Summary
Facteurs de la cellule hôte jouent un rôle essentiel dans la création et l'entretien du sarcome de Kaposi (SK). Nous présentons des méthodes pour identifier les facteurs de la cellule hôte modifiée en KSHV cellules infectées DMVEC, et dans le tissu tumoral KS. Gènes cellulaires altérés par le virus de se servir de cible potentielle (s) pour de nouveaux traitements.
Abstract
Actuellement KS est le plus prédominant du VIH / sida cancer liés à l'Afrique australe et par conséquent le monde 1,2. Elle se caractérise comme une tumeur angioproliferative des cellules endothéliales vasculaires et produit les maladies rares cellules B lymphoprolifératifs sous la forme de lymphomes épanchement pleural (PEL) et certaines formes de maladie de Castleman multicentrique. 3-5 seulement 1-5% des cellules dans les lésions KS soutenir activement la réplication lytique du sarcome de Kaposi associé herpèsvirus (KSHV), l'agent étiologique associé à KS, et il est clair que des facteurs cellulaires doivent interagissent avec des facteurs viraux dans le processus d'oncogenèse et la progression tumorale. Identifier 6,7 roman hôte facteur déterminants qui contribuent à la pathologie KS est essentiel pour le développement de marqueurs pronostiques de la progression tumorale et les métastases, ainsi que pour développer de nouvelles thérapies pour le traitement de KS 8. Les détails vidéo d'accompagnement des méthodes que nous utilisons pour identifier l'hôte cellulaire programmes d'expression génique altérée dans les cellules endothéliales microvasculaires dermiques (DMVEC) après l'infection KSHV et dans le tissu tumoral KS. 9 fois gènes dérégulé sont identifiés par l'analyse des microréseaux, des changements dans l'expression des protéines sont confirmée par immunoblot et double immunofluorescence étiquetés. Les changements dans l'expression transcriptionnelle de gènes dérégulé sont confirmés in vitro par quantitative en temps réel la réaction en chaîne polymérase (PCR qRT). Validation des résultats in vitro en utilisant des archives tissu tumoral KS est également effectuée par immunochimie étiquetés double et tissue microarrays. 8,10 Notre approche pour identifier les gènes dérégulé dans le microenvironnement KS tissu tumoral permettra le développement d'études in vitro et par la suite dans des systèmes modèles in vivo pour découverte et l'évaluation des thérapeutiques nouvelles potentielles pour le traitement du sarcome de Kaposi.
Protocol
1. La culture et l'infection des KSVH DMVEC
- La ligne BCBL-1 des cellules, initialement isolé à partir d'un lymphome cavité du corps humain basée, est cultivée dans du milieu RPMI 1640 complet (Gibco, Grand Island, NY). BCBL-1 cellules sont enlevées de l'azote liquide, et transportées sur glace sèche, et rapidement décongelés pendant 1 minute à 37 ° C. Une partie aliquote de 50 uL de BCBL-1 cellules à une densité 1x10 4 cellules / ml est ajouté à 500 ml de milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10% sérum de veau foetal, 1x pénicilline / streptomycine et distribuée dans 175 flacons cm, à 50 mL / flacon .
- Les flacons de BCBL-1 cellules sont ensuite incubées à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO 2 jusqu'à ce que la densité cellulaire atteint 3x106 cellules / ml. Lytique réplication du virus du cycle est induite par addition de TPA au butyrate 20ng / mL et de sodium à 0,3 ng / mL.
- Vingt-quatre heures après l'induction des cellules sont lavées deux fois dans du PBS pH 7,4 dans un volume de 40 ml par centrifugation à 1500 rpm dans une centrifugeuse Sorvall Legend RT (pour enlever le butyrate), et l'induction se poursuit avec le TPA à 20 ng / mL dans RPMI 1640 pour 5 jours de plus.
- Virus de la cellule libre est isolée et concentrée par centrifugation différentielle. Brièvement, les cellules et les débris cellulaires sont d'abord granulés à 10000 rpm dans un Sorvall RC-6 Plus centrifugeuse à 4 ° C pendant 30 minutes. Surnageant contenant le virus est supprimé et cellulaire du virus sans granulés dans un Beckman Coulter Optima L-90K ultracentrifugeuse à 4 ° C pendant 1 heure à 25 000 rpm.
- Le virus sans surnageant est éliminé et le culot viral remis en suspension dans les médias de congélation (10% de diméthylsulfoxyde et 90% sérum de veau foetal) et conservés à -80 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
L'infection de cellules primaires KSHV DMVEC. - Cellules DMVEC à 2-5 niveau de passage sont plaquées à une densité initiale de 1 x 10 5 en 100x20mm boîtes de culture tissulaire ou des diapositives de chambre, et sont maintenus en complète EMB-2 médias (Lonza, Bâle, Suisse) à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO 2. Au confluent de 80%, DMVEC sont infectées à une moi de 0,01; maquette infectés (médias seulement), les cellules sont utilisées comme témoins. Milieux frais est ajouté aux cellules tous les 2 jours.
- Monocouches de cellules DMVEC et les diapositives de chambre sont examinés quotidiennement pour des signes d'infection tel que noté par la formation de cellules fusiformes. Après le premier signe de la formation de cellules fusiformes (7-14 jours), nous discontinuer les changements de supports. Cependant, les temps d'incubation plus longues de plus de 15-21 jours sans fournir milieux frais peuvent compromettre l'intégrité des cellules DMVEC résultant dans les cellules meurent ou soulevant la boîte de culture.
- Au point de grêles maximale lors de l'infection, les monocouches de cellules sont récoltées pour la préparation de boulettes de cellules de protéines ou de l'extraction d'ARN. Les cellules infectées DMVEC sur des lames de chambre sont lavées deux fois avec 1 mL / fenêtre avec préchauffé PBS pH 7,4. Les cellules sur des lames de chambre sont récoltés après le lavage 2X avec du PBS pH 7,4. Leur a permis de sécher complètement avant d'enlever les chambres et en plaçant les lames dans du méthanol à 100% à -20 ° C jusqu'au moment de la coloration par immunofluorescence (IFA).
2. Total des isolement d'ARN et de production d'ADNc à partir de Mock et KSHV infectés DMVEC
- L'ARN total est extrait de KSHV infectés DMVEC et se moquer de cellules infectées en utilisant un Qiagen RNesay Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Le protocole du fabricant pour le traitement des tissus animaux est employée, mais sans les étapes homogénéisation, si les cellules cultivées sont la source utilisée pour l'isolement d'ARN.
- Sélectionnez l'option offerte pour traiter de l'ARN avec DNaseI sur la colonne en utilisant l'ARN Qiagen Free DNase Kit, conformément aux recommandations du fabricant situé dans l'annexe du manuel d'instruction. DNAaseI dégrade toute génomique contaminant ou ADN viral à partir de la préparation d'ARN. Le traitement DNaseI est critique pour les applications en aval, y compris la RT-PCR, qRT-PCR et des analyses de biopuces.
- L'ARN est lavé selon les instructions et tout éthanol résiduel dans le tampon de lavage est éliminé par centrifugation de la colonne une fois de plus que suggéré par le fabricant. L'éthanol résiduel compromis la pureté de l'ARN après élution.
- Après le lavage final une étape de centrifugation supplémentaire est effectué avant l'ARN peut être élue de la colonne. L'ARN est élué de la colonne avec 30 uL d'eau RNAse. L'ARN est ensuite quantifiés et analysés pour la pureté sur un Eppendorf AG-6131 Bio-photomètre. Le ratio de densité optique (260/280 nm) devrait être between1.8-2.0 qui est typique pour l'ARN d'une grande pureté.
- Pour l'analyse des microréseaux, l'ARN est analysé sur une bioanalyseur Agilent 2100 en utilisant l'algorithme du logiciel RIN. L'analyse sur le bioanalyseur vous fournit un numéro intégrité de l'ARN (RIN) de 1-10, cependant numéros RIN 7-10 ont prouvé leur donnent des résultats cohérents et plus fiables pour les analyses microarray ou qRT-PCR. Le nombre moyen d'ARN du RIN IsolaTed avec le kit Qiagen RNAeasy dans nos mains varie de 7,5 à 9.
- La quantification de l'ARN est obtenue en ajoutant 1 pl de l'ARN est élué de la colonne à 99 ul de 10 mM Tris-EDTA pH 7,6. L'ARN et le tampon est mélangée avec une pipette et ajouté à une cuvette de nettoyage pour l'analyse spectrophotométrique avec un Eppendorf Bio-photomètre.
- L'ARN messager dans un microgramme de chaque échantillon est amorcée en utilisant des hexamères aléatoires fournies par le fabricant, avant la transcription inverse avec une capacité d'ADNc kit Haute transcription inverse (Applied Biosystems, Foster City, CA.).
synthèse de l'ADNc - Pour synthétiser l'ADNc simple brin d'ARN total, nous utilisons une haute capacité kit ADNc transcription inverse d'Applied Biosystems et procéder selon les instructions du fabricant.
- Un master mix 2x de réactifs est faite et 0,5 à 1 ug d'ARN dans un volume de 10 uL est ajouté à 10 ul du mélange réactif maître 2x. La solution obtenue est mélangée doucement 1x et la transcription inverse est réalisée dans un BIORAD MJ Mini-Thermal cycleur conformément aux instructions du fabricant.
- Jusqu'à deux microgrammes d'ARN total peut être utilisé par 20 uL de réaction. L'ADNc est quantifié à 260 nm dans un Eppendorf AG-6131 Bio-photomètre, et conservés à -80 ° C jusqu'au moment de l'qRT-PCR.
3. Analyse comparative des biopuces Mock et KSHV cellules infectées DMVEC
Notre laboratoire effectue l'analyse des microréseaux à la Vanderbilt University Medical Center Laboratoire de biopuces partagée des ressources de base, sur une base de la rémunération des services. Nous comparons les fichiers de sortie pour une dérégulation transcriptionnelle des gènes dans les cellules infectées par le KSHV DMVEC pour se moquer de cellules témoins infectées. Transcriptionnelle des gènes dérégulé dans les cellules infectées KSHV qui sont pertinentes à la prolifération des cellules angiogenèse, ou qui représentent des biomarqueurs métastatique sont validés in vitro en utilisant des cellules infectées KSHV DMVEC utilisant PCR en temps réel, Western blot, et double IFA, les résultats sont comparés aux résultats dans la tumeur d'archives KS tissulaire.
4. RT-PCR quantitative analyse transcriptionnelle des gènes dérégulé Trouvé dans la maquette et de KSHV infectés DMVEC
- PCR en temps réel est effectuée dans 96 des plaques optiques (Sorenson Bioscience, Inc) en utilisant la transcriptase inverse produite ADNc provenant d'un échantillon purifié l'ARN et en utilisant un MyiQ Couleur unique réel système de détection par PCR en temps (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) et 25 volumes de réaction ul. Cette procédure est effectuée dans une enceinte de sécurité biologique pour éviter une éventuelle contamination par l'ADN étranger / ADNc qui pourraient être présents dans la salle.
- Un mélange maître est préparé dans des tubes de 1,5 ml pour chaque ensemble d'amorces (selon les instructions du fabricant) en utilisant SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) et sélectionnés avant et amorces inverses pour chaque gène d'intérêt, à une concentration de 250 nM par puits, faites dans la RNAse DNAse libre H 2 O. Chaque échantillon doit être effectué en trois exemplaires.
- Séquences d'amorces pour qRT-PCR pour les gènes de la cellule hôte comprennent des séquences d'amorce pour KSHV LANA, qui est la latence du virus associé antigène nucléaire qui est fortement exprimée dans les cellules infectées et les tumeurs KSHV DMVEC KS.
- Le NG 10 / ADNc stocks ul partir maquette infectées et les cellules infectées KSHV DMVEC sont dilués 01h03 utilisant ARNase ADNase sans H 2 O; 3μL de cette dilution est ajouté à chaque puits. Contrôle de l'eau des puits pour remplacer ADNc.
- La plaque 96 puits est scellé avec du ruban d'étanchéité optique (Bio-Rad Laboratories), délicatement mélangés et centrifugés pendant 2 minutes à 1000 rpm, la température ambiante, à recueillir le mélange réactionnel au fond du puits. Le système Bio-Rad détection MyiQ et la lampe est allumée à ce moment pour permettre un 10 minutes d'échauffement avant de commencer la période de l'exécuter.
- Le centrifugé 96 puits est ensuite mis dans une Bio-Rad M iQ Real Color système unique de détection par PCR en temps, le programme de séquences du cycle entrées et enregistrées, et la course a commencé.
- La séquence du vélo est comme suit: 95 ° C pendant 3 minutes, 95 ° C pendant 15 secondes, 60 ° C pendant 1 minute, 95 ° C pendant 1 minute, 55 ° C pendant 1 minute et 55 ° C pendant 30 secondes pour 81 cycles au total. Une courbe de fusion est inclus dans ce programme comme un chèque d'efficacité primaire. Un ensemble d'amorces GAPDH est amplifiée, et notamment pour la normalisation.
- L'analyse des données se fait avec le Bio-Rad iQ5 Version System Software optique 2.
5. Double analyse Étiqueté par immunofluorescence de cellules infectées par le KSHV DMVEC
- Diapositives Chambre (retirés des chambres) contenant à la fois DMVEC confluentes infectées et non infectées sont lavées deux fois avec du PBS pH 7,4, séché à l'air, et fixé à -20 ° C pré-réfrigérée méthanol absolu pendant 10 minutes et maintenue à -20 ° C.
- Diapositives avec des cellules sont efr séché à l'air pendant 15 minutes, et placé dans un bocal de Coplin sur la glace contenant du Tris salin (0,05 M Tris pH 7,4) pendant 5 minutes. Les cellules sont ensuite incubées pendant 1 heure à 37 ° C dans une chambre humidifiée avec un mélange d'anticorps monoclonaux pour KSHV LANA à une dilution 1:50 dans du PBS pH 7,4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) et un anticorps polyclonal de chèvre (1: 100 dilution en PBS pH 7,4) contre la protéine du facteur hôte trouvé à dyregulated par microarray utilisant des cellules infectées KSHV DMVEC.
- Les cellules sont ensuite lavées 3x avec Tris salin (jamais permettre aux cellules de sécher), puis incubées pendant 30 minutes avec un mélange d'un âne anti-souris conjugué anticorps secondaire IgG avec de la rhodamine rouge-X et d'âne anti-anticorps de chèvre conjugué à la FITC (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), à la fois à une dilution 1:100 dans du PBS.
- Les cellules sont lavées 3x tard dans Tris salin dans une jarre de Coplin et tandis que les lames sont encore humides, les lames sont montées avec Vectashield montage de médias (Vector Laboratories, Burlingame, CA) contenant 1,5 g / mL de DAPI et une lamelle.
- La fluorescence est observé et photographié des images avec un microscope Nikon 2000S TE fluorescentes montées avec une charge-coupled device (CCD). Les photographies sont prises en utilisant un objectif 20x pour un grossissement total de 200x.
- Photographies distinctes au même grossissement utilisé pour DAPI (200x), sont prises d'illumination UV usinge, avec un filtre vert pour la rhodamine et un filtre bleu pour FITC. Les images sont ensuite fusionnées en utilisant un logiciel freeware de Nikon.
6. Double Immunohistochemistry étiqueté sur le Ks de tissus et tissue microarrays Ks pour KSHV Lana et le marqueur de cellules endothéliales Pecam-1/cd31
- Double immunohistochimie étiqueté est réalisée avec le kit de coloration DAKO strepavidine ABC duo pour KSHV LANA et ceux des protéines de la cellule hôte trouvé modifié après infection par le virus. IHC est effectuée sur des archives SK-SIDA tissus fixés au formol et inclus en paraffine.
- Cinq sections microns sont coupés avec un microtome et placées sur des lames chemate avant immunocoloration.
- Diapositives sont incluses dans la paraffine deparaffinzed dans le xylène pendant 10 minutes sous une hotte, puis les cellules sont hydratés dans une série d'éthanol à 100%, 95% et 70% pour cinq minutes chacun. Les lames sont ensuite placés dans de l'eau pendant 10 minutes avant le démasquage antigénique (aussi connu comme extraction de l'antigène).
- Pour immunomarquage, démasquage antigénique est effectuée dans un four à micro-ondes dans le citrate 50 mM pH 6,0 tampon à 95 ° C pendant 15 minutes. Brièvement, des diapositives contenant des cellules sont immergées dans un tampon 95 ° C pour le citrate de 15 minutes, puis immédiatement placé dans l'eau distillée maintenue à température ambiante.
- Trempe de la peroxydase endogène est réalisé en incubant diapositives pendant 30 minutes dans une solution de trempe. En bref, ajoutez 47 ml d'éthanol à 95% à un tube conique de 50 ml, ajouter 11,2 ml de PBS pH 7,4 et 1,8 mL de peroxyde d'hydrogène à 3% pour un total de 60 ml.
La solution de trempe est faite juste avant l'utilisation. - Les cellules sont ensuite lavées 3x dans du PBS pH 7,4 pendant 5 minutes chacune à la température ambiante. Une solution de blocage (12,5 ml d'éthanol à 95%, 1,4 ml de sérum de chèvre normal, 140 mg d'albumine sérique bovine, et 2 gouttes de Tween 20) est prêt à empêcher la liaison non spécifique des anticorps. Placez-le sur la glace avant utilisation. (Cette solution de blocage peuvent être conservés à 4 ° C et jusqu'à 1 semaine).
- Blocage solution est ajoutée à l'échantillon sur la lame et est ensuite recouvert d'une bande de paraffine (pour éviter le dessèchement de l'échantillon) et placé en chambre humide et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
- L'anticorps primaire monoclonal ou polyclonal à l'antigène viral est préparé dans une solution de blocage à une dilution 1:50, mélangé avec une pipette et placés sur la glace jusqu'à ce que nécessaire. Cinquante à 100 ul de solution d'anticorps sera nécessaire par échantillon de tissu en fonction de la taille des échantillons et le nombre de diapositives.
- Immédiatement après l'incubation, la solution de blocage est secoué la diapositive et 50-100 ul de l'anticorps primaire est ajouté à l'échantillon de tissu qui est ensuite recouvert d'une bande de paraffine. Les échantillons sont incubés pendant 1-2 heures dans une chambre humidifiée à température ambiante.
- Diapositives contenant des spécimens sont ensuite laver 3x pendant 5 minutes chacun dans du PBS pH 7,4 à laquelle est ajoutée une chèvre biotinylé secondaires anticorps anti-souris à une dilution 1:100 dans du PBS pH 7,4, et incubé dans une chambre humidifiée à température ambiante pendant 30 - 45 minutes.
- Environ 30 minutes avant d'utiliser, la peroxydase conjugué streptavidine-en PBS pH 7,4 est préparé. Utilisation du kit DAKO Duet Cytomation, ajouter 50 ul de la solution A à 5 mL de PBS pH 7,4, vortex, puis ajouter 50 ul de solution B et mélanger à nouveau.
- Après l'incubation d'anticorps dans 6,10 étape terminée, les lames sont lavées 3x dans du PBS pH 7,4, puis les frais prepared peroxydase de raifort conjuguée-strepavidine solution est ajoutée et incubée à température ambiante pendant 30-45 minutes dans une chambre humidifiée.
- Après incubation, les lames sont lavées 3x dans du PBS pH 7,4 à température ambiante. Cinq minutes avant le lavage est terminé, le 3, la solution de substrat 3-diamino-benzidine (DAB, SIGMA) (20 mL de PBS pH 7,4, 25 ul de peroxyde d'hydrogène 3%, et 1 comprimé de DAB) est préparé. Après la tablette DAB est complètement dissous, la solution brunâtre est filtrée à travers un filtre de 0,45 microns de seringues. La solution DAB filtré est ensuite ajouté à des échantillons après le lavage final et le développement des couleurs pour KSHV LANA dans les cellules infectées est observée en temps réel sous un éclairage fond clair en utilisant un microscope Nikon Eclipse E200. Une fois le développement de la couleur désirée est atteinte, la réaction est arrêtée par incubation dans de l'eau distillée pendant 5 minutes.
- Pour deux étiquetés IHC, après incubation dans l'eau les diapositives contenant des spécimens sont mis via le protocole IHC pour une deuxième fois à partir de l'étape de récupération d'antigène (6,4). Toutefois, les modifications du protocole à l'étape de substrat de la peroxydase (6.11) dans ce lieu de la peroxydase de raifort conjuguée-streptavidine, une phosphatase alcaline conjugué streptavidine est employée
- L'étiquetage seconde est réalisée par une étape de récupération d'antigène supplémentaire dans le micro-ondes comme décrit ci-dessus plus une seconde immunomarquage avec un anticorps monoclonal contre la protéine cellulaire jugée déréglée (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Les cellules sont ensuite lavées, puis incubées avec une chèvre biotinylé anti-mouse/rabbit anticorps IgG (DAKO) à une dilution 1:100 suivie par une phosphatase alcaline conjugué streptavidine (Vector Labs, Burlingame, CA) à 1:500 dilution. Développement de la couleur est obtenue par incubation des cellules avec le rouge vecteur substrat en utilisant un vecteur rouge kit alcalines substrat phosphate (Vector Laboratories, Burlingame, CA) conformément aux instructions du fabricant. Contre-coloration, si désiré, peuvent être effectuées avec orecin ou hématoxyline. Échantillons de tissus sont ensuite montés en permanence avec les médias Permount montage avec un couvercle en verre. Les images sont prises sous un éclairage fond clair avec un Nikon TE-2000S microscope monté avec une caméra CCD.
7. Livraison de gènes par adénovirus Transduction de cellules DMVEC
- Cellules normales DMVEC sont cultivées dans les diapositives de chambre au plaquage de la densité de 2,5 X10 5 cellules par chambre EBM-2 média complet.
- Cellules sont cultivées à DMVEC confluence de 80% (en prenant 3-5 jours), après quoi 5 ul / fenêtre de diapositive chambre de EGFP adénovirus exprimant à un titre 1X 10 10 particules / mL.
- En direct avec des cultures cellulaires DMVEC adénovirus ajoutée ont été examinées pour la fluorescence EGFP 18 heures après l'ajout du virus.
- Phase individuelle et photographies fluorescents ont été prises à un grossissement total de 200X et fusionné sur un microscope Nikon 2000S TE fluorescentes montées avec une caméra CCD.
8. Les résultats représentatifs
Figure 1. Cellules primaires DMVEC de Lonza Société ont été maintenues dans l'EBM-2 médias et ont été infectés par le virus BCBL-1 à une moi de 0,01. Après monocouches de cellules infectées, DMVEC ont été examinées quotidiennement. Dix jours après l'infection se moquer des cellules infectées montrent un pavé-comme la morphologie et les cellules infectées présentaient une KSHV cellules fusiformes morphologie type caractéristique de la broche en forme de cellules endothéliales trouvés infectés par le KSHV dans le tissu tumoral KS. Les photographies ont été prises avec un microscope NIKON TE 2000S monté avec une caméra CCD à un grossissement total de 100X.
Figure 2. Double étiquetés coloration immunofluorescence indirecte a été réalisée sur des cellules infectées KSHV DMVEC moins 10 jours après l'infection. Les cellules infectées ont été colorées double avec un anticorps monoclonal de KSHV LANA et un anticorps polyclonal de chèvre à une protéine de la cellule hôte précis qui seraient modifiés après l'infection KSHV. Un mélange d'âne secondaire anti-souris et un âne anticorps anti-chèvre conjugué à la rhodamine et FITC ont été ajoutés. Les cellules ont été examinés avec un microscope à fluorescence Nikon TE2000S équipé d'une caméra CCD. Supports de montage avec DAPI a été utilisé pour visualiser les noyaux. Toutes les photographies ont été prises à un grossissement total de 200x. Cellules infectées exprimant la protéine du virus LANA (rhodamine teinté) localisée au noyau montrent une expression réduite de la protéine de la cellule hôte spécifique (FITC teinté) localisée au cytoplasme.
Figure 3. IHC dans le tissu tumoral KS pour Lana et PECAM-1 / CD31. Tissus tumoraux du sida KS a été souillé par simple et double étiquetés IHC pour KSHV LANA et PECAM-1 / CD31. A) montre tachés tissus KS avec un anticorps monoclonal à Lana et contre l'hématoxyline. LANA cellules positives sont identifiées par des flèches blanches. B). KS tissus colorés avec un anticorps monoclonal pour PECAMI/CD31 et coloration apparaît spécifique à endothéliales autour des vaisseaux représentés par des flèches blanches. C) montre tachés KS tissus double pour LANA (vecteur rouge) et CD31 (brun) représenté par des flèches noires pour une blanche LANA pour les cellules de coloration positive pour CD31. D) montre une faible grossissement d'une zone de la même lame dans les images du panneau Brightfield C ont été photographiés sur un microscope NIKON TE2000S à un grossissement total de 600x et 200x AC pour le panneau D.
Figure 4. Expression temporelle de KSHV LANA par qRT PCR 10 jours après l'infection par rapport aux cellules contrôles infectées maquette. Toutes les valeurs pour les cellules infectées DMVEC KSHV ont été normalisées pour la GAPDH. Il n'y avait aucune preuve de LANA d'amplification d'ADNc dans les cellules infectées maquette.
Figure 5. Microarrays KS tissu tumoral. L'tissu microarray (TMA) représente 0,6 millimètre carottes de tissu disposés sur une seule lame. Chaque noyau tissulaire représente un prélèvement tumoral KS d'un patient différent. TMA ont été rendus disponibles à travers les ressources du sida spécimen Cancer (ASCR) de Leona Ayers MD à l'Ohio State University. Paraffine tissu tumoral KS avec correspondance tissus témoins normaux et positifs ont été placées sur des lames de verre. Échantillons de tissus ont été prélevés KS bouche, la peau, le palais mou, la langue, et les masses du cou. Tous les patients étaient séropositifs.
Figure 6. Tissue microarrays ont été colorées pour KSHV LANA par immunohistochimie et ont été analysés par microscopie à fond clair. Développement de la couleur pour Lana a été réalisée avec DAB comme substrat peroxydase et les cellules LANA positifs ont été visualisées par un motif de coloration brune intense. Différentes quantités de charge virale et les régions à cellules fusiformes peuvent être observés. A) représente focale infection virale dans la région définie de la tumeur. B) représente une infection disséminée par une forte charge virale qui est à peu près en corrélation avec le nombre de cellules fusiformes présents. Carottes de tissu colorées ont été observées à 200x de grossissement.
Figure 7. Cellules cultivées en DMVEC EBM-2 supports complets à une densité de 2,5 X10 5 cellules par puits ont été transduites avec 5 pi de l'adénovirus à un titre de 1,0.10 10. Les cellules ont été examinées pour la fluorescence EGFP 18 heures après la transduction. Les deux phases et des images fluorescentes ont été prises sur un microscope Nikon TE 2000S à un grossissement total de 200X. La transfection de cellules primaires DMVEC s'est avérée être problématique conséquent, nous avons identifié des vecteurs viraux qui va nous permettre de livrer fibuline-2 et galetin-3 très efficacement dans DMVEC primaire. Nous avons constaté que un adénovirus exprimant l'EGFP peut transduire efficacement DMVEC primaire. Nous avons également constaté que le vecteur lentiviral nous avons obtenu de Lentigen Corporation a été tout aussi efficace pour la transduction des cellules primaires DMVEC (données non présentées).
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Discussion
Les méthodologies utilisées dans ce rapport peuvent être effectuées dans une variété de paramètres de laboratoire. Ils exigent un équipement spécial ou d'accès aux installations de base. Précautions appropriées doivent être prises lorsque vous faites des expériences impliquant des agents pathogènes viraux tels infectieuses KSHV qui peut nécessiter l'utilisation d'un niveau biosaftey 3 (BSL-3) des installations. Acquisitions de tissus doivent également être approuvée par les conseils appropriés d'examen institutionnel (IRB).
Ces méthodologies, ensemble, peuvent fournir une base pour identifier les gènes qui sont dans le dérèglement d'expression in vitro et fournir des méthodes définies pour la validation in vivo de modifier profils d'expression génique ainsi des stratégies de transfert de gènes dans les cellules endothéliales. Ces résultats pris ensemble peuvent aider à élucider les voies biochimiques qui sont touchés par l'infection KSHV et ensuite par des gènes spécifiques du virus. Une compréhension de comment les virus oncogènes comme KSHV interruption spécifique voies moléculaires pourraient donner un aperçu dans le développement de nouvelles thérapies.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions James EK Hildreth, Meharry Medical College, pour ses conseils et de l'examen de ce manuscrit. Nous remercions également Diana Marver pour l'édition du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le Centre Meharry Vanderbilt for AIDS Research (NIH P30 AI054999-05), le Centre de santé Disparités recherche sur le sida, NIH 5U54 RR019192-05, le Centre pour la recherche clinique Meharry, des subventions du NIH P20RR011792, et par le NIH subventions P01 CA113239. JAA a été partiellement financé par des subventions pilotes à partir du Centre Vanderbilt-Meharry recherche sur le sida (CFAR) et le Centre pour la recherche clinique Meharry (CRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| PBS pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | 19364 (FLUKA) | |
| EBM-2 media | Lonza Inc. | CC-3156 | + bullet kits supplement |
| DMVEC cells (HMVEC) | Lonza Inc. | CC2543 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SH30066.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Chamber slides | Nalge Nunc international | 154461 | |
| KSHV LANA Mab | Vector Laboratories | VP-H913 | 1:50 dilution/IFA |
| Galectin-3 goat pAb | R&D Systems | AF1154 | |
| Donkey-anti-goat FITC | Jackson ImmunoResearch | 705-095-1 | |
| Donkey-anti-goat Rho | Jackson ImmunoResearch | 705-295-003 | 1:100 dilution/IFA |
| Mounting media | Vector Laboratories | H 1500 | Vectashield with DAPI |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce, Thermo Scientific | 23235 | |
| Nitrocellulose | Bio-Rad | 161-0112 | |
| Donkey-anti-goat-conj. | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC 2020 | |
| Western substrate | Pierce, Thermo Scientific | 34075 | |
| Biotin-rabbit-anti goat | Dako | 305-065-045 | |
| AP-Strepavidin conj. | Dako | K 0492 (kit) | |
| RNase DNase Free Set | Qiagen | 79254 | |
| MJ Mini Cycler | Bio-Rad | PTC-1148C | |
| Bio-Photometer | Eppendorf | 952000006 | |
| RC 6 Plus Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 46910 | |
| Coulter Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 392052 | |
| MYiQ iCycler Real Time PCR Detection System | Bio-Rad | 170-9770 | |
| TE 2000S Fluorescent microscope | Nikon Instruments | TE2000S | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938C | |
| Eclipse E 200 | Nikon Instruments | E 200 | |
| Sorvall Legend RT Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75004377 |
References
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