Summary
Konak hücre faktörleri, kuruluş ve Kaposi sarkomu (KS) bakım çok önemli bir rol oynamaktadır. Biz KSHV enfekte DMVEC hücreleri değişmiş konak hücre faktörleri belirlemek için yöntemler anahat ve KS tümör dokusu. Virüs tarafından değiştirilmiş Hücresel gen roman tedavi için potansiyel hedef (ler) olarak hizmet edecektir.
Abstract
KS en baskın Güney Afrika'da HIV / AIDS ile ilgili malignite ve dolayısıyla dünyada 1,2 vasküler endotelyal hücreler bir angioproliferative tümör olarak karakterize edilir ve plevral efüzyon lenfomalar şeklinde nadir B hücreli lenfoproliferatif hastalıklar (PEL ) ve multisentrik Castleman hastalığının bazı formları, KS 3-5 hücrelerin sadece% 1-5 Kaposi sarkomu-ilişkili herpes (KSHV), KS ile ilişkili etiyolojik ajan litik çoğaltma aktif destek lezyonlar, ve hücresel faktörler gerektiği açıktır . karsinojeneze ve tümör progresyonu sürecinde viral faktörler ile etkileşim. KS patoloji katkıda 6,7 belirlenmesi roman konak faktörü belirleyicileri sıra KS tedavisi için yeni terapötikler geliştirilmesi için tümör progresyonu ve metastaz için prognostik göstergeleri geliştirmek için gerekli mikroarray analizi düzensiz genler tarafından tespit edildikten sonra 8 eşlik eden video ayrıntıları dermal mikrovasküler endotel hücreleri (DMVEC) KSHV enfeksiyon sonrası ve KS tümör dokusu değişmiş konak hücre gen ekspresyon programları tanımlamak için kullandıkları yöntemleri. 9, protein ekspresyonunda değişiklikler immunoblotting ve çift etiketli immünofloresan doğruladı. Düzensiz genlerin transkripsiyonel ifade değişiklikler kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (QRT PCR) ile in vitro teyit edilir. Arşiv KS tümör dokusu kullanılarak in vitro bulgular Doğrulama ayrıca çift etiketli immünokimyanın tuvar 8,10 Bizim yaklaşımımız, in vitro ve in vivo model sistemler daha sonra gelişmesi için izin KS tümör dokusu mikroçevresinin düzensiz genlerin belirlenmesi amacıyla KS tedavisi için potansiyel yeni tedavi keşif ve değerlendirme.
Protocol
1. DMVEC KSVH Yetiştirme ve Enfeksiyon
- BCBL-1 hücre hattı, aslında bir insan vücut boşluğuna dayalı lenfoma izole, tam RPMI 1640 medya (Gibco, Grand Island, NY) kültüre. BCBL-1 hücreleri 37, sıvı nitrojen kaldırıldı kuru buz üzerinde taşınan ve 1 dakika boyunca hızlı bir şekilde çözülmüş ° C Bir yoğunluk 1x10 4 hücre / ml BCBL-1 hücreleri 50 mcL kısım 50 ml / şişesi, 500 ml% 10 fetal buzağı serumu, 1x penisilin / streptomisin ile desteklenmiş ve 175 cm ölçülü balona RPMI 1640 medya eklenir .
- BCBL-1 hücreleri şişeler sonra 37 inkübe ° C% 5 CO2 atmosferi hücre yoğunluğu 3x106 hücre / ml ulaşana kadar. Parçalayıcı döngüsü virüs çoğaltma 0.3 ng / ml 20ng / ml ve sodyum bütirat TPA ekleyerek indüklenir.
- Yirmi dört saat indüksiyon hücreler PBS pH7.4 santrifüj yoluyla Sorvall Legend RT santrifüj 1500 rpm (butirat kaldırmak için) 40 ml hacminde iki kere yıkanır, ve indüksiyon TPA 20 ng / ml ile devam 5 gün daha RPMI 1640.
- Hücre ücretsiz virüs izole ve ayırıcı santrifüj yoğunlaşmıştır. Kısaca, hücre ve hücre artıkları bir Sorvall 4 RC-6 Plus santrifüj ° C de 30 dakika 10.000 rpm'de ilk pelet. 25.000 rpm hızında 1 saat 4 ° C'de virüs içeren süpernatant Beckman Coulter Optima L-90K ultrasantrifüjdeki kaldırılır ve hücre ücretsiz virüs pelet.
- Virüs ücretsiz süpernatant kaldırılır ve viral pelet gerekli ° C ye kadar donma medyada yeniden süspanse (% 10 dimetil sülfoksit ve% 90 fetal sığır serumu) ve -80 saklanır.
Birincil DMVEC hücrelerinin KSHV enfeksiyonu. - Geçit seviyesi 2-5 DMVEC hücreleri 37 bir başlangıç 100x20mm doku kültürü yemekleri ya da odasının slaytlar 1 X 10 5 yoğunlukta kaplama ve tam EMB-2 medya (Lonza, Basel, İsviçre) tutulur bir ° C % 5 atmosferi 2 CO. % 80 birleştiği noktada yer DMVEC 0,01, bir moi enfekte; sahte enfekte (medya sadece) hücreleri kontrol grubu olarak kullanılır. Taze medya her 2 günde hücreleri eklenir.
- DMVEC hücre mono tabakaları ve oda slaytlar mil hücre oluşumunu belirtildiği gibi enfeksiyon bulgusu için günlük olarak incelenir. Mili hücre oluşumunun ilk işareti sonra (7-14 gün), medya değişiklikler bırakın. Ancak, taze medya vermeden 15-21 gün aşırı uzun inkübasyon süreleri, kültür çanak ölüyor ya da kapalı kaldırma hücrelerde çıkan DMVEC hücrelerinin bütünlüğünü bozabilir.
- Enfeksiyon sırasında maksimum dingil noktada, hücre mono tabakaları, protein ya da RNA ekstraksiyonu için hücre pelet hazırlanması için hasat edilir. Oda slaytlar üzerinde Enfekte DMVEC hücrelerin önceden ısıtılmış PBS pH 7.4 ile 1 ml / pencere ile iki kez yıkanır. Oda slaytlar üzerinde Hücreler 2X PBS, pH 7.4 ile yıkandıktan sonra hasat edilir. Onları odalarının kaldırılması ve slaytlar immunofluorescent boyama (IFA) için ihtiyaç duyulan kadar -20 ° C'de yapılan% 100 metanol yerleştirmeden önce tamamen kuruyana kadar izin verilir.
2. Mock ve KSHV Enfekte DMVEC toplam RNA izolasyonu ve cDNA Üretimi
- Total RNA KSHV enfekte DMVEC ve Qiagen RNesay Mini TAKIMI (Qiagen, Valencia, CA) kullanılarak sahte enfekte hücreleri elde edilir. Kültür hücrelerinde RNA izolasyonu için kullanılan kaynak üretici protokol, hayvan doku işleme homojenizasyon adımları olmadan istihdam ancak.
- Kullanım kılavuzu ekinde yer alan üretici tavsiyelerine göre, Qiagen RNA ücretsiz DNAz Kit kullanarak sütun DNAseI RNA tedavisi için teklif seçeneği seçin. DNAaseI kirlenmesine neden olan herhangi bir genomik RNA hazırlık veya viral DNA düşürür. DNAseI tedavi RT-PCR, Mah-PCR ve mikroarray analizleri de dahil olmak üzere aşağı akış uygulamaları için kritik önem taşımaktadır.
- RNA sütun, üretici firma tarafından önerilen daha bir kez daha santrifüj kaldırılır yıkama tamponu talimatları ve herhangi bir kalıntı etanol göre yıkanır. Artık etanol elüsyon sonra RNA saflık uzlaşır.
- RNA sütundan yıkandı, önce son yıkamadan sonra ek bir santrifüj adım yapılır. RNA RNAse serbest su 30 mcL sütun yıkandı,. RNA sonra bir Eppendorf AG-6131 Bio-Fotometre sayısal ve saflık için analiz edilir. Optik yoğunluk oranı (260/280 nm), yüksek saflıkta RNA için tipik between1.8-2.0 olmalıdır.
- Mikroarray analizi için, RNA RIN yazılım algoritması kullanılarak bir Agilent 2100 Bioanalyzer analiz edilir. Bioanalyzer analiz 1-10 arasında bir RNA Bütünlük sayısı (RIN) sağlar, ancak 7-10 gelen RIN numaraları mikroarray veya QRT-PCR analizleri için tutarlı ve daha güvenilir sonuçlar vermeye kanıtlanmıştır. RNA izolasyon için ortalama RIN sayısıTed elimizde Qiagen RNAeasy kiti ile 7,5-9 arasında değişir.
- RNA kantitasyonu sütun 10mM Tris-EDTA, pH 7.6 99 mcL yıkandı, RNA 1 mcL ekleyerek elde edilir. RNA ve tampon bir pipet ile karıştırılır ve bir Eppendorf Bio-Fotometresi spektrofotometrik analiz için temiz bir küvet ekledi.
- Her örnek bir mikrogram Messenger RNA transkripsiyonu Yüksek Kapasiteli cDNA ters transkripsiyon kiti (Applied Biosystems, Foster City, CA) ile tersine çevirmek için önce üretici tarafından sağlanan rasgele hekzamer kullanarak astarlanmalıdır.
cDNA sentezi - Sentezlemek için tek, üreticinin talimatlarına göre Uygulamalı Biyosistem bir Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kit kullanımı ve devam toplam RNA cDNA mahsur.
- Reaktiflerin 2x ana karışımı yapılır ve 10 mcL hacmi RNA 0.5 ila 1 mg 10 mcL 2x ana reaktif karışımı eklenir. 1x çözüm hafifçe karıştırılır ve ters transkripsiyon, üreticinin talimatlarına göre bir BIORAD MJ Mini themal cycler yapılır.
- 20 mcL reaksiyon başına toplam RNA iki mikrogram kadar kullanılabilir. CDNA bir Eppendorf AG-6131 Bio-Fotometresi 260 nm'de quantitated, -80 saklanan ° C kadar QRT-PCR için gerekli.
3. Mock ve KSHV Enfekte DMVEC Hücreler Mikroarray Karşılaştırmalı Analizi
Laboratuvar hizmet için bir ücret bazında Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi Mikroarray Paylaşımlı Kaynak Çekirdek Tesis mikroarray analizi gerçekleştirir. Biz enfekte kontrol hücreleri alay KSHV DMVEC enfekte olmuş hücreleri genlerin transkripsiyonel disregülasyonu çıktı dosyaları karşılaştırın. KSHV enfekte olmuş hücrelerde, anjiogenez, hücre çoğalması ilgili veya metastatik biyobelirteçleri temsil eden transkripsiyonel düzensiz genler, in vitro, gerçek zamanlı PCR, Western blot ve çift IFA kullanarak KSHV enfekte DMVEC hücreleri kullanarak doğrulanır; sonuçlar arşiv KS tümör bulguları ile karşılaştırıldığında doku.
4. Model ve KSHV enfekte DMVEC Bulundu Kantitatif RT-PCR transkripsiyonel Analiz düzensiz Genler
- Real Time PCR ters üretilen saflaştırılmış bir RNA örnek kaynaklanan ve bir MyiQ Tek Renk Real Time PCR Algılama Sistemi (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) kullanılarak cDNA transkriptaz kullanılarak 96 de optik levhalar (Sorenson Bioscience, Inc.) 25 mcL reaksiyon hacmi. Bu prosedür oda mevcut olabilir gereksiz DNA / cDNA ile mümkün kirlenmesini önlemek amacıyla biyolojik güvenlik kabini yapılır.
- Bir ana karışımı bir konsantrasyonda, SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) ve ileri seçilen ve ilgi her gen için ters primerler kullanılarak her astar set için 1.5 mL tüpler üreticinin talimatlarına göre hazırlanır. RNAase DNAase ücretsiz H 2 O. yapılan ortalama 250 nM Her bir örnek, üç nüsha olarak yapılmalıdır.
- Konak hücre genleri QRT-PCR için primer dizileri çok KSHV enfekte DMVEC hücreleri ve KS tümörler ifade nükleer antijen ilişkili virüs gecikme KSHV LANA, primer dizileri içerir.
- 10 ng / ul stok cDNAs alay, enfekte ve KSHV enfekte DMVEC hücrelerden RNAase DNAase serbest H 2 O 01:03 seyreltilmiş; bu seyreltme 3μL her iyi eklenir . CDNA için kontrol kuyuları yerine su.
- 96 plaka, optik sızdırmazlık bantı (Bio-Rad Laboratories) ile mühürlenmiş, hafifçe karıştırılır ve kuyuların dibinde reaksiyon karışımının toplamak için 1000 rpm, oda sıcaklığında, 2 dakika süreyle santrifüj. Bio-Rad MyiQ Algılama Sistemi ve lamba çalıştırmak başlamadan önce 10 dakika ısınma süresi için izin vermek için şu anda açık.
- Sonra santrifüj 96 plaka bir Bio-Rad M iQ Tek Renk Real Time PCR Algılama Sistemi içine konur, bisiklet dizilerinin program girdi ve kaydedilir ve çalışma başladı.
- Bisiklete binme sırası aşağıdaki gibi: 3 dakika boyunca 95 ° C, 95 ° C'de 15 saniye, 60 ° C, 1 dakika boyunca 95 ° C 'de 1 dakika süreyle, 55 ° C' de 1 dakika ve 55 ° C 'de 30 saniye süreyle toplam 81 döngüleri. Erime eğrisi astar verimliliği için bir onay olarak bu programa dahil edilmiştir. GAPDH astar seti amplifiye ve normalleşme dahil.
- Bio-Rad iQ5 Optik Sistemi Yazılımı Sürüm 2 Veri analizi ile yapılır.
5. KSHV Enfekte DMVEC Hücreleri Çift Etiketli İmmünofloresan Analizi
- Enfekte olan ve olmayan her iki konfluent DMVEC içeren Odası slaytlar (odalarından kaldırıldı) PBS pH 7.4 ile iki kez yıkanır, hava kuru ve 10 dakika boyunca -20 ° C önceden soğutulmuş mutlak metanol sabit ve -20 ° C'de tutulan
- Hücrelerle birlikte Slaytlar incitr hava 15 dakika süreyle kurutulur ve 5 dakika boyunca Tris salin (0.05M Tris pH: 7.4) içeren buz üzerinde bir Coplin kavanoza yerleştirilir. Hücreler daha sonra 37 'de 1 saat inkübe ° C PBS pH 7.4 1:50 seyreltme (Vektör Laboratories, Burlingame, CA) artı bir keçi poliklonal antikor (1 KSHV LANA monoklonal antikorlar bir karışımı ile nemlendirilmiş bir odasında: KSHV enfekte DMVEC hücreleri kullanarak mikroarray tarafından dyregulated bulundu ana faktör proteinine karşı PBS pH 7.4 100 dilüsyon).
- Bu hücreler daha sonra Tris salin (hücreleri kurumasına asla izin) ile 3x yıkanmalı ve ardından ikincil bir eşek rodamin kırmızı-X ve eşek anti-keçi antikorları ile konjuge anti-fare IgG bir karışımı ile konjuge 30 dakika boyunca inkübe FITC (Jackson ImmunoResearch, Batı Grove, PA), hem de PBS bir 1:100 dilüsyon.
- Hücreler daha sonra bir Coplin kavanoza Tris salin 3x yıkanır ve slaytlar hala nemli iken, slaytlar 1,5 g / ml DAPI ve lamel içeren Vectashield montaj medya (Vektör Laboratories, Burlingame, CA) ile monte edilir.
- Floresans gözlenen ve charge-coupled device (CCD) kamera monte Nikon TE 2000'lerin floresan mikroskobu ile fotoğraflandı görüntüleri. Fotoğraflar 200x toplam büyütme 20x objektif kullanılarak alınır.
- DAPI (200x) için kullanılan aynı büyütme ayrı bir fotoğraf,, usinge UV aydınlatma rodamin için yeşil filtre ve FITC mavi bir filtre ile alınır. Bu görüntüleri daha sonra Nikon'un ücretsiz yazılımı kullanılarak birleştirilir.
6. KSHV Lana ve Endotel Hücre Marker Pecam-1/cd31 Ks Doku ve Ks Doku Mikroarray'ler Çift Etiketli İmmünohistokimya
- Çift etiketli immünohistokimya KSHV LANA ve virüs enfeksiyonu sonra değişmiş bulunan bu konak hücre proteinleri DAKO strepavidin ABC düet boyama kiti ile yapılır. İHK, formalin içinde sabit arşiv AIDS-KS doku üzerinde yapılan ve parafine gömüldü.
- Beş mikron bölümlerde bir mikrotom ile kesilir ve önce immün chemate slaytlar üzerinde yerleştirilir.
- Parafin slaytlar davlumbaz altında 10 dakika için ksilen deparaffinzed ve sonra hücreler kademeli bir beş dakika her biri için% 100,% 95 ve% 70 etanol dizi sulu olan. Slaytlar sonra antijen maskesinin düşürülmesi (antijen alma olarak bilinen) önce 10 dakika boyunca su konur.
- Immün için, antijen maskesinin düşürülmesi için 95 ° C'de 15 dakika 50 mM sitrat pH 6.0 tampon bir mikrodalga fırın yapılır. Kısaca, hücreler daha sonra distile su ile oda sıcaklığında tutulan hemen 15 dakika boyunca 95 ° C sitrat tampon yerleştirilir batmış içeren slaytlar.
- Endojen peroksidaz soğutması, 30 dakikada bir su verme çözümü için slaytlar kuluçka tarafından yapılır. Kısaca, 47 ml 50 ml konik tüp% 95 etanol ekleyin; 11.2 ml PBS pH 7.4 ve 1.8 ml toplam 60 mL% 3 hidrojen peroksit ekleyin.
Su verme çözümü, kullanımdan hemen önce yapılır. - Bu hücreler daha sonra, her biri 5 dakika oda sıcaklığında PBS pH 7.4 3x yıkanır. Bir engelleme çözümü (12.5 ml% 95 etanol, 1.4 ml normal keçi serumu, 140 mg, sığır serum albümin ve 2 damla Tween 20) antikor nonspesifik bağlama önlemek için hazırlanmıştır. Kullanmadan önce buz üzerinde yerleştirin. (Bu engelleme çözümü, 4 ° C ve 1 hafta kadar saklanabilir).
- Engelleme çözüm slayttaki örnek eklenir ve sonra parafin bir şerit (numunenin kurumasını önlemek için) ile kaplanmış ve nemlendirilmiş odasına yerleştirilen ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe.
- 01:50 seyreltme çözüm engelleme hazırlanan viral antijen birincil monoklonal veya poliklonal antikor, bir pipet ile karıştırılır ve gerektiği kadar buz üzerinde yerleştirilir. Antikor çözüm Elli 100 mcL örneklerin boyutu ve slayt numarası bağlı olarak doku örneğinin başına ihtiyaç duyulacaktır.
- Inkübasyondan sonra hemen bloke çözüm slayt sarsılmış ve birincil antikor 50-100 mcL sonra parafin şerit ile kaplıdır doku örneği eklenir. Örnekler, oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odasında 1-2 saat inkübe edilir.
- Örnekler içeren Slaytlar sonra 5 dakika süreyle PBS pH 7.4 PBS pH 7.4 1:100 dilüsyon ikincil biotinlenmiş keçi anti-fare antikor eklenir ve oda sıcaklığında 30 nemlendirilmiş bir odasında inkübe olduğu her 3x yıkayın. 45 dakika.
- Yaklaşık 30 dakika kullanmadan önce, PBS pH 7.4 konjuge strepavidin peroksidaz hazırlanmıştır. DAKO Cytomation Duet Kit kullanarak, çözüm 50 mcL PBS, pH 7.4, vorteks, 5 ml ve 50 mcL ardından B çözeltisi eklenir ve tekrar karıştırılır.
- Tam adım 6.10 antikor inkübasyondan sonra, slaytlar, PBS, pH 7.4 3x yıkanmış ve daha sonra taze prepared horseradish peroksidaz konjuge strepavidin çözüm nemlendirilmiş bir odasında 30-45 dakika ilave edilir ve oda sıcaklığında inkübe edilir.
- Inkübasyondan sonra oda sıcaklığında, slaytlar, PBS, pH 7.4 3x yıkanır. Yıkamadan önce beş dakika, 3, 3-Diamino-benzidin (DAB, SIGMA) substrat çözeltisi (PBS, pH 7.4,% 3 hidrojen peroksit 25 mcL, ve 1 DAB tablet 20 ml) hazırlanır. DAB tablet tamamen eridikten sonra, kahverengi renkli çözüm, 0.45 mikron şırınga filtresi süzülür. Enfekte hücrelerde KSHV LANA için son yıkama ve renk geliştirme Nikon Eclipse E200 mikroskop kullanılarak aydınlık aydınlatma altında gerçek zamanlı olarak görülmektedir sonra süzülür DAB çözüm daha sonra örneklerin eklendi. , Istenilen renk geliştirme elde edildikten sonra, reaksiyon, distile su ile 5 dakika boyunca kuluçka söndürülür.
- Çift etiketli IHC için örnekler içeren slaytları, su inkübasyondan sonra, antijen alımı adım (6.4) başlayan ikinci kez IHC protokolü üzerinden konur. Ancak peroksidaz substrat adım (6.11) protokol değişiklikleri yerine horseradish peroksidaz konjuge-strepavidin, alkali fosfataz strepavidin konjuge istihdam
- İkinci etiketleme, yukarıda açıklandığı gibi mikrodalga ek bir antijen alımı adım artı bir monoklonal antikor ile ikinci bir immün (Vektör Laboratories, Burlingame, CA) düzensiz bulunan hücresel protein elde edilir. Hücreler daha sonra yıkanır ve sonra, 1:500 seyreltme bir alkalin fosfataz strepavidin konjuge (Vektör Labs, Burlingame, CA) tarafından takip, 1:100 dilüsyon biotinlenmiş keçi anti-mouse/rabbit IgG (DAKO) ile inkübe edilir. Renk geliştirme, üreticinin talimatlarına göre Vektör Kırmızı alkalin fosfat substratı kiti (Vektör Laboratories, Burlingame, CA) kullanılarak yüzey vektör kırmızı kuluçka hücreleri tarafından sağlanır. Sayaç boyama, istenirse, orecin veya hematoksilen ile olabilir. Doku örnekleri daha sonra kalıcı bir cam kapak ile permount montaj medya ile monte edilmiştir. Görüntüler bir CCD kamera ile monte Nikon TE-2000'lerin mikroskop ile aydınlık aydınlatma altına alınır.
7. DMVEC Hücre Adenovirüs İletimi tarafından Gen Teslimat
- Normal DMVEC hücreleri kamara EBM-2 eksiksiz bir medya ortalama yoğunluğu 2.5 X10 5 hücreleri kaplama oda slaytlar yetiştirilmektedir.
- DMVEC hücreleri,% 80 izdiham (3-5 gün alarak) sonra 5 ul / titresi 1X adenovirüs ifade EGFP odasına slayt penceresi 10 10 partikül / ml. büyüdü
- Adenovirüs eklenmiş DMVEC hücre kültürleri Canlı virüs ekledikten sonra, EGFP floresan 18 saat boyunca incelendi.
- Bireysel faz ve floresan fotoğraflar 200X toplam büyütme alınır ve bir CCD kamera ile monte NIKON TE 2000'lerin floresan mikroskop birleşti.
8. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1. EBM-2 medya Lonza Corporation'ın İlköğretim DMVEC hücrelerde tutuldu ve enfeksiyon DMVEC hücre mono tabakaları günlük incelendi sonra bir moi 0.01. BCBL-1 virüsü ile enfekte olmuş. On gün sonrası enfeksiyon sahte enfekte olan hücreleri gösterir bir arnavut kaldırımlı gibi morfoloji ve KSHV enfekte olmuş hücreler iğsi endotel hücreleri iğ hücre tipi morfolojisi karakteristik KS tümör dokusu KSHV ile enfekte bulundu sergilenmektedir. Fotoğraflar toplam 100X büyütmede bir CCD kamera ile monte NIKON TE 2000'lerin mikroskop ile alınmıştır.
Şekil 2. Çift etiketli dolaylı immünofloresan boyama 10 gün enfeksiyonu KSHV DMVEC enfekte olmuş hücreleri üzerinde yapıldı. Enfekte hücreler çift KSHV LANA bir monoklonal antikor ve KSHV enfeksiyondan sonra değiştirilemez belirli bir konak hücre proteini bir keçi poliklonal antikor ile boyandı. Ikincil eşek anti-fare ve eşek rodamin ve FITC konjuge anti-keçi antikorları karışımı ilave edildi. Hücreler bir CCD kamera ile donatılmış Nikon TE2000S floresan mikroskobu ile incelendi. DAPI ile medya Montaj çekirdekleri görselleştirmek için kullanılır oldu. Tüm fotoğrafların 200x toplam büyütmede alınmıştır. Enfekte hücre çekirdeğinde lokalize virüs LANA protein (rodamin vitray) ifade konak hücre sitoplazmasında lokalize belirli bir proteinin (FITC lekeli) azalmış ekspresyonu göstermektedir.
Şekil 3. LANA ve PECAM-1 / CD31 KS tümör dokusu IHC AIDS KS tümör dokusu KSHV LANA ve PECAM-1 / C için tek ve çift etiketli İHK ile boyandıD31. A) LANA bir monoklonal antikor ile KS doku boyanmış gösterir ve hematoksilen ile zıt. LANA pozitif hücrelerin beyaz oklar tarafından tespit edilir. B). KS doku PECAMI/CD31 bir monoklonal antikor ile boyandı ve boyama beyaz oklar ile tasvir damarlarının etrafında endotel özgü görünür. C), CD31 için pozitif boyanma hücreler için LANA beyaz bir siyah oklar ile tasvir KS LANA (vektör kırmızı) ve CD31 (kahverengi) için doku çift boyanmış gösterir. D) Panel için bir alt panel C. aydınlık görüntüler aynı slayt bir alanı büyütme 600x AC toplam büyütme NIKON TE2000S mikroskop fotoğrafları çekildi ve 200x gösterir D.
Şekil 4. QRT-PCR 10 gün enfeksiyonu KSHV LANA Geçici ifade enfekte kontrol hücreleri alay göre KSHV enfekte DMVEC hücreler için tüm değerleri GAPDH normalize edildi. Sahte enfekte hücrelerde LANA cDNA hiçbir kanıt yoktu.
Şekil 5. KS tümör dokusu mikroarray'ler doku mikroarray (TMA), tek bir slayt dizilmiş 0.6 milimetre doku çekirdeği temsil eder. Her doku çekirdek farklı bir hasta bir KS tümör örnek temsil eder. TMA, Ohio State Üniversitesi Leona Ayers MD AIDS Kanser Numune Kaynak (ASCR) ile sunulmuştur. Parafin uyumlu normal ve pozitif kontrol dokuları ile birlikte KS tümör dokusu gömülü cam slaytlar yerleştirildi. Ağız, deri, yumuşak damak, dil ve boyun kitlelerinde KS doku örnekleri alındı. Tüm hastalar HIV pozitif.
Şekil 6. Tuvar KSHV LANA immünohistokimya ile boyandı ve aydınlık mikroskobu ile incelendi. LANA için Renk geliştirme peroksidaz substrat olarak DAB ile yapılan ve LANA pozitif hücrelerin yoğun bir kahverengi boyanma paterni tarafından görüntülendi. Viral yükü ve iğsi hücreli bölgelerinde farklı miktarlarda görülebilir. A) tümör tanımlanan bölgede fokal viral enfeksiyon temsil eder. B) yüksek viral yükü ile kabaca mevcut iğ hücrelerinin sayısı ile ilişkili olduğu yaygın enfeksiyon temsil eder. Vitray doku çekirdekleri 200x büyütme gözlendi.
Şekil 7. Ortalama 2.5 X10 5 hücre yoğunluğu EBM-2 eksiksiz bir medya yetiştirilmektedir DMVEC hücreleri 1.0X10 10 titresi 5 mcL Adenovirüs transduced. Hücreler EGFP floresans 18 saat transdüksiyon incelendi. Her iki faz ve floresan görüntüler 200X toplam büyütmede Nikon TE 2000'lerin mikroskobu alınmıştır. Birincil DMVEC hücreler Transfeksiyon bize birincil DMVEC fibulin çok verimli-2 ve galetin-3 sunmak için izin verecek sorunlu bu nedenle tespit viral vektörlerin olduğu kanıtlanmıştır. Biz bir adenovirüs ifade EGFP verimli birincil DMVEC transduce bulundu. Ayrıca, biz Lentigen Corporation'ın elde lentiviral vektör birincil DMVEC hücreleri (veriler gösterilmemiştir) uyum için de aynı derecede etkili olduğu bulundu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu raporda kullanılan metodolojileri, çeşitli laboratuar ayarları yapılabilir. Onlar bazı özel ekipman ya da çekirdek tesislerine erişim gerektirir. KSHV bir biosaftey seviye 3 (BSL-3) özellikler kullanılması gerekebilir gibi bulaşıcı viral patojenler içeren deneyler yaparken uygun önlemler alınmalıdır. Doku satın almalar da uygun kurumsal inceleme kurulları (IRBs) tarafından onaylanmış olması gerekir.
Bu metodolojileri birlikte, in vitro ifade içinde düzensiz ve in vivo olarak değiştirilmiş gen ekspresyon profilleri doğrulama endotel hücreleri gen teslimat için stratejiler için tanımlanmış yöntemlerle sağlamak genleri tanımlamak için bir temel sağlayabilir . Birlikte ele alındığında bu bulgular, KSHV enfeksiyon ve daha sonra belirli viral genler tarafından etkilenen biyokimyasal yollar aydınlatmak için yardımcı olabilir. KSHV gibi onkojenik virüsler spesifik moleküler yollar kesme nasıl bir anlayış, yenilikçi tedavilerin geliştirilmesinde anlayışlar sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
James EK Hildreth, Meharry Tıp Koleji, onun tavsiye ve bu yazının incelenmesi için teşekkür ederiz. Ayrıca Diana marver yazının düzenleme için teşekkür ederim. AIDS Sağlık Farklılıkların Araştırma Merkezi, NIH hibe 5U54 RR019192-05; Meharry Klinik Araştırma Merkezi, erişmiş P20RR011792; Bu çalışma, AIDS Araştırma Meharry Vanderbilt Merkezi (NIH hibe P30 AI054999-05) tarafından desteklenen ve NIH tarafından Hibe P01 CA113239. DJA kısmen, AIDS Araştırma Vanderbilt Meharry Merkezi (CFAR) ve Meharry Klinik Araştırma Merkezi (CRC) pilot bağışları ile finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| PBS pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | 19364 (FLUKA) | |
| EBM-2 media | Lonza Inc. | CC-3156 | + bullet kits supplement |
| DMVEC cells (HMVEC) | Lonza Inc. | CC2543 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SH30066.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Chamber slides | Nalge Nunc international | 154461 | |
| KSHV LANA Mab | Vector Laboratories | VP-H913 | 1:50 dilution/IFA |
| Galectin-3 goat pAb | R&D Systems | AF1154 | |
| Donkey-anti-goat FITC | Jackson ImmunoResearch | 705-095-1 | |
| Donkey-anti-goat Rho | Jackson ImmunoResearch | 705-295-003 | 1:100 dilution/IFA |
| Mounting media | Vector Laboratories | H 1500 | Vectashield with DAPI |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce, Thermo Scientific | 23235 | |
| Nitrocellulose | Bio-Rad | 161-0112 | |
| Donkey-anti-goat-conj. | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC 2020 | |
| Western substrate | Pierce, Thermo Scientific | 34075 | |
| Biotin-rabbit-anti goat | Dako | 305-065-045 | |
| AP-Strepavidin conj. | Dako | K 0492 (kit) | |
| RNase DNase Free Set | Qiagen | 79254 | |
| MJ Mini Cycler | Bio-Rad | PTC-1148C | |
| Bio-Photometer | Eppendorf | 952000006 | |
| RC 6 Plus Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 46910 | |
| Coulter Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 392052 | |
| MYiQ iCycler Real Time PCR Detection System | Bio-Rad | 170-9770 | |
| TE 2000S Fluorescent microscope | Nikon Instruments | TE2000S | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938C | |
| Eclipse E 200 | Nikon Instruments | E 200 | |
| Sorvall Legend RT Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75004377 |
References
- Sitas, F., Newton, R. Kaposi's sarcoma in South Africa. J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).
- Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. Field's Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).
- Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles, D. M., Moore, P. S. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P., Said, J. W., Knowles, D. M., M, D. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N Engl J Med. 18, 1186-1191 (1995).
- Cesarman, E., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: a lymphotropic human herpesvirus associated with Kaposi's sarcoma, primary effusion lymphoma, and multicentric Castleman's disease. Semin Diagn Pathol. 14, 54-66 (1997).
- Chiou, C. J., Poole, L. J., Kim, P. S., Ciufo, D. M., Cannon, J. S., ap Rhys, C. M., Alcendor, D. J., Zong, J. C., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J Virol. 76, 3421-3439 (2002).
- Staskus, K. A., Zhong, W., Gebhard, K., Herndier, B., Wang, H., Renne, R., Beneke, J., Pudney, J., Anderson, D. J., Ganem, D., Haase, A. T., T, A. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus gene expression in endothelial (spindle) tumor cells. J Virol. 71, 715-719 (1997).
- Alcendor, D. J., Zhu, W. Q., Desai, P., Vigil, H. E., Hayward, G. S. KSHV downregulation of galectin-3 in kaposi's sarcoma. Glycobiology. , (2009).
- Ciufo, D. M., Cannon, J. S., Poole, L. J., Wu, F. Y., Murray, P., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Spindle cell conversion by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: formation of colonies and plaques with mixed lytic and latent gene expression in infected primary dermal microvascular endothelial cell cultures. J Virol. 75, 5614-5626 (2001).
- Long, E., Ilie, M., Hofman, V., Havet, K., Selva, E., Butori, C., Lacour, J. P., Nelson, A. M., Cathomas, G., Hofman, P. LANA-1, Bcl-2, Mcl-1 and HIF-1alpha protein expression in HIV-associated Kaposi sarcoma. Virchows Arch. 2, 159-170 (2009).
