Summary
Wirtszelle Faktoren spielen eine entscheidende Rolle bei der Errichtung und Wartung von Kaposi-Sarkom (KS). Wir skizzieren Methoden zur Wirtszelle Faktoren in KSHV-infizierten DMVEC Zellen verändert zu identifizieren und in KS Tumorgewebe. Zellulären Genen durch Viren verändert wird als potenzielles Ziel (e) für neuartige Therapeutika dienen.
Abstract
Derzeit KS ist die vorherrschende HIV / AIDS-Malignome im südlichen Afrika und damit die Welt. 1,2 Es wird als angioproliferative Tumor des vaskulären endothelialen Zellen charakterisiert und produziert seltenen B-Zell-lymphoproliferativen Erkrankungen in Form von Pleuraerguss Lymphome (PEL) und einige Formen der multizentrischen Castleman-Krankheit. 3-5 Nur 1-5% der Zellen in KS-Läsionen aktiv unterstützen lytischen Replikation des Kaposi-Sarkoms-assoziierten Herpesvirus (KSHV), die als Erreger mit KS verbunden, und es ist klar, dass zelluläre Faktoren müssen Interaktion mit viralen Faktoren in den Prozess der Onkogenese und Tumorprogression. 6,7 Identifizierung neuartiger Host-Faktor Determinanten, die KS Pathologie beitragen wird für die Entwicklung prognostischer Marker für Tumorprogression und Metastasierung sowie bei der Entwicklung neuartiger Therapeutika zur Behandlung von KS wesentliche . 8 Das dazugehörige Video Details der Methoden, die wir verwenden, um Wirtszelle Genexpression Programme in dermalen mikrovaskulären Endothelzellen (DMVEC) nach KSHV Infektion und in KS Tumorgewebe verändert zu identifizieren. 9 Sobald dysregulierten Gene durch Microarray-Analyse identifiziert werden, sind Veränderungen in der Proteinexpression bestätigt durch Immunoblot-und Dual gekennzeichnet Immunfluoreszenz. Änderungen in transkriptionelle Expression von dysregulierten Gene sind in vitro durch quantitative real-time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) bestätigt. Validierung von in vitro-Ergebnisse mit Hilfe von Archivierungs KS Tumorgewebe wird auch durch dual bezeichnet Immunchemie und Tissue Microarrays durchgeführt. 8,10 Unser Ansatz zur Identifizierung dysregulierten Gene in den KS Tumorgewebe Mikroumgebung ermöglichen die Entwicklung von in vitro und anschließend in vivo-Modell für Entdeckung und Bewertung potenzieller neuer therapeutischer für die Behandlung von KS.
Protocol
1. KSVH Kultivierung und Infektion des DMVEC
- Die BCBL-1-Zelllinie, die ursprünglich aus einem menschlichen Körper Hohlraum Basis Lymphom isoliert, ist in komplettem RPMI 1640 Medium (Gibco, Grand Island, NY) kultiviert. BCBL-1-Zellen werden aus flüssigem Stickstoff entfernt, in Trockeneis transportiert und schnell für 1 Minute aufgetaut bei 37 ° C. Eine 50 ul-Aliquot der BCBL-1-Zellen bei einer Dichte 1x10 4 Zellen / ml auf 500 ml RPMI 1640-Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 1x Penicillin / Streptomycin ergänzt und verteilt in 175 cm-Kolben hinzugefügt, bei 50 ml / Flasche .
- Die Kolben des BCBL-1 Zellen werden dann bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2 bis zu einer Zelldichte erreicht 3x106 Zellen / ml. Lytischen Zyklus Virusreplikation wird durch Zugabe von TPA bei 20ng / mL und Natriumbutyrat bei 0,3 ng / mL induziert.
- Vierundzwanzig Stunden nach der Induktion Zellen zweimal in PBS pH 7,4 in einem Volumen von 40 ml durch Zentrifugation bei 1500 rpm in einem Sorvall Legend RT-Zentrifuge (zu Butyrat entfernen) gewaschen, und die Induktion mit TPA bei 20 ng / mL in Fortsetzung RPMI 1640 für 5 Tage.
- Zellfreien Virus isoliert und konzentriert durch differentielle Zentrifugation. Kurz gesagt, werden Zellen und Zelltrümmer ersten pelletiert bei 10.000 rpm in einer Sorvall RC-6 Plus Zentrifuge bei 4 ° C für 30 Minuten. Überstand mit dem Virus entfernt und zellfreien Virus pelletiert in einem Beckman Coulter Optima L-90K Ultrazentrifuge bei 4 ° C für 1 Stunde bei 25.000 Umdrehungen pro Minute.
- Der Virus-freie Überstand wird entfernt und die virale Pellet in dem Gefrierpunkt Medien resuspendiert (10% Dimethylsulfoxid und 90% fötales Kälberserum) und bei -80 ° C bis zum Gebrauch.
KSHV Infektion von primären DMVEC Zellen. - DMVEC Zellen bei Passage 2-5 sind mit einer anfänglichen Dichte von 1 X 10 5 in 100x20mm Gewebekulturschalen oder Kammer-Objektträgern überzogen und sind in völliger EMB-2-Medien gepflegt (Lonza, Basel, Schweiz) bei 37 ° C in einem Atmosphäre von 5% CO 2. Bei 80% Konfluenz werden DMVEC bei einer MOI von 0,01 infiziert; mock infizierten (Medien)-Zellen werden als Kontrollen verwendet. Frische Medien ist es, Zellen gegeben alle 2 Tage.
- DMVEC Zellmonoschichten und Kammer-Objektträgern werden täglich auf Anzeichen von Infektionen wie Spindel Zellbildung bemerkt untersucht. Nach den ersten Anzeichen von Spindel Zellbildung (7-14 Tage) Wir unterbrechen Medien ändert. Allerdings können längere Inkubationszeiten von mehr als 15-21 Tage ohne Angabe von frischen Medien Beeinträchtigung der Unversehrtheit des DMVEC Zellen, die in Zellen sterben oder Abheben der Kulturschale.
- An der Stelle des maximalen spindling während der Infektion sind Zellmonoschichten für die Herstellung von Zellpellets für Protein-oder RNA-Extraktion geerntet. Infizierte DMVEC Zellen auf Chamber Slides werden zweimal mit 1 mL / Fenster mit vorgewärmten PBS pH 7,4 gewaschen. Zellen auf Chamber Slides sind nach dem Waschen 2X mit PBS pH 7,4 geerntet. Erlaubt sie vollständig trocknen, bevor Sie den Kammern und Platzierung der Dias in 100% Methanol bei -20 ° C gehalten, bis zur Immunfluoreszenzfärbung (IFA) benötigt.
2. Gesamt-RNA-Isolierung und Herstellung von cDNA aus Mock und KSHV Infizierte DMVEC
- Gesamt-RNA aus KSHV-infizierten DMVEC und mock infizierten Zellen unter Verwendung eines Qiagen RNesay Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) extrahiert. Das Protokoll des Herstellers für die Verarbeitung von tierischem Gewebe eingesetzt wird, aber ohne die Homogenisierung Schritte, wenn kultivierten Zellen die Quelle für RNA-Isolierung verwendet werden.
- Wählen Sie die Option angeboten, um die RNA mit DNAseI auf der Säule mit dem Qiagen RNA freie DNAse Kit zu behandeln, nach den Empfehlungen des Herstellers in den Anhang der Anleitung befindet. DNAaseI degradiert keine kontaminierende genomische DNA aus der RNA-Präparation. Die DNAseI Behandlung ist entscheidend für die Downstream-Anwendungen wie RT-PCR, qRT-PCR und Microarray-Analysen.
- Die RNA wird nach den Anweisungen und alle restlichen Ethanol in der Waschpuffer durch Zentrifugation der Säule ein weiteres Mal als vom Hersteller empfohlen entfernt gewaschen. Restliches Ethanol Kompromisse die Reinheit der RNA nach der Elution.
- Nach dem letzten Waschen einen zusätzlichen Zentrifugationsschritt wird durchgeführt, bevor die RNA aus der Säule eluiert werden kann. Die RNA wird aus der Säule mit 30 ul RNAse freiem Wasser eluiert. Die RNA wird dann quantifiziert und analysiert Reinheit auf einem Eppendorf AG-6131 Bio-Photometer. Die optische Dichte-Verhältnis (260/280 nm) sollte between1.8-2.0, die typisch für RNA von hoher Reinheit ist.
- Für Microarray-Analysen wird die RNA auf einem Agilent 2100 Bioanalyzer analysiert mit dem RIN Software-Algorithmus. Die Analyse auf der Bioanalyzer bietet Ihnen eine RNA Integrity Number (RIN) 1 bis 10, haben jedoch RIN Zahlen von 7 bis 10 bewährt, um konsistente und zuverlässige Ergebnisse für die Microarray-oder qRT-PCR-Analysen ergeben. Die durchschnittliche RIN-Nummer für RNA isolaTed mit dem Qiagen-Kit RNAeasy in unseren Händen liegt 7,5 bis 9.
- Die Quantifizierung der RNA wird durch Zugabe von 1 ul der eluierten RNA aus der Säule zu 99 ul 10 mM Tris-EDTA pH 7,6 erreicht. Die RNA und Puffer wird mit einer Pipette gemischt und auf eine saubere Küvette für spektrophotometrische Analyse mit einer Eppendorf Bio-Photometer.
- Messenger-RNA in einem Mikrogramm jeder Probe wird gespült mit zufälligen Hexameren vom Hersteller zur Verfügung, vor Transkription mit einer High Capacity cDNA Reverse Transkription-Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA.) Rückgängig zu machen.
cDNA-Synthese - Zur Synthese einzelsträngiger cDNA aus Gesamt-RNA verwenden wir ein High-Capacity cDNA Reverse Transkription-Kit von Applied Biosystems und nach den Anweisungen des Herstellers vor.
- A 2x Mastermix von Reagenzien besteht und 0,5 bis 1 pg der RNA in einem Volumen von 10 l auf 10 ul der 2x Meister Reagenzienmix aufgenommen. Die daraus resultierende 1x Lösung vorsichtig gemischt und reverse Transkription in einem BIORAD MJ Mini-Thermal-Cycler nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
- Bis zu zwei Mikrogramm Gesamt-RNA kann pro 20 ul Reaktion eingesetzt werden. Die cDNA wird bei 260 nm in einem Eppendorf AG-6131 Bio-Photometer quantifiziert, und bei -80 ° C bis zum Gebrauch für qRT-PCR.
3. Microarray Vergleichende Analyse von Mock und KSHV Infizierte DMVEC Cells
Unser Labor führt Mikroarray-Analyse an der Vanderbilt University Medical Center Microarray Shared Resource Core Facility auf einer Fee-for-Service-Basis. Wir vergleichen Ausgabedateien für transkriptionelle Dysregulation von Genen in KSHV infiziert DMVEC Zellen infiziert Kontroll-Zellen zu verspotten. Transcriptional dysregulierten Gene in KSHV infizierten Zellen, die für Angiogenese, Zell-Proliferation sind oder metastasiertem Biomarker darstellen, werden in vitro mit KSHV infiziert DMVEC Zellen mit Hilfe von Echtzeit-PCR, Western Blots, und Dual IFA validiert; Ergebnisse sind Erkenntnisse in Archivalien KS Tumor im Vergleich Gewebe.
4. Quantitative RT-PCR-Analyse Transcriptional Dysregulated Genes in Mock-und KSHV-infizierten DMVEC Found
- Real-Time-PCR ist in 96-Well-optischen Platten (Sorenson Bioscience, Inc.) unter Verwendung von Reverse-Transkriptase-generierte cDNA aus einer gereinigten RNA-Probe und mit einem MyiQ Single Color Real Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) und 25 ul Reaktionsvolumen. Dieses Verfahren wird in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt, um mögliche Verunreinigungen durch fremde DNA / cDNA, die im Raum anwesende Personen können zu vermeiden.
- Ein Master-Mix in 1,5 ml Röhrchen für jede Primer-Set (je nach den Anweisungen des Herstellers) mit SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) und ausgewählte Forward-und Reverse-Primer für jedes Gen von Interesse bereit, bei einer Konzentration von 250 nM pro well, in RNAase DNAase freie H 2 O. gemacht Jede Probe sollte in dreifacher Ausfertigung erfolgen.
- Primer-Sequenzen für qRT-PCR für Wirtszelle Gene beinhalten Primersequenzen für KSHV LANA, die das Virus Latenz verbunden nuclear antigen, die hoch in KSHV infiziert DMVEC Zellen und KS Tumoren exprimiert wird.
- Die 10 ng / ul Lager cDNAs aus mock infiziert und KSHV infiziert DMVEC Zellen 1:3 verdünnt mit RNAse DNAase freie H 2 O; 3μL dieser Verdünnung wird in jede Vertiefung gegeben. Kontrollvertiefungen Ersatz Wasser für cDNA.
- Die 96-Well-Platte wird mit optischen Dichtband (Bio-Rad Laboratories) verschlossen, vorsichtig gemischt und zentrifugiert 2 Minuten bei 1000 rpm, Raumtemperatur, um die Reaktionsmischung am Boden der Wells zu sammeln. Die Bio-Rad MyiQ Detection System und die Lampe ist zu diesem Zeitpunkt wandte sich an für ein 10-minütiges Warm-up-Periode vor Beginn der Flucht zu ermöglichen.
- Das zentrifugierte 96 Well Platte wird dann in eine Bio-Rad M iQ Single Color Real Time PCR Detection System setzen, trat das Programm des Zyklus Sequenzen und gespeichert, und der Lauf gestartet.
- Der Radsport ist wie folgt: 95 ° C für 3 Minuten, 95 ° C für 15 Sekunden, 60 ° C für 1 Minute, 95 ° C für 1 Minute, 55 ° C für 1 Minute und 55 ° C für 30 Sekunden 81 Zyklen total. Eine Schmelze Kurve ist in diesem Programm als einen Scheck für die Primer-Effizienz berücksichtigt. Ein GAPDH Primer-Set wird verstärkt, und enthalten für die Normalisierung.
- Datenanalyse mit dem Bio-Rad iQ5 Optical System Software Version 2 gemacht.
5. Dual-Labeled Immunfluoreszenz Analyse von KSHV Infizierte DMVEC Cells
- Chamber Slides (entnommen aus den Kammern), die sowohl konfluenten infizierten und nicht infizierten DMVEC zweimal mit PBS pH 7,4 gewaschen, luftgetrocknet und fixiert -20 ° C vorgekühlt absolutem Methanol für 10 Minuten und hielt bei -20 ° C.
- Objektträger mit Zellen sind then Luft für 15 Minuten getrocknet, und in eine Coplin Glas auf Eis mit Tris Kochsalzlösung (0,05 M Tris pH 7,4) für 5 Minuten. Die Zellen werden dann für 1 Stunde bei 37 ° C in einer feuchten Kammer mit einer Mischung von monoklonalen Antikörpern gegen KSHV LANA bei einer 1:50-Verdünnung in PBS pH 7,4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) sowie ein polyklonaler Ziege-Antikörper (1: 100-Verdünnung in PBS pH 7,4) gegen die Gastgeber Faktor-Protein gefunden, die von Mikroarray mit KSHV infizierten Zellen DMVEC dyregulated werden.
- Die Zellen werden dann gewaschen mit Tris Kochsalzlösung (niemals zulassen, dass die Zellen austrocknen) 3x und dann für 30 Minuten mit einer Mischung aus einem sekundären Esel anti-Maus-IgG-Antikörper, konjugiert mit Rhodamin rot-X und Esel anti-Ziege-Antikörper konjugiert inkubiert FITC (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), die beide an einer 1:100 Verdünnung in PBS.
- Die Zellen werden später gewaschen 3x in einem Coplin jar in Tris Kochsalzlösung und während die Dias noch feucht sind, die Folien sind mit Vectashield Eindeckmittel (Vector Laboratories, Burlingame, CA), die 1,5 g / ml DAPI und einem Deckglas montiert.
- Die Fluoreszenz wird beobachtet und Bilder mit einer Nikon TE 2000S Fluoreszenzmikroskop fotografiert montiert mit einer Charge-Coupled Device (CCD)-Kamera. Fotos sind aufgenommen mit einem 20x-Objektiv für eine totale Vergrößerung von 200x.
- Separate Aufnahmen bei gleicher Vergrößerung für DAPI (200x) verwendet werden, sind usinge UV-Beleuchtung aufgenommen, mit einem grünen Filter für Rhodamin und einem blauen Filter für FITC. Die Bilder werden später fusionierte mit Nikons Freeware-Software.
6. Dual-Labeled Immunhistochemie auf Ks Tissue und Ks Tissue Microarrays für KSHV Lana und die Endothelial Cell Marker Pecam-1/cd31
- Dual-markierten Immunhistochemie mit dem DAKO Strepavidin ABC Duett Färbekit für KSHV LANA und die Wirtszellproteinen gefunden, nach Virusinfektion verändert durchgeführt. IHC auf Archivalien AIDS-KS Gewebe in Formalin fixiert durchgeführt, und in Paraffin eingebettet.
- Fünf Mikron Abschnitte werden mit einem Mikrotom geschnitten und auf chemate Dias vor Immunfärbung.
- Paraffin eingebetteten Folien werden in Xylol für 10 Minuten unter einer Abzugshaube deparaffinzed und dann Zellen werden in einer abgestuften Ethanol Serie von 100%, 95% und 70% für jeweils fünf Minuten hydratisiert. Folien werden dann in Wasser für 10 Minuten vor dem Antigen Demaskierung (auch als Antigen-Retrieval bezeichnet) gelegt.
- Für Immunfärbung ist Antigen Demaskierung in der Mikrowelle in 50 mM Citrat pH 6,0-Puffer bei 95 ° C für 15 Minuten durchgeführt. Kurz gesagt, Folien mit Zellen in 95 ° C Citratpuffer für 15 Minuten unter Wasser, dann sofort in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur gehalten platziert.
- Quenching der endogenen Peroxidase durch Inkubation der Objektträger für 30 Minuten in einem Quench-Lösung durchgeführt. Kurz gesagt, fügen Sie 47 ml 95% Ethanol bis zu einer 50 mL konischen Rohr, fügen 11,2 ml PBS pH 7,4 und 1,8 ml 3% Wasserstoffperoxid für eine Gesamtmenge von 60 mL.
Das Abschrecken Lösung ist unmittelbar vor Gebrauch hergestellt. - Die Zellen werden dann gewaschen in PBS pH 7,4 3x für jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur. Eine Sperrung Lösung (12,5 ml 95% Ethanol, 1,4 ml normalem Ziegenserum, 140 mg Rinderserumalbumin und 2 Tropfen Tween 20) ist bereit, eine unspezifische Bindung von Antikörpern verhindern. Legen Sie auf dem Eis vor dem Gebrauch. (Diese Blockierung Lösung kann bei 4 ° C gelagert werden und bis zu 1 Woche).
- Blocking-Lösung ist es, die Probe auf dem Objektträger hinzugefügt und dann mit einem Streifen aus Paraffin (zur Vermeidung von Austrocknung der Probe) bedeckt und in feuchten Kammer inkubiert und für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Der primäre monoklonale oder polyklonale Antikörper gegen das Virus-Antigen ist in Blocking-Lösung bei einer 1:50-Verdünnung vorbereitet, gemischt mit einer Pipette und auf Eis gestellt, bis sie benötigt. Fünfzig bis 100 ul Antikörper-Lösung wird pro Gewebeprobe abhängig von der Größe der Proben und die Anzahl der Folien benötigt werden.
- Unmittelbar nach der Inkubation Blocking-Lösung ist aus der Folie geschüttelt und 50-100 ul des primären Antikörpers an die Gewebeprobe, die dann mit einem Streifen aus Paraffin abgedeckt aufgenommen. Die Proben werden für 1-2 Stunden in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert.
- Folien mit Mustern werden dann waschen für jeweils 5 Minuten in PBS pH 7,4, auf die eine sekundäre biotinylierten Ziege-anti-Maus-Antikörper in einer Verdünnung 1:100 in PBS pH 7,4 hinzugefügt und inkubiert in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur für 30 3x - 45 Minuten.
- Etwa 30 Minuten vor der Verwendung wird die Peroxidase konjugierten Streptavidin in PBS pH 7,4 zubereitet. Mit dem DAKO Cytomation Duet Kit, mit 50 ul der Lösung A auf 5 ml PBS pH 7,4, vortex, und fügen Sie dann 50 ul Lösung B und nochmals mischen.
- Nach der Antikörper-Inkubation in Schritt 6.10 in abgeschlossen ist, werden die Objektträger gewaschen in PBS pH 7,4 3x und dann die frisch prepared Meerrettichperoxidase konjugierten Streptavidin-Lösung zugegeben und bei Raumtemperatur für 30-45 Minuten in einer feuchten Kammer.
- Nach der Inkubation werden die Objektträger gewaschen in PBS pH 7,4 3x bei Raumtemperatur. Fünf Minuten vor dem Waschen vollständig ist, die 3, 3-Diamino-Benzidin (DAB, SIGMA)-Substrat-Lösung (20 ml PBS pH 7,4, 25 ul von 3% Wasserstoffperoxid und 1 Tablette DAB) hergestellt. Nach dem DAB Tablette vollständig aufgelöst ist, wird die bräunlich gefärbten Lösung durch einen 0,45-Mikron-Spritzenfilter filtriert. Die gefilterte DAB Lösung wird dann auf den Proben zugegeben, nachdem das letzte Wasch-und Farb-Entwicklung für KSHV LANA in infizierten Zellen in Echtzeit unter Hellfeldbeleuchtung mit einem Nikon Eclipse E200 Mikroskop beobachtet. Sobald die gewünschte Farbe der Entwicklung erreicht ist, wird die Reaktion durch Inkubation in destilliertem Wasser für 5 Minuten gelöscht.
- Für Dual gekennzeichnet IHC, nach Inkubation in Wasser die Folien mit Mustern sind durch die IHC-Protokoll zum zweiten Mal ab dem Antigen-Retrieval Schritt (6,4) setzen. Doch das Protokoll Änderungen an der Peroxidasesubstrat Schritt (6.11) dadurch, dass anstelle der Meerrettichperoxidase konjugierten Streptavidin, eine alkalische Phosphatase-Konjugat Streptavidin eingesetzt wird
- Die zweite Kennzeichnung wird durch einen zusätzlichen Antigen-Retrieval Schritt in der Mikrowelle, wie oben beschrieben sowie eine zweite Immunfärbung mit einem monoklonalen Antikörper gegen das zelluläre Protein gefunden werden dysregulated (Vector Laboratories, Burlingame, CA) erreicht. Die Zellen werden anschließend gewaschen und anschließend mit einem biotinylierten Ziege anti-mouse/rabbit IgG-Antikörper (DAKO) in einer 1:100 Verdünnung durch eine alkalische Phosphatase-Streptavidin-Konjugat (Vector Labs, Burlingame, CA) bei 1:500 Verdünnung gefolgt inkubiert. Farbentwicklung wird durch Inkubation von Zellen mit dem Substrat Vektor rot mit einem Vector Red alkalischer Phosphatase Substrat Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers erreicht. Gegenfärbung, wenn gewünscht, kann mit orecin oder Hämatoxylin durchgeführt werden. Gewebeproben werden dann dauerhaft mit permount Eindeckmittel mit einem Deckglas montiert. Die Bilder sind unter Hellfeldbeleuchtung mit einer Nikon TE-2000S-Mikroskop mit einer CCD-Kamera montiert genommen.
7. Gentransfer durch Adenovirus Transduktion von DMVEC Cells
- Normale DMVEC Zellen sind in Kammer-Objektträgern bei Beschichtung von Dichte 2,5 x10 5 Zellen pro Kammer EBM-2 komplette Medien kultiviert.
- DMVEC Zellen sind zu 80% Konfluenz (unter 3-5 Tage) nach dem 5 ul / Chamber Slide Fenster Adenovirus EGFP bei einem Titer 1X 10 10 Partikel / mL. Gewachsen
- Live-DMVEC Zellkulturen mit Adenovirus hinzugefügt wurden EGFP-Fluoreszenz 18 Stunden nach der Zugabe des Virus untersucht.
- Individual-Phase und Fluoreszenz-Aufnahmen wurden an insgesamt Vergrößerung von 200X übernommen und fusioniert auf einer NIKON TE 2000S Fluoreszenzmikroskop mit einer CCD-Kamera montiert.
8. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Primäre DMVEC Zellen von Lonza Corporation sind in EBM-2-Medien erhalten und wurden mit BCBL-1 Virus bei einer moi von 0,01. Infiziert Nach der Infektion DMVEC Zellmonoschichten täglich untersucht wurden. Zehn Tage nach der Infektion mock infizierten Zellen zeigen einen Pflasterstein-Morphologie und KSHV infizierten Zellen zeigten eine Spindel Zelltyp charakteristische Morphologie spindelförmigen Endothelzellen infiziert mit KSHV in KS Tumorgewebe. Fotos wurden mit einer NIKON TE 2000S-Mikroskop mit einer CCD-Kamera an insgesamt Vergrößerung von 100X montiert genommen.
Abbildung 2. Zwei markierte indirekte Immunfluoreszenzfärbung wurde am KSHV infiziert DMVEC Zellen bei 10 Tagen nach der Infektion durchgeführt. Die infizierten Zellen wurden zwei gefärbt mit einem monoklonalen Antikörper gegen KSHV LANA und ein polyklonaler Ziege-Antikörper an eine bestimmte Wirtszelle Protein gefunden, nach KSHV Infektion verändert werden. Eine Mischung aus sekundären Esel anti-Maus-und Esel-anti-Ziegen-Antikörper, konjugiert mit Rhodamin und FITC wurden hinzugefügt. Die Zellen wurden mit einer Nikon TE2000S Fluoreszenzmikroskop mit einer CCD-Kamera ausgestattet untersucht. Eindeckmittel mit DAPI verwendet wurde, um Kerne zu visualisieren. Alle Aufnahmen wurden an insgesamt Vergrößerung von 200x genommen. Infizierte Zellen exprimieren das Virus LANA-Protein (Rhodamin gefärbt) lokalisiert Kern zeigen eine verminderte Expression der Wirtszelle spezifisches Protein (FITC) lokalisiert Zytoplasma.
Abbildung 3. IHC in KS Tumorgewebe für LANA und PECAM-1 / CD31. AIDS KS Tumorgewebe wurde von Single-und Dual gekennzeichnet IHC für KSHV LANA und PECAM-1 / C gebeiztD31. A) Zeigt KS Gewebe gefärbt mit einem monoklonalen Antikörper gegen LANA und mit Hämatoxylin gegengefärbt. LANA-positiven Zellen sind durch weiße Pfeile gekennzeichnet. B). KS Gewebe gefärbt mit einem monoklonalen Antikörper gegen PECAMI/CD31 und Färbung scheint spezifisch für Endothelzellen um Schiffe durch weiße Pfeile dargestellt. C) zeigt KS Gewebe Dual gefärbt LANA (Vektor rot) und CD31 (braun) durch schwarze Pfeile für LANA einen weißen für die Zellen Färbung für CD31 positive dargestellt. D) zeigt eine geringere Vergrößerung eines Raumes aus dem gleichen Bild in Panel C Hellfeld Bilder wurden auf einer NIKON TE2000S Mikroskop Gesamtvergrößerung von 600x AC fotografiert und 200x für Panel D.
Abbildung 4. Temporal Ausdruck KSHV LANA durch qRT-PCR 10 Tage nach der Infektion im Vergleich zu infizierten Kontroll-Zellen zu verspotten. Alle Werte für KSHV infiziert DMVEC Zellen GAPDH normalisiert wurden. Es gab keine Anzeichen von LANA cDNA-Amplifikation in mock infizierten Zellen.
Abbildung 5. KS Tumorgewebe Microarrays. Die Gewebe-Mikroarray (TMA) stellt 0,6 Millimeter Gewebe Kerne auf einem einzigen Objektträger angeordnet. Jedes Gewebe Kern stellt einen KS Tumorproben von einem anderen Patienten. TMA zur Verfügung gestellt wurden durch die AIDS-Krebs-Präparat Resource (ASCR) von Leona Ayers MD an der Ohio State University. Paraffin eingebettet KS Tumorgewebe zusammen mit abgestimmt normale und positive Kontrolle Gewebe wurden auf Glasobjektträger gelegt. KS Gewebeproben wurden von Mund, Haut, weicher Gaumen, Zunge und Hals Massen ergriffen. Alle Patienten waren HIV-positiv.
Abbildung 6. Tissue Microarrays wurden KSHV LANA immunhistochemisch gefärbt und wurden von Hellfeld-Mikroskopie analysiert. Farbentwicklung für LANA mit DAB wurde als Peroxidasesubstrat durchgeführt und LANA-positiven Zellen wurden durch eine intensive Braunfärbung Muster. Unterschiedliche Mengen der viralen Belastung und Spindel Zelle Regionen beobachtet werden können. A) stellt Mittelpunkt Virusinfektion in definierten Bereich des Tumors. B) stellt disseminierte Infektion mit hoher Viruslast, die ungefähr mit der Zahl der Spindelzellen vorhanden ist korreliert. Stained Gewebe Kerne wurden in 200-facher Vergrößerung beobachtet.
Abbildung 7. DMVEC Zellen in EBM-2 komplette Medien mit einer Dichte von 2,5 x10 5 Zellen pro Well kultiviert wurden mit 5 ul des Adenovirus transduziert bei einem Titer von 1.0X10 10. Cells für EGFP-Fluoreszenz 18 Stunden nach Transduktion wurden untersucht. Beide Phasen-und Fluoreszenz-Bilder wurden auf einem Nikon TE 2000S-Mikroskop bei einer Vergrößerung von 200X insgesamt übernommen. Transfektion von primären Zellen DMVEC hat sich problematisch deshalb haben wir identifiziert viralen Vektoren, die es uns ermöglichen, Fibulin-2 und galetin-3 sehr effizient liefern in primären DMVEC werden. Wir fanden, dass ein Adenovirus, EGFP effizient transduzieren primäre DMVEC. Wir fanden auch, dass die lentiviralen Vektors wir von Lentigen Corporation erhalten gleichermaßen effizient für transduzierenden primäre DMVEC Zellen (Daten nicht gezeigt) war.
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Discussion
Die Methoden in diesem Bericht verwendet werden kann in einer Vielzahl von Labor-Einstellungen vorgenommen werden. Sie erfordern eine spezielle Ausrüstung oder den Zugang zu zentralen Einrichtungen. Die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, wenn dabei Experimente mit infektiösen viralen Krankheitserreger wie KSHV, die den Einsatz einer mit Gentechnik-Stufe 3 (BSL-3) Einrichtungen erfordern kann. Tissue Akquisitionen müssen auch von den entsprechenden Institutional Review Boards (Ethikkommissionen) genehmigt werden.
Diese Methoden können zusammen eine Grundlage für die Identifizierung von Genen, die in Expression in vitro dysregulierten sind und eine definierte Methoden zur in vivo Validierung der veränderten Genexpression Profile sowie Strategien für den Gentransfer in Endothelzellen. Diese Ergebnisse zusammen genommen kann helfen, biochemische Stoffwechselwege, die von KSHV Infektion und anschließend durch spezifische virale Gene betroffen sind, zu erläutern. Ein Verständnis davon, wie onkogenen Viren wie KSHV unterbrechen spezifische molekulare Signalwege könnten Einblicke in die Entwicklung neuer Therapeutika.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken James EK Hildreth, Meharry Medical College, für seine Beratung und Überprüfung des Manuskripts. Wir danken auch Diana Marver für die Bearbeitung des Manuskripts. Zentrum für AIDS Gesundheit Disparitäten Forschung, NIH 5U54 RR019192-05;; die Meharry Zentrum für Klinische Forschung, NIH Grant P20RR011792; Diese Arbeit wurde von der Vanderbilt Meharry Center for AIDS Research (NIH P30 AI054999-05) unterstützt und von NIH gewähren P01 CA113239. DJA wurde teilweise durch Piloten Zuschüsse aus dem Vanderbilt-Meharry Center for AIDS Research (CFAR) und die Meharry Zentrum für Klinische Forschung (CRC) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| PBS pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | 19364 (FLUKA) | |
| EBM-2 media | Lonza Inc. | CC-3156 | + bullet kits supplement |
| DMVEC cells (HMVEC) | Lonza Inc. | CC2543 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SH30066.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Chamber slides | Nalge Nunc international | 154461 | |
| KSHV LANA Mab | Vector Laboratories | VP-H913 | 1:50 dilution/IFA |
| Galectin-3 goat pAb | R&D Systems | AF1154 | |
| Donkey-anti-goat FITC | Jackson ImmunoResearch | 705-095-1 | |
| Donkey-anti-goat Rho | Jackson ImmunoResearch | 705-295-003 | 1:100 dilution/IFA |
| Mounting media | Vector Laboratories | H 1500 | Vectashield with DAPI |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce, Thermo Scientific | 23235 | |
| Nitrocellulose | Bio-Rad | 161-0112 | |
| Donkey-anti-goat-conj. | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC 2020 | |
| Western substrate | Pierce, Thermo Scientific | 34075 | |
| Biotin-rabbit-anti goat | Dako | 305-065-045 | |
| AP-Strepavidin conj. | Dako | K 0492 (kit) | |
| RNase DNase Free Set | Qiagen | 79254 | |
| MJ Mini Cycler | Bio-Rad | PTC-1148C | |
| Bio-Photometer | Eppendorf | 952000006 | |
| RC 6 Plus Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 46910 | |
| Coulter Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 392052 | |
| MYiQ iCycler Real Time PCR Detection System | Bio-Rad | 170-9770 | |
| TE 2000S Fluorescent microscope | Nikon Instruments | TE2000S | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938C | |
| Eclipse E 200 | Nikon Instruments | E 200 | |
| Sorvall Legend RT Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75004377 |
References
- Sitas, F., Newton, R. Kaposi's sarcoma in South Africa. J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).
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