 1:500 कमजोर पड़ने पर strepavidin संयुग्म (वेक्टर लैब्स, Burlingame, CA) द्वारा पीछा कमजोर पड़ने पर biotinylated बकरी anti-mouse/rabbit आईजीजी प्रतिरक्षी (DAKO) के साथ incubated. रंग विकास incubating कोशिकाओं द्वारा सब्सट्रेट वेक्टर लाल निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वेक्टर लाल alkaline फॉस्फेट सब्सट्रेट किट (वेक्टर प्रयोगशालाओं, Burlingame, CA) का उपयोग कर के साथ हासिल की है. काउंटर धुंधला हो जाना, अगर वांछित, orecin या hematoxylin के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है. ऊतक नमूनों तो स्थायी रूप से कर रहे हैं एक कवर गिलास के साथ permount बढ़ते मीडिया के साथ मुहिम शुरू की. छवियाँ brightfield रोशनी के तहत एक Nikon ते -2000 एक सीसीडी कैमरे के साथ घुड़सवार माइक्रोस्कोप के साथ लिया जाता है.

7. DMVEC प्रकोष्ठों के Adenovirus transduction द्वारा जीन डिलीवरी

  1. सामान्य DMVEC कोशिकाओं चैम्बर स्लाइड्स में घनत्व प्रति कक्ष EBM-2 पूरा मीडिया 2.5 X10 5 कोशिकाओं के चढ़ाना पर खेती कर रहे हैं.
  2. DMVEC कोशिकाओं को 80% (3-5 दिनों लेने) संगम जिसके बाद 5 / ul adenovirus व्यक्त EGFP की एक टिटर 1X पर चैम्बर स्लाइड विंडो 10 10 कण / एमएल. बड़े हो रहे हैं
  3. DMVEC सेल संस्कृतियों Live के साथ Adenovirus जोड़ी EGFP प्रतिदीप्ति 18 घंटे के लिए वायरस जोड़ने के बाद जांच की गई.
  4. व्यक्तिगत चरण और फ्लोरोसेंट तस्वीरें 200X की कुल बढ़ाई ले जाया गया और एक NIKON ते 2000s फ्लोरोसेंट एक सीसीडी कैमरे के साथ घुड़सवार माइक्रोस्कोप पर विलय.

8. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
चित्रा 1. Lonza निगम से प्राथमिक DMVEC कोशिकाओं EBM-2 मीडिया में बनाए रखा गया और थे .01 के moi. BCBL-1 वायरस से संक्रमित के बाद संक्रमण DMVEC सेल monolayers दैनिक जांच की गई. दस दिनों के बाद संक्रमण नकली संक्रमित कोशिकाओं दिखाने एक cobblestone KSHV आकारिकी और संक्रमित कोशिकाओं की तरह एक धुरी धुरी आकार endothelial कोशिकाओं के सेल प्रकार आकारिकी विशेषता प्रदर्शन के एस ट्यूमर ऊतक में KSHV से संक्रमित पाया गया. फोटो NIKON ते 2000s 100X का कुल आवर्धन पर एक सीसीडी कैमरे के साथ घुड़सवार माइक्रोस्कोप के साथ ले जाया गया.

चित्रा 2
चित्रा 2. दोहरी लेबल अप्रत्यक्ष immunofluorescence धुंधला KSHV 10 दिनों के बाद संक्रमण पर संक्रमित DMVEC कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया था संक्रमित कोशिकाओं KSHV लाना करने के लिए एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और एक बकरी एक विशिष्ट मेजबान कोशिका प्रोटीन KSHV संक्रमण के बाद बदला जा पाया पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के साथ दोहरी दाग थे . माध्यमिक विरोधी माउस गधा और गधा विरोधी बकरी rhodamine और FITC संयुग्मित एंटीबॉडी का एक मिश्रण जोड़ा गया था. कक्ष एक Nikon TE2000S फ्लोरोसेंट खुर्दबीन एक सीसीडी कैमरे के साथ फिट के साथ जांच की गई. DAPI साथ बढ़ते मीडिया नाभिक कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. सभी तस्वीरें 200x की कुल बढ़ाई ले जाया गया. संक्रमित वायरस लाना प्रोटीन (दाग rhodamine) नाभिक के लिए स्थानीयकृत व्यक्त सेल मेजबान सेल विशिष्ट प्रोटीन (दाग FITC) cytoplasm के लिए स्थानीयकृत कम अभिव्यक्ति दिखाओ.

चित्रा 3
चित्रा 3. केएस ट्यूमर के ऊतक में आईएचसी लाना और PECAM-1 / CD31 के लिए एड्स के एस ट्यूमर ऊतक एकल और दोहरी लेबल आईएचसी द्वारा KSHV लाना और PECAM-1 / सी के लिए दाग था.D31. ए) केएस लाना करने के लिए एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ ऊतक दाग दिखाता है और hematoxylin साथ counterstained. लाना सकारात्मक कोशिकाओं सफेद तीर द्वारा पहचाने जाते हैं. बी). केएस ऊतक PECAMI/CD31 के लिए एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ दाग और धुंधला सफेद तीर द्वारा दर्शाया वाहिकाओं के आसपास endothelial विशिष्ट प्रकट होता है. सी) (वेक्टर लाल) लाना और CD31 (भूरे रंग का) के लिए के.एस. ऊतक दोहरी दाग ​​CD31 के लिए सकारात्मक धुंधला कोशिकाओं के लिए एक सफेद लाना के लिए काले तीर द्वारा दिखाया गया दिखाता है. डी) पैनल सी. brightfield छवियों में एक ही स्लाइड से एक क्षेत्र के एक कम बढ़ाई 600x एसी की कुल बढ़ाई NIKON TE2000S खुर्दबीन पर फोटो खिंचवाने थे और पैनल के लिए 200x दिखाता डी.

चित्रा 4
चित्रा 4. QRT - पीसीआर 10 दिनों के बाद संक्रमण से KSHV लाना टेम्पोरल अभिव्यक्ति संक्रमित नियंत्रण कक्ष नकली KSHV DMVEC संक्रमित कोशिकाओं के लिए सभी मूल्यों की तुलना GAPDH के लिए सामान्यीकृत थे . नकली संक्रमित कोशिकाओं में लाना सीडीएनए प्रवर्धन के कोई सबूत नहीं था.

चित्रा 5
चित्रा 5. केएस ट्यूमर ऊतक प्रोटीन ऊतक माइक्रोएरे (TMA) 0.6 मिलीमीटर ऊतक एक एकल स्लाइड पर arrayed कोर का प्रतिनिधित्व करता है. प्रत्येक ऊतक कोर एक अलग रोगी से एक केएस ट्यूमर नमूना प्रतिनिधित्व करता है. TMA ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी में लियोना Ayers एमडी से एड्स कैंसर नमूना संसाधन (ASCR) के माध्यम से उपलब्ध किए गए थे. आयल मिलान सामान्य और सकारात्मक नियंत्रण के ऊतकों के साथ साथ केएस ट्यूमर ऊतक एम्बेडेड कांच स्लाइड पर रखा गया. केएस ऊतक नमूनों मुँह, त्वचा, कोमल तालू, जीभ, और गर्दन जनता से ले जाया गया. सभी रोगियों को एचआईवी पॉजिटिव थे.

चित्रा 6
चित्रा 6. ऊतक प्रोटीन KSHV लाना के लिए immunohistochemistry द्वारा दाग थे और brightfield माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण थे रंग विकास के लिए लाना थपका के साथ एक peroxidase सब्सट्रेट के रूप में प्रदर्शन किया था और लाना सकारात्मक कोशिकाओं को एक गहन भूरे रंग धुंधला हो जाना पैटर्न के द्वारा visualized थे. वायरल बोझ और धुरा सेल क्षेत्रों के विभिन्न मात्रा में देखा जा सकता है. ए) ट्यूमर के परिभाषित क्षेत्र में फोकल वायरल संक्रमण का प्रतिनिधित्व करता है. बी) एक उच्च वायरल बोझ है कि मोटे तौर पर धुरी मौजूद कोशिकाओं की संख्या के साथ सहसंबद्ध है के साथ फैलाया संक्रमण का प्रतिनिधित्व करता है. सना हुआ ऊतक कोर 200x बढ़ाई मनाया गया.

7 चित्रा
7 चित्रा. DMVEC EBM-2 पूरा मीडिया में अच्छी तरह से 2.5 प्रतिशत X10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर खेती कोशिकाओं Adenovirus के 5 μL साथ 10 1.0X10 के टिटर transduced थे कक्ष EGFP प्रतिदीप्ति 18 घंटे के बाद पारगमन के लिए जांच की गई. दोनों चरण और फ्लोरोसेंट छवियों पर एक Nikon ते 2000s खुर्दबीन 200X की कुल बढ़ाई ले जाया गया. प्राथमिक DMVEC कोशिकाओं के अभिकर्मक के समस्याग्रस्त इसलिए हम पहचान की है वायरल vectors है कि हमें fibulin-2 और galetin-3 देने के लिए प्राथमिक DMVEC में बहुत कुशलता से की अनुमति देगा साबित हो गया है. हमने पाया है कि एक EGFP व्यक्त adenovirus कुशलता प्राथमिक DMVEC transduce कर सकते हैं. हम यह भी पाया कि lentiviral वेक्टर हम Lentigen निगम से प्राप्त प्राथमिक DMVEC कोशिकाओं (नहीं दिखाया डेटा है) transducing के लिए समान रूप से कुशल था.

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Discussion

इस रिपोर्ट में इस्तेमाल के तरीके प्रयोगशाला सेटिंग्स की एक किस्म में किया जा सकता है. वे कुछ विशेष उपकरणों या कोर सुविधाओं के लिए उपयोग की आवश्यकता होती है. उचित सावधानियों जब KSHV जैसे संक्रामक वायरल रोगज़नक़ों जो biosaftey स्तर 3 (BSL 3) सुविधाओं के उपयोग की आवश्यकता हो सकती शामिल प्रयोगों कर लिया जाना चाहिए. ऊतक अधिग्रहण भी उपयुक्त संस्थागत समीक्षा बोर्ड (IRBs) द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए.

इन के तरीके के साथ जीन है कि इन विट्रो में अभिव्यक्ति में dysregulated हैं और बदल जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल के vivo मान्यता के रूप में अच्छी तरह से endothelial कोशिकाओं में जीन डिलीवरी के लिए रणनीति में परिभाषित तरीके प्रदान की पहचान करने के लिए एक आधार प्रदान कर सकते हैं. इन निष्कर्षों को एक साथ लिया जैव रासायनिक रास्ते कि KSHV संक्रमण से और बाद में विशिष्ट वायरल जीनों के द्वारा प्रभावित कर रहे हैं स्पष्ट करने में मदद कर सकता है. कैसे KSHV तरह oncogenic वायरस विशिष्ट आणविक रास्ते बीच की समझ उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के विकास में अंतर्दृष्टि प्रदान सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम उनकी सलाह और इस पांडुलिपि की समीक्षा के लिए जेम्स ई.के. Hildreth, Meharry मेडिकल कॉलेज, धन्यवाद. हम भी पांडुलिपि के संपादन के लिए डायना Marver धन्यवाद. एड्स स्वास्थ्य असमानताओं अनुसंधान के लिए केंद्र, NIH अनुदान 5U54 RR019192-05, नैदानिक ​​अनुसंधान के लिए Meharry केंद्र, एनआईएच अनुदान P20RR011792, यह काम (NIH अनुदान p30 AI054999-05) Meharry Vanderbilt एड्स अनुसंधान के लिए केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था और NIH द्वारा अनुदान CA113239 P01. DJA आंशिक रूप से Vanderbilt Meharry एड्स अनुसंधान के लिए केंद्र (CFAR) और Meharry क्लीनिकल रिसर्च के लिए केंद्र (सीआरसी) से पायलट अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Invitrogen 05-0001DJ
TPA Sigma-Aldrich P1585
PBS pH 7.4 Invitrogen 10010-023
Sodium butyrate Sigma-Aldrich 19364 (FLUKA)
EBM-2 media Lonza Inc. CC-3156 + bullet kits supplement
DMVEC cells (HMVEC) Lonza Inc. CC2543
Fetal calf serum Hyclone SH30066.03
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140-122
Chamber slides Nalge Nunc international 154461
KSHV LANA Mab Vector Laboratories VP-H913 1:50 dilution/IFA
Galectin-3 goat pAb R&D Systems AF1154
Donkey-anti-goat FITC Jackson ImmunoResearch 705-095-1
Donkey-anti-goat Rho Jackson ImmunoResearch 705-295-003 1:100 dilution/IFA
Mounting media Vector Laboratories H 1500 Vectashield with DAPI
BCA Protein Assay Kit Pierce, Thermo Scientific 23235
Nitrocellulose Bio-Rad 161-0112
Donkey-anti-goat-conj. Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC 2020
Western substrate Pierce, Thermo Scientific 34075
Biotin-rabbit-anti goat Dako 305-065-045
AP-Strepavidin conj. Dako K 0492 (kit)
RNase DNase Free Set Qiagen 79254
MJ Mini Cycler Bio-Rad PTC-1148C
Bio-Photometer Eppendorf 952000006
RC 6 Plus Centrifuge Sorvall, Thermo Scientific 46910
Coulter Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter Inc. 392052
MYiQ iCycler Real Time PCR Detection System Bio-Rad 170-9770
TE 2000S Fluorescent microscope Nikon Instruments TE2000S
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938C
Eclipse E 200 Nikon Instruments E 200
Sorvall Legend RT Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Inc. 75004377

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References

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Dysregulated Kaposi है sarcoma-जुड़े herpesvirus (KSHV) द्वारा प्रेरित जीन की पहचान
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Alcendor, D., Knobel, S. Identifying … More

Alcendor, D., Knobel, S. Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV). J. Vis. Exp. (43), e2078, doi:10.3791/2078 (2010).

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