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Immunology and Infection

Identificação de genes desregulados Induzida pelo Herpesvirus sarcoma de Kaposi-associado (KSHV)

Published: September 14, 2010 doi: 10.3791/2078

Summary

Fatores da célula hospedeira desempenham um papel fundamental no estabelecimento e manutenção de sarcoma de Kaposi (KS). Esboçamos métodos para identificar os fatores da célula hospedeira alterado em células infectadas pelo KSHV DMVEC, e em KS tecido tumoral. Genes celulares alterados por vírus vai servir como potencial alvo (s) para novas terapêuticas.

Abstract

Atualmente KS é o mais predominante malignidade HIV / SIDA na África Austral e, consequentemente, do mundo. 1,2 Caracteriza-se como um tumor angioproliferativas de células endoteliais vasculares e produz raras doenças linfoproliferativas de células B na forma de linfomas derrame pleural (PEL) e algumas formas de doença multicêntrica de Castleman. 3-5% Somente 1-5 de células em lesões KS apoiar activamente a replicação lítica de sarcoma de Kaposi associado herpesvirus (KSHV), o agente etiológico associado com KS, e é claro que fatores celulares deve interagem com fatores viral no processo de oncogênese e progressão do tumor 6,7. Identificação de novas anfitrião fator determinantes que contribuem para KS patologia é essencial para o desenvolvimento de marcadores prognósticos para a progressão tumoral e metástases, bem como para o desenvolvimento de novas terapêuticas para o tratamento de KS 8. Os detalhes de vídeo que acompanha os métodos que usamos para identificar célula hospedeira programas de expressão gênica alterada em células endoteliais microvasculares dérmicas (DMVEC) após a infecção KSHV e em KS tecido tumoral. 9 Depois genes desregulados são identificadas por análise de microarray, mudanças na expressão de proteínas são confirmados por immunoblot e imunofluorescência rotulados dual. Mudanças na expressão transcricional de genes desregulados são confirmados in vitro quantitativa por reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR). Validação dos resultados in vitro utilizando tecido tumoral de arquivamento KS também é realizada por imunoquímica rotulados dupla e microarrays do tecido. 8,10 Nossa abordagem para identificar genes desregulados no microambiente tecido tumoral KS permitirá o desenvolvimento de testes in vitro e posteriormente em sistemas modelo in vivo para descoberta e avaliação da terapêutica romance potencial para o tratamento do sarcoma de Kaposi.

Protocol

1. KSVH Cultivo e infecção de DMVEC

  1. A linha BCBL-1 célula, isolada originalmente de um linfoma cavidade do corpo humano com base, é cultivada em RPMI 1640 completo de mídia (Gibco, Grand Island, NY). BCBL-1 as células são retiradas do nitrogênio líquido, transportadas em gelo seco, e rapidamente descongeladas por 1 minuto a 37 ° C. A alíquota de 50 mL de BCBL-1 as células com uma densidade 1x10 4 células / mL é adicionado a 500 mL de RPMI 1640 suplementado com media de 10% de soro fetal bovino, penicilina 1x / estreptomicina e distribuídos em frascos de 175 cm, a 50 mL / frasco .
  2. Os frascos de BCBL-1 células são então incubados a 37 ° C em uma atmosfera de 5% de CO 2 até que a densidade celular chegou a 3x106 células / mL. Replicação do vírus lítico ciclo é induzida pela adição de TPA em 20ng / mL e sódio butirato de 0,3 ng / mL.
  3. Vinte e quatro horas pós-indução células são lavadas duas vezes em PBS pH7.4 em um volume de 40 mL por centrifugação a 1500 rpm em uma centrífuga Sorvall RT Legend (para remover o butirato), e indução continua com TPA de 20 ng / mL em RPMI 1640 de até 5 dias.
  4. Do vírus na célula livre é isolado e concentrado por centrifugação diferencial. Resumidamente, as células e restos celulares são os primeiros peletizada a 10.000 rpm em um RC-6 Plus centrífuga a 4 ° C Sorvall por 30 minutos. Sobrenadante contendo o vírus é removido e livre de vírus de células peletizada em uma ultracentrífuga Beckman Coulter Optima L-90K a 4 ° C durante 1 hora a 25.000 rpm.
  5. O vírus livre sobrenadante é removido eo pellet ressuspenso em mídia viral de congelamento (10% dimetil sulfóxido e 90% de soro fetal bovino) e armazenadas a -80 ° C até ser necessário.

    KSHV infecção de células primárias de DMVEC.
  6. Células DMVEC em 05/02 nível de passagem são banhados em uma densidade inicial de 1 X 10 5 em pratos de tecido 100x20mm cultura ou slides de câmara, e são mantidas em completo EMB-2 media (Lonza, Basel, Suíça) a 37 ° C em um atmosfera de 5% CO 2. Na confluência de 80%, DMVEC estão infectados em um moi de 0,01; zombar infectados (media apenas) as células são usadas como controle. Mídia fresco é adicionado a células a cada dois dias.
  7. Monocamadas de células DMVEC e slides câmara são examinados diariamente para a evidência de infecção como observado pela formação de células fusiformes. Após o primeiro sinal de formação de células fusiformes (7-14 dias) seja suspenso alterações na mídia. Entretanto, os tempos de incubação mais longo em excesso de 15-21 dias sem oferecimento de meios fresco pode comprometer a integridade das células DMVEC resultando em células que morrem ou levantar fora da placa de cultura.
  8. No ponto de spindling máxima durante a infecção, as monocamadas de células são colhidas para a preparação de pelotas de células para a proteína ou extração de RNA. Células infectadas DMVEC em lâminas de câmara são lavadas duas vezes com 1 mL / janela com pré-aquecido PBS pH 7.4. Células em câmara de slides são colhidas após a lavagem com PBS 2X pH 7.4. Lhes permitiu secar completamente antes de remover as câmaras e colocando as lâminas em metanol 100% detida a -20 ° C até ser necessário para a coloração de imunofluorescência (IFA).

2. Isolamento de RNA total e Produção de cDNA de Mock e Infected KSHV DMVEC

  1. Total de RNA é extraído do KSHV infectados DMVEC e zombar células infectadas utilizando uma Qiagen RNesay Mini KIT (Qiagen, Valencia, CA). Protocolo do fabricante para o processamento de tecido animal é empregado, mas sem as etapas de homogeneização, se as células cultivadas são a fonte usada para o isolamento do RNA.
  2. Selecione a opção oferecida para tratar a RNA com DNAseI na coluna usando o Qiagen RNA livre DNAse Kit, de acordo com as recomendações do fabricante localizado no apêndice do manual de instruções. DNAaseI degrada qualquer genômico contaminante ou DNA viral a partir da preparação de RNA. O tratamento DNAseI é fundamental para aplicações de baixo fluxo, incluindo RT-PCR, qRT-PCR e análise microarray.
  3. O RNA é lavada de acordo com as instruções e de todo o etanol residual no tampão de lavagem é removido por centrifugação a coluna mais uma vez do que o sugerido pelo fabricante. Etanol residual compromete a pureza do RNA após eluição.
  4. Após a lavagem final uma etapa de centrifugação adicional é realizado antes do RNA pode ser eluída da coluna. O RNA é eluída da coluna com 30 mL de água livre de RNAse. O RNA é então quantificados e analisados ​​para a pureza de uma AG-6131 Eppendorf Bio Fotômetro. A relação de densidade óptica (260/280 nm) deve ser between1.8-2.0 que é típico para RNA de alta pureza.
  5. Para a análise de microarray, o RNA é analisado em um Agilent 2100 Bioanalyzer usando o algoritmo de software RIN. A análise sobre a Bioanalyzer fornece-lhe com um número de integridade do RNA (RIN) 1-10, números entanto RIN 7-10 provaram produzir resultados consistentes e mais confiável para análises de microarray ou qRT-PCR. O número médio de RNA RIN isolated com o kit Qiagen RNAeasy em nossas mãos varia 7,5-9.
  6. Quantificação de RNA é obtida pela adição de 1 mL do RNA eluída da coluna a 99 mL de 10mM Tris-EDTA pH 7,6. O RNA e buffer é misturado com uma pipeta e adicionada a uma cuvete limpa para análise espectrofotométrica com um Eppendorf Bio-Fotômetro.
  7. RNA mensageiro em um micrograma de cada amostra é preparado usando hexâmeros aleatório fornecido pelo fabricante, antes da transcrição reversa com um kit de alta capacidade de transcrição reversa cDNA (Applied Biosystems, Foster City, CA)..


    síntese de cDNA

  8. Para sintetizar fita simples de cDNA de RNA total, usamos um de alta capacidade Kit de Transcrição Reversa cDNA da Applied Biosystems e proceder de acordo com as instruções do fabricante.
  9. Uma mistura mestre 2x de reagentes é feito e 0,5 a 1 mg de RNA em um volume de 10 L é adicionado a 10 mL da mistura 2x mestre reagente. A solução resultante 1x é suavemente misturados e transcrição reversa é executada em um termociclador MJ BioRad Mini-Themal acordo com as instruções do fabricante.
  10. Até dois microgramas de RNA total pode ser usado por 20 mL de reação. O cDNA é quantificada a 260 nm em um AG-6131 Bio-Eppendorf Fotômetro, e armazenadas a -80 ° C até ser necessário para qRT-PCR.

3. Microarray Análise Comparativa de células infectadas Mock e KSHV DMVEC

Nosso laboratório realiza análise de microarray na Vanderbilt University Medical Centro de Microarray Facility Núcleo de Recursos Compartilhados em uma base de taxa de serviço. Nós comparamos arquivos de saída para a desregulação da transcrição de genes em células infectadas KSHV DMVEC para zombar células controle infectado. Transcricional genes desregulados em células infectadas KSHV que são relevantes para a angiogênese, proliferação celular ou metastático que representam biomarcadores são validados in vitro utilizando células infectadas KSHV DMVEC usando PCR em tempo real, Western blot e IFA dual; resultados são comparados com os achados em tumor KS arquivística tecido.

4. RT-PCR quantitativa Transcricional Genes Análise desregulado Encontrado em DMVEC Mock e KSHV infectados

  1. Real Time PCR é realizada em 96 placas bem óptico (Sorenson Bioscience, Inc.), utilizando a transcriptase reversa gerado cDNA provenientes de uma amostra de RNA purificado e usando uma única cor MyiQ Real Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) e 25 mL volumes reação. Este procedimento é feito em uma câmara de segurança biológica para evitar possível contaminação por DNA estranho / cDNA que podem estar presentes na sala.
  2. A mistura principal é preparado em tubos de 1,5 mL para cada conjunto de primers (de acordo com as instruções do fabricante), utilizando SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) e selecionados para a frente e primers reverso para cada gene de interesse, a uma concentração de 250 nM por poço, feito em RNAase DNAase livre H 2 O. Cada amostra deve ser feita em triplicado.
  3. Seqüências de primers para qRT-PCR para os genes da célula hospedeira incluem sequências de cartilha para KSHV LANA, que é a latência do vírus associado antígeno nuclear que é altamente expressa em células infectadas DMVEC KSHV e tumores KS.
  4. O ng 10 / cDNAs estoque ul zombar de infectados e KSHV células infectadas DMVEC são diluídos 1:03 usando RNAase DNAase livre H 2 O; 3μL desta diluição é adicionado a cada poço. Controle da água de poços substituto para cDNA.
  5. A placa de 96 poços é selada com fita de vedação óptico (Bio-Rad Laboratories), gentilmente misturados e centrifugados por 2 minutos a 1000 rpm, temperatura ambiente, para coletar a mistura de reação no fundo dos poços. A Bio-Rad Sistema de Detecção de MyiQ ea lâmpada está ligada neste momento para permitir um período de 10 minutos de aquecimento antes de começar a correr.
  6. A placa de 96 centrifugado bem é então colocada em um iQ M Bio-Rad Único Cor Real Time PCR Detection System, o programa de seqüências ciclo entrou e salvou, ea corrida começou.
  7. A seqüência de bicicleta é a seguinte: 95 ° C por 3 minutos, 95 ° C por 15 segundos, 60 ° C por 1 minuto, 95 ° C por 1 minuto, 55 ° C por 1 minuto e 55 ° C por 30 segundos para 81 ciclos total. A curva de derretimento está incluída neste programa como um cheque de eficiência primer. Um conjunto de primers GAPDH é amplificado, e incluiu a normalização.
  8. A análise dos dados é feito com a Bio-Rad Versão Software iQ5 Optical System 2.

5. Análise Identificada dupla imunofluorescência de células infectadas KSHV DMVEC

  1. Slides câmara (retirados das câmaras), contendo dois DMVEC confluentes infectadas e não infectadas são lavados duas vezes com PBS pH 7.4, ar seco, e fixados em -20 ° C metanol pré-refrigerados absoluto por 10 minutos e mantido a -20 ° C.
  2. Slides com as células são then ar seco por 15 minutos, e colocado em um frasco Coplin no gelo contendo Tris salina (0,05 M Tris pH 7,4) por 5 minutos. Células são então incubados por 1 hora a 37 ° C em câmara úmida com uma mistura de anticorpos monoclonais para KSHV LANA na diluição de 1:50 em PBS pH 7,4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA), mais um anticorpo policlonal de cabra (1: 100 diluição em PBS pH 7,4) contra a proteína factor hospedeiro encontrado para ser dyregulated por microarray utilizando KSHV células infectadas DMVEC.
  3. As células são então lavadas 3x com Tris salina (nunca permitir que as células a secar) e então incubadas por 30 minutos com uma mistura de um burro secundárias de anticorpos IgG anti-rato conjugado com rodamina vermelho-X e burro de anticorpos anti-cabra conjugado com FITC (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), ambos na diluição de 1:100 em PBS.
  4. As células são depois lavadas em 3x Tris salina em um frasco Coplin e enquanto os slides estão ainda úmido, as lâminas são montadas com Vectashield de montagem de mídia (Vector Laboratories, Burlingame, CA) contendo 1,5 g / mL de DAPI e uma lamela.
  5. Fluorescência é observado e as imagens fotografadas com um microscópio Nikon 2000S TE fluorescentes montado com uma charge-coupled device câmera (CCD). As fotografias são tiradas com uma objectiva de 20x para uma ampliação total de 200x.
  6. Fotografias em separado com a mesma ampliação usado para DAPI (200x), são tomadas de iluminação UV usinge, com um filtro verde para rodamina e um filtro azul para FITC. As imagens são posteriormente fundidos utilizando software freeware da Nikon.

6. Imunohistoquímica Identificada dupla em Ks Tissue Microarrays e Tissue Ks para KSHV Lana eo marcador de células endoteliais Pecam-1/cd31

  1. Imunohistoquímica rotulados dupla é realizada com o ABC strepavidin DAKO kit coloração dueto para KSHV LANA e as proteínas da célula hospedeira encontrados para alteradas após a infecção do vírus. IHC é realizada em tecido com SK-SIDA arquivo fixados em formalina e embebidos em parafina.
  2. Cinco seções microns são cortados com micrótomo e colocados em lâminas chemate antes de imunocoloração.
  3. Slides incluídos em parafina são deparaffinzed em xilol por 10 minutos sob um exaustor, e depois as células são hidratados em uma série de etanol graduada de 100%, 95% e 70% por cinco minutos cada. Slides são então colocados em água por 10 minutos antes desmascaramento do antígeno (também conhecida como recuperação antigênica).
  4. Para a imunocoloração, desmascarando antígeno é realizado em um forno de microondas em 50 mM citrato pH 6,0 a 95 ° C por 15 minutos. Resumidamente, slides contendo células são submersos em tampão citrato 95 ° C por 15 minutos, logo em seguida colocado em água destilada realizada à temperatura ambiente.
  5. Têmpera da peroxidase endógena é realizada incubando slides por 30 minutos em uma solução de têmpera. Brevemente, adicione 47 ml de etanol a 95% para um tubo cônico de 50 mL, adicionar 11,2 mL de PBS pH 7,4 e 1,8 mL de peróxido de hidrogênio 3% para um total de 60 mL.
    A solução de têmpera é feita pouco antes de usar.
  6. As células são então lavadas 3x com PBS pH 7,4 por 5 minutos cada em temperatura ambiente. A solução de bloqueio (12,5 mL de etanol a 95%, 1,4 mL de soro de cabra normal, 140 mg albumina bovina, e 2 gotas de Tween 20) está preparado para impedir que a ligação não específica de anticorpos. Coloque sobre o gelo antes de usar. (Esta solução de bloqueio pode ser armazenado a 4 ° C e por até 1 semana).
  7. Solução de bloqueio é adicionado ao modelo sobre a lâmina e é então coberto com uma tira de parafina (para evitar ressecamento da amostra) e colocados em câmara úmida e incubadas por 1 hora à temperatura ambiente.
  8. O anticorpo primário monoclonal ou policlonal para o antígeno viral é preparado em solução de bloqueio na diluição de 1:50, misturado com uma pipeta e colocado em gelo até ser necessário. Cinqüenta a 100 mL de solução de anticorpo serão necessários por amostra de tecido, dependendo do tamanho dos espécimes eo número de slides.
  9. Imediatamente após a incubação a solução de bloqueio é abalada fora do slide e 5-10 mL do anticorpo primário é adicionado à amostra de tecido que depois é coberto com uma tira de parafina. Amostras são incubados por 1-2 horas em câmara úmida à temperatura ambiente.
  10. Slides contendo amostras são, então, lavar 3x por 5 minutos cada em PBS pH 7.4 à qual se acrescenta um secundário biotinilado de cabra anticorpo anti-mouse em uma diluição de 1:100 em PBS pH 7,4, e incubadas em câmara úmida à temperatura ambiente por 30 - 45 minutos.
  11. Cerca de 30 minutos antes de usar, o conjugado peroxidase-strepavidin em PBS pH 7,4 é preparado. Usando o Kit Dueto Cytomation DAKO, adicionar 50 mL da solução A e 5 mL de PBS pH 7,4, vortex, e em seguida adicionar 50 mL da solução B e misture novamente.
  12. Após a incubação de anticorpos em 6,10 etapa completa, as lâminas são lavadas 3x com PBS pH 7,4 e, em seguida, o recém-prepared peroxidase solução conjugado-strepavidin é adicionada e incubada em temperatura ambiente por 30-45 minutos em câmara úmida.
  13. Após a incubação, as lâminas são lavadas 3x com PBS pH 7,4 à temperatura ambiente. Cinco minutos antes da lavagem é concluída, a 3 de solução de substrato 3-diamino-benzidina (DAB, SIGMA) (20 mL de PBS pH 7,4, 25 mL de peróxido de hidrogênio 3%, e 1 comprimido DAB) é preparado. Após o tablet DAB é completamente dissolvido, a solução marrom cor é filtrado por um filtro de seringa de 0,45 mícron. A solução DAB filtrada é então adicionado à espécimes após a lavagem final e desenvolvimento de cores para KSHV LANA em células infectadas é observado em tempo real sob brightfield iluminação utilizando um microscópio Nikon Eclipse E200. Uma vez que o desenvolvimento da cor desejada é alcançada, a reação é saciada pela incubação em água destilada por 5 minutos.
  14. Para dual IHC rotulados, após a incubação em água os slides contendo espécimes são colocados através do protocolo IHC pela segunda vez a partir de a etapa de recuperação antigênica (6.4). No entanto, o protocolo mudanças na etapa de substrato peroxidase (6.11) em que em vez do conjugado peroxidase-strepavidin, um conjugado de fosfatase alcalina strepavidin é empregado
  15. A rotulagem segundo é atingido por uma etapa adicional de antígeno de recuperação no microondas, como descrito acima, mais um segundo imunocoloração com anticorpo monoclonal para a proteína celular encontrado para ser desregulada (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Células são posteriormente lavado, e então incubadas com um cabra biotinilado anti-mouse/rabbit anticorpos IgG (DAKO) na diluição de 1:100 seguido por uma fosfatase alcalina strepavidin conjugado (Vector Labs, Burlingame, CA) a 1:500 diluição. Desenvolvimento de cor é obtida por células de incubação com o vermelho vetor substrato utilizando um Vector kit Red substrato alcalino fosfato (Vector Laboratories, Burlingame, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Coloração contador, se desejar, pode ser realizada com orecin ou hematoxilina. Amostras de tecido são, então, montada permanentemente com Permount meios de montagem com uma tampa de vidro. As imagens são tomadas sob iluminação de campo claro com um microscópio Nikon TE-2000S equipado com uma câmera CCD.

7. Entrega por Gene Transdução de Adenovirus de Células DMVEC

  1. Células normais DMVEC são cultivadas em câmara de slides no chapeamento da densidade de 2,5 X10 5 células por câmara EBM-2 de mídia completo.
  2. DMVEC células são cultivadas a 80 confluência (tendo 3-5 dias) após o qual 5 / ul janela câmara de slides de EGFP adenovírus expressando a um título 1X 10 10 partículas / mL.%
  3. Viver com culturas de células DMVEC Adenovirus adicionado foram examinados para EGFP fluorescência 18 horas após a adição do vírus.
  4. Fase individual e fotografias fluorescentes foram tiradas com uma ampliação total de 200x e se fundiram em um microscópio NIKON 2000S TE fluorescentes equipado com uma câmera CCD.

8. Resultados representante

Figura 1
Figura 1. Células primárias de DMVEC da Lonza Corporação foram mantidos em EBM-2 de mídia e foram infectados com o vírus BCBL-1 em um moi de 0,01. Monocamadas Após a infecção de células DMVEC foram examinados diariamente. Dez dias após a infecção zombar células infectadas mostram um paralelepípedo-como a morfologia e as células infectadas KSHV exibiram uma morfologia característica de células fusiformes tipo de células endoteliais fusiformes encontradas infectadas com KSHV em KS tecido tumoral. Fotografias foram tiradas com um microscópio NIKON 2000S TE equipado com uma câmera CCD com uma ampliação total de 100x.

Figura 2
Figura 2. Dupla rotulados coloração de imunofluorescência indireta foi realizada em células infectadas KSHV DMVEC menos 10 dias após a infecção. Células infectadas foram coradas dupla com um anticorpo monoclonal para KSHV LANA e um anticorpo policlonal de cabra a uma proteína específica da célula hospedeira encontrado para ser alterado após a infecção KSHV. Uma mistura de burro secundário anti-mouse e anti-cabra burro anticorpos conjugados a rodamina e FITC foram adicionados. As células foram examinadas com um microscópio fluorescente TE2000S Nikon equipados com uma câmera CCD. Meios de montagem com DAPI foi usado para visualizar núcleos. Todas as fotografias foram tiradas com uma ampliação total de 200x. Célula infectada expressando proteínas do vírus LANA (rodamina manchado) localizada núcleo mostram expressão reduzida da proteína da célula hospedeira específico (FITC manchado) localizada citoplasma.

Figura 3
Figura 3. IHC em KS tecido tumoral para LANA e PECAM-1 / CD31. AIDS tecido tumoral KS foi manchada pelo single e dual IHC rotulado para KSHV e PECAM LANA-1 / CD31. A) Mostra KS manchada do tecido com um anticorpo monoclonal para LANA e contrastado com hematoxilina. LANA células positivas são identificados por setas brancas. B). Tecido KS marcados com um anticorpo monoclonal para PECAMI/CD31 e coloração aparece específicos para ao redor de vasos endoteliais representado por setas brancas. C) Mostra KS manchada tecido duplo para LANA (vetor vermelho) e CD31 (castanho) representado por setas pretas para LANA um branco para as células de coloração positiva para CD31. D) Mostra uma menor ampliação de uma área do mesmo slide no painel de imagens C. Brightfield foram fotografados em um microscópio NIKON TE2000S na ampliação total de 600x e 200x AC para o Painel de D.

Figura 4
Figura 4. Expressão temporal de KSHV LANA por qRT-PCR após a infecção 10 dias em relação a zombar células controle infectado. Todos os valores para as células infectadas KSHV DMVEC foram normalizados para GAPDH. Não houve evidência de LANA amplificação de cDNA em imitação células infectadas.

Figura 5
Figura 5. Tumor KS microarrays do tecido. O tecido microarray (TMA) representa 0,6 milímetros de tecido núcleos dispostos em um único slide. Cada núcleo representa uma amostra de tecido do tumor KS de um paciente diferente. TMA foram disponibilizados através do Resource Specimen Cancer AIDS (ASCR) de Leona Ayers MD na Ohio State University. Incluídos em parafina KS tecido tumoral junto com tecidos combinados controle normal e positivo foram colocadas em lâminas de vidro. Amostras de tecido KS foram tiradas de boca, pele, palato mole, língua e massas cervicais. Todos os pacientes eram HIV positivo.

Figura 6
Figura 6. Microarrays do tecido foram corados para KSHV LANA por imuno-histoquímica e foram analisados ​​por microscopia de campo claro. Desenvolvimento de cores para LANA foi feita com DAB como substrato peroxidase e células LANA positivos foram visualizados por um padrão de coloração intensa marrom. Diferentes quantidades de carga viral e regiões de células fusiformes podem ser observados. A) representa a infecção viral focal na região definida do tumor. B) representa infecção disseminada com uma elevada carga viral, que é mais ou menos correlacionadas com o número de células fusiformes presentes. Fragmentos de tecido manchado foram observadas em aumento de 200x.

Figura 7
Figura 7. DMVEC células cultivadas em EBM-2 de mídia completo, a uma densidade de 2,5 X10 5 células por poço foram transduzidas com 5 mL de Adenovirus a um título de 1.0x10 10. Células foram examinados para EGFP fluorescência transdução pós 18 horas. Ambos fase e imagens fluorescentes foram obtidas em um microscópio Nikon 2000S TE com uma ampliação total de 200x. Transfecção de células primárias de DMVEC provou ser problemático, portanto, nós identificamos vetores virais que nos permitirá oferecer fibulin-2 e galetin-3 de forma muito eficiente em DMVEC primária. Descobrimos que um adenovírus expressando EGFP pode eficientemente transduzir DMVEC primária. Descobrimos também que o vetor lentiviral que obtivemos Lentigen Corporation foi igualmente eficiente para transdução de células primárias de DMVEC (dados não mostrados).

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Discussion

As metodologias utilizadas neste relatório pode ser realizada em uma variedade de configurações de laboratório. Eles exigem algum equipamento especial ou acesso às instalações do núcleo. Precauções apropriadas devem ser tomadas ao fazer experimentos envolvendo patógenos virais infecciosas como KSHV que pode exigir a utilização de um nível de Biossegurança 3 (NB-3) instalações. Aquisições de tecido também deve ser aprovado pelo apropriado conselhos de revisão institucional (IRBs).

Estas metodologias em conjunto pode fornecer uma base para a identificação de genes que estão desregulados na expressão in vitro e fornecer métodos definidos na validação vivo de perfis de expressão alterada de genes, bem estratégias para a entrega do gene nas células endoteliais. Esses achados em conjunto pode ajudar a elucidar caminhos bioquímicos que são afetados pela infecção KSHV e posteriormente por genes específicos viral. Uma compreensão de como os vírus oncogênicos como KSHV interromper vias moleculares específicos podem fornecer insights para o desenvolvimento de novas terapêuticas.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Agradecemos a James EK Hildreth, Meharry Medical College, pelos seus conselhos e revisão do manuscrito. Agradecemos também a Diana Marver para a edição do manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Vanderbilt Meharry Center for AIDS Research (NIH conceder AI054999 P30-05), o Center for AIDS Research Disparidades de Saúde, NIH conceder 5U54 RR019192-05, o Centro de Pesquisa Clínica Meharry, NIH Grant P20RR011792, e pelo NIH conceder P01 CA113239. DJA foi parcialmente financiado por doações piloto do Centro de Vanderbilt-Meharry para AIDS Research (CFAR) e do Centro de Pesquisa Clínica Meharry (CRC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Invitrogen 05-0001DJ
TPA Sigma-Aldrich P1585
PBS pH 7.4 Invitrogen 10010-023
Sodium butyrate Sigma-Aldrich 19364 (FLUKA)
EBM-2 media Lonza Inc. CC-3156 + bullet kits supplement
DMVEC cells (HMVEC) Lonza Inc. CC2543
Fetal calf serum Hyclone SH30066.03
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140-122
Chamber slides Nalge Nunc international 154461
KSHV LANA Mab Vector Laboratories VP-H913 1:50 dilution/IFA
Galectin-3 goat pAb R&D Systems AF1154
Donkey-anti-goat FITC Jackson ImmunoResearch 705-095-1
Donkey-anti-goat Rho Jackson ImmunoResearch 705-295-003 1:100 dilution/IFA
Mounting media Vector Laboratories H 1500 Vectashield with DAPI
BCA Protein Assay Kit Pierce, Thermo Scientific 23235
Nitrocellulose Bio-Rad 161-0112
Donkey-anti-goat-conj. Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC 2020
Western substrate Pierce, Thermo Scientific 34075
Biotin-rabbit-anti goat Dako 305-065-045
AP-Strepavidin conj. Dako K 0492 (kit)
RNase DNase Free Set Qiagen 79254
MJ Mini Cycler Bio-Rad PTC-1148C
Bio-Photometer Eppendorf 952000006
RC 6 Plus Centrifuge Sorvall, Thermo Scientific 46910
Coulter Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter Inc. 392052
MYiQ iCycler Real Time PCR Detection System Bio-Rad 170-9770
TE 2000S Fluorescent microscope Nikon Instruments TE2000S
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938C
Eclipse E 200 Nikon Instruments E 200
Sorvall Legend RT Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Inc. 75004377

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Identificação de genes desregulados Induzida pelo Herpesvirus sarcoma de Kaposi-associado (KSHV)
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Alcendor, D., Knobel, S. Identifying More

Alcendor, D., Knobel, S. Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV). J. Vis. Exp. (43), e2078, doi:10.3791/2078 (2010).

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