Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Het identificeren van ontregelde genen geïnduceerd door Kaposi-sarcoom-geassocieerde herpesvirus (KSHV)

Published: September 14, 2010 doi: 10.3791/2078

Summary

Gastheercel factoren spelen een cruciale rol in het opzetten en onderhouden van Kaposi-sarcoom (KS). Schetsen we methoden om de gastheercel factoren veranderd bij KSHV-geïnfecteerde cellen te identificeren DMVEC, en in de KS tumorweefsel. Cellulaire genen veranderd door virus zal dienen als potentieel doelwit (s) voor nieuwe therapieën.

Abstract

Op dit moment KS is de meest overheersende hiv / aids gerelateerde maligniteit in Zuidelijk Afrika en vandaar de wereld. 1,2 wordt gekenmerkt als een angioproliferative tumor van de vasculaire endotheliale cellen en produceert zeldzame B-cel lymfoproliferatieve ziekten in de vorm van pleurale effusie lymfomen (PEL) en sommige vormen van de ziekte van multicentrische Castleman. 3-5 Slechts 1-5% van de cellen in de KS-laesies actief ondersteunen lytische replicatie van Kaposi-geassocieerde Kaposi's herpesvirus (KSHV), het etiologische agens geassocieerd met KS, en het is duidelijk dat de cellulaire factoren die moeten interactie met virale factoren in het proces van oncogenese en tumorprogressie. 6,7 identificeren van nieuwe host-factor determinanten die bijdragen tot KS pathologie is essentieel voor het ontwikkelen van prognostische markers voor tumorprogressie en metastase en voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de behandeling van KS . 8 De bijbehorende video beschrijft de methoden die we gebruiken om de gastheercel genexpressie-programma's gewijzigd dermale microvasculaire endotheelcellen (DMVEC) na KSHV infectie en in KS tumorweefsel te identificeren. negen eenmaal ontregelde genen zijn geïdentificeerd door middel van microarray analyse, veranderingen in eiwitexpressie zijn bevestigd door immunoblot en dubbele gelabeld immunofluorescentie. Veranderingen in de transcriptionele expressie van ontregelde genen worden bevestigd in vitro met behulp van kwantitatieve real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validatie van in vitro bevindingen met behulp van archiefmateriaal KS tumorweefsel wordt ook uitgevoerd door dubbele gelabeld immunochemie en weefsel microarrays. 8,10 Onze benadering van het identificeren van ontregelde genen in de KS tumorweefsel micro-omgeving zal de ontwikkeling van in vitro en vervolgens in vivo model voor ontdekking en de evaluatie van potentiële nieuwe therapeutische voor de behandeling van KS.

Protocol

1. KSVH Teelt en infectie van DMVEC

  1. De BCBL-1 cellijn, oorspronkelijk geïsoleerd uit een menselijk lichaam holte op basis van lymfoom, wordt gekweekt in volledige RPMI 1640 media (Gibco, Grand Island, NY). BCBL-1-cellen worden verwijderd uit vloeibare stikstof, vervoerd op droog ijs, en snel ontdooid gedurende 1 minuut bij 37 ° C. Een 50 pi aliquot van BCBL-1-cellen bij een dichtheid 1x10 4 cellen / ml wordt toegevoegd aan 500 ml RPMI 1640 media aangevuld met 10% foetaal kalf serum, 1x penicilline / streptomycine en verdeeld in 175 cm kolven, op 50 ml / fles .
  2. De kolven van BCBL-1-cellen worden vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO 2 totdat de cel dichtheid bereikt 3x106 cellen / ml. Lytische cyclus virus replicatie wordt veroorzaakt door het toevoegen van TPA op 20ng / ml en natriumbutyraat bij 0,3 ng / mL.
  3. Vierentwintig uur na inductie-cellen worden tweemaal gewassen in PBS pH 7,4 in een volume van 40 ml door centrifugeren bij 1500 rpm in een Sorvall Legend RT centrifuge (tot butyraat verwijderen), en inductie wordt voortgezet met TPA bij 20 ng / mL in RPMI 1640 nog 5 dagen.
  4. Celvrij virus is geïsoleerd en geconcentreerd door differentiële centrifugatie. In het kort, cellen en celresten worden eerst gepelleteerd bij 10.000 tpm in een Sorvall RC-6 Plus centrifuge bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Supernatant met het virus is verwijderd en celvrij virus gepelleteerd in een Beekman Coulter Optima L-90K ultracentrifuge bij 4 ° C gedurende 1 uur bij 25.000 rpm.
  5. Het virus-vrij supernatant wordt verwijderd en de pellet geresuspendeerd virale in de vrieskou media (10% dimethylsulfoxide en 90% foetaal kalf serum) en opgeslagen bij -80 ° C totdat het nodig is.

    KSHV infectie van primaire DMVEC cellen.
  6. DMVEC cellen op niveau 2-5 passage worden uitgeplaat bij een initiële dichtheid van 1 X 10 5 in 100x20mm weefselkweek gerechten of kamer dia's, en worden onderhouden in volledige EMB-2-media (Lonza, Basel, Zwitserland) bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO 2. Bij 80% confluentie, zijn DMVEC geïnfecteerd met een moi van 0,01; mock geïnfecteerd (alleen media) cellen worden gebruikt als controles. Vers medium wordt toegevoegd aan cellen om de 2 dagen.
  7. DMVEC celmonolagen en kamer dia's worden dagelijks onderzocht op tekenen van infectie zoals opgemerkt door spindel celvorming. Na het eerste teken van de spil celvorming (7-14 dagen) te stoppen met media veranderingen. Kan echter langere incubatietijd van meer dan 15-21 dagen, zonder dat nieuwe media de integriteit van DMVEC cellen resulteert in cellen sterven of op te heffen uit de cultuur schotel.
  8. Op het punt van maximale spindling tijdens infectie, zijn celmonolagen geoogst voor de voorbereiding van de cel pellets voor eiwit of RNA-extractie. Geïnfecteerde cellen op DMVEC kamer dia's worden tweemaal gewassen met 1 ml / venster met voorverwarmd PBS pH 7,4. Cellen op kamer dia's worden geoogst na het wassen 2X met PBS pH 7,4. Konden ze volledig drogen voordat u het verwijderen van de kamers en het plaatsen van de dia's in 100% methanol gehouden op -20 ° C totdat ze nodig zijn voor de immunofluorescentie kleuring (IFA).

2. Totaal RNA-isolatie en de productie van cDNA van Mock en KSHV Infected DMVEC

  1. Totaal RNA wordt gewonnen uit KSHV-geïnfecteerde DMVEC en mock geïnfecteerde cellen met behulp van een Qiagen RNesay Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Protocol van de fabrikant voor de verwerking van dierlijk weefsel wordt gebruikt, maar zonder de homogenisering stappen, als gekweekte cellen de bron gebruikt voor RNA isolatie.
  2. Selecteer de optie aangeboden om de RNA met DNAseI te behandelen op de kolom met behulp van de Qiagen RNA vrij DNAse Kit, volgens de aanbevelingen van de fabrikant zich in de bijlage van de gebruiksaanwijzing. DNAaseI degradeert een vervuilende genoom of virale DNA van de RNA-bereiding. De DNAseI behandeling is van cruciaal belang voor stroomafwaarts toepassingen, waaronder RT-PCR, qRT-PCR en microarray analyses.
  3. Het RNA wordt gewassen volgens de instructies en de eventuele resterende ethanol in de wasbuffer wordt verwijderd door centrifugeren van de kolom nog een keer dan gesuggereerd door de fabrikant. Resterende ethanol compromissen de zuiverheid van het RNA na elutie.
  4. Na de laatste wasbeurt een extra centrifugatie stap wordt uitgevoerd vóór de RNA kan worden geëlueerd van de kolom. Het RNA wordt geëlueerd uit de kolom met 30 pi van het RNAse vrij water. Het RNA wordt vervolgens gekwantificeerd en geanalyseerd op zuiverheid op een Eppendorf AG-6131 Bio-fotometer. De optische dichtheid ratio (260/280 nm) moet between1.8-2.0 die typisch is voor RNA van hoge zuiverheid.
  5. Voor de microarray analyse, is het RNA geanalyseerd op een Agilent 2100 Bioanalyzer het gebruik van de RIN software algoritme. De analyse van de bioanalyzer biedt u een RNA Integrity Number (RIN) van 1-10, hebben echter RIN nummers 7-10 bewezen consistente en meer betrouwbare resultaten voor microarray-of qRT-PCR-analyses leveren. Het gemiddelde RIN nummer voor RNA isolaTed met de Qiagen RNAeasy kit in onze handen varieert 7,5-9.
  6. Kwantificatie van RNA wordt bereikt door het toevoegen van een pi van het geëlueerde RNA uit de kolom tot 99 ul van 10 mM Tris-EDTA pH 7,6. Het RNA en buffer wordt gemengd met een pipet en toegevoegd aan een schone cuvet voor spectrofotometrische analyse met een Eppendorf Bio-fotometer.
  7. Boodschapper-RNA in een microgram van elk monster wordt gevuld met behulp van willekeurige hexameren verstrekt door de fabrikant, voorafgaand aan de transcriptie te keren met een hoge capaciteit cDNA reverse transcriptie kit (Applied Biosystems, Foster City, CA.).


    cDNA-synthese

  8. Te synthetiseren enkelstrengs cDNA van totaal RNA gebruiken we een High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit van Applied Biosystems en ga verder volgens de instructies van de fabrikant.
  9. Een 2x meester mix van reagentia wordt gemaakt en 0,5 tot 1 ug van RNA in een volume van 10 ui wordt toegevoegd aan 10 pi van de 2x meester reagens mix. De resulterende 1x oplossing is voorzichtig gemengd en reverse transcriptie is uitgevoerd in een Biorad MJ Mini-thermaalmeer cycler volgens de instructies van de fabrikant.
  10. Tot twee microgram totaal RNA kan worden gebruikt per 20 pi reactie. Het cDNA is gekwantificeerd bij 260 nm in een Eppendorf AG-6131 Bio-Fotometer, en opgeslagen bij -80 ° C totdat ze nodig zijn voor de qRT-PCR.

3. Microarray Vergelijkende analyse van Mock en KSHV Infected DMVEC Cellen

Ons laboratorium verricht microarray analyse aan de Vanderbilt University Medical Center Microarray Shared Resource Core Facility op een fee-for-service basis. Vergelijken we output bestanden voor transcriptionele ontregeling van genen in KSHV geïnfecteerde DMVEC cellen geïnfecteerde controle cellen bespotten. Transcriptionele ontregelde genen in KSHV geïnfecteerde cellen die relevant zijn voor angiogenese, cel-proliferatie of dat gemetastaseerde biomarkers vertegenwoordigen worden gevalideerd in vitro gebruik van KSHV geïnfecteerde DMVEC cellen met behulp van real-time PCR, western blots en dual IFA; resultaten worden vergeleken met de bevindingen in het archief KS tumor weefsel.

4. Kwantitatieve RT-PCR Transcriptionele Analyse ontregelde genen gevonden in Mock-en KSHV-geïnfecteerde DMVEC

  1. Real Time PCR is uitgevoerd in 96 goed optische platen (Sorenson Bioscience, Inc) met behulp van reverse transcriptase gegenereerd cDNA afkomstig van een gezuiverde RNA monster en het gebruik van een MyiQ Een kleur Real Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) en 25 pi reactie volumes. Deze procedure wordt gedaan in een biologisch veiligheidskabinet om mogelijke besmetting te voorkomen door vreemd DNA / cDNA die aanwezig kunnen zijn in de kamer.
  2. Een meester mix is ​​bereid in 1,5 ml buizen voor elke primer set (volgens de instructies van de fabrikant) met behulp van SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) en naar voren geselecteerd en reverse primers voor elk gen van belang, bij een concentratie van 250 nM per goed, made ​​in RNAase DNAase gratis H 2 O. Elk monster moet worden gedaan in drievoud.
  3. Primer sequenties voor qRT-PCR voor de gastheercel genen bevatten primer sequenties voor KSHV LANA, dat is het virus latency bijbehorende nucleaire antigen dat sterk wordt uitgedrukt in KSHV geïnfecteerde cellen en DMVEC KS tumoren.
  4. De 10 ng / ul voorraad cDNAs van mock geïnfecteerde en geïnfecteerde KSHV DMVEC cellen worden verdund 1:03 met RNAase DNAase gratis H 2 O, 3μL van deze verdunning wordt toegevoegd aan elke well. Controle putten vervangen door water voor cDNA.
  5. De 96 wells plaat wordt afgesloten met optische afdichtband (Bio-Rad Laboratories), voorzichtig gemengd en gecentrifugeerd gedurende 2 minuten bij 1000 rpm, kamertemperatuur, aan het reactiemengsel te verzamelen op de bodem van de putten. De Bio-Rad MyiQ Detection System en de lamp is ingeschakeld op dit moment om voor een 10 minuten warm-up periode kunnen vóór het begin van de run.
  6. De gecentrifugeerd 96 wells plaat wordt daarna in een Bio-Rad M iQ Een kleur Real Time PCR Detection System, het programma van de cyclus sequenties ingevoerd en opgeslagen, en de run gestart.
  7. Het fietsen volgorde is als volgt: 95 ° C gedurende 3 minuten, 95 ° C gedurende 15 seconden, 60 ° C gedurende 1 minuut, 95 ° C gedurende 1 minuut, 55 ° C gedurende 1 minuut en 55 ° C gedurende 30 seconden 81 cycli totaal. Een smelt curve is opgenomen in dit programma als een cheque van primer efficiency. Een GAPDH primer set is versterkt, en inbegrepen voor normalisatie.
  8. Data-analyse is gedaan met de Bio-Rad iQ5 Optical System Software versie 2.

5. Dual Labeled Immunofluorescentie Analyse van KSHV geïnfecteerde cellen DMVEC

  1. Kamer dia's (verwijderd van de kamers) met zowel de samenvloeiing besmet en niet-geïnfecteerde DMVEC worden twee maal gewassen met PBS pH 7,4, de lucht gedroogd en gefixeerd in -20 ° C pre-gekoelde absolute methanol gedurende 10 minuten en hield bij -20 ° C.
  2. Dia's met cellen zijn then de lucht gedroogd gedurende 15 minuten, en geplaatst in een Coplin pot op het ijs met Tris zoutoplossing (0,05 M Tris pH 7,4) gedurende 5 minuten. Cellen worden vervolgens geïncubeerd gedurende 1 uur bij 37 ° C in een bevochtigde kamer met een mengsel van monoklonale antilichamen tegen KSHV LANA op een 1:50 verdunning in PBS pH 7,4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) plus een geit polyklonaal antilichaam (1: 100 verdunning in PBS pH 7,4) ten opzichte van de gastheer-eiwit gevonden dat dyregulated door middel van microarray met behulp van KSHV geïnfecteerde DMVEC cellen.
  3. De cellen worden vervolgens gewassen 3x met Tris zoutoplossing (nooit toestaan ​​dat de cellen drogen uit) en vervolgens geïncubeerd gedurende 30 minuten met een mengsel van een ezel secundaire anti-muis IgG antilichaam geconjugeerd met rhodamine rood-X en de ezel anti-geit antilichaam geconjugeerd aan FITC (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), zowel op een 1:100 verdunning in PBS.
  4. De cellen worden later gewassen 3x in Tris zout in een potje Coplin en terwijl de dia's zijn nog steeds vochtig, de dia's zijn gemonteerd met Vectashield montage media (Vector Laboratories, Burlingame, CA) met 1,5 g / ml DAPI en een dekglaasje aan.
  5. Fluorescentie wordt waargenomen en beelden gefotografeerd met een Nikon TE 2000S fluorescentiemicroscoop gemonteerd met een charge-coupled device (CCD) camera. Foto's zijn genomen met een 20x doelstelling voor een totale vergroting van 200x.
  6. Aparte foto's op dezelfde vergroting gebruikt voor DAPI (200x), worden genomen usinge UV-verlichting, met een groen filter voor rhodamine en een blauw filter voor FITC. De beelden worden later samengevoegd met behulp van freeware software van Nikon.

6. Dual Labeled immunohistochemie op Ks Tissue en Ks Weefsel Microarrays voor KSHV Lana en de endotheelcellen Marker Pecam-1/cd31

  1. Dual gelabeld immunohistochemie is uitgevoerd met de DAKO strepavidin ABC duet vlekken kit voor KSHV LANA en die gastheercel eiwitten gevonden veranderde na een virusinfectie. IHC is uitgevoerd op archief AIDS-KS weefsel in formaline gefixeerde en in paraffine ingebed.
  2. Vijf micron secties worden gesneden met een microtoom en op chemate dia's voorafgaand aan de immunokleuring.
  3. Paraffine ingebedde dia's zijn deparaffinzed in xyleen gedurende 10 minuten onder een zuurkast, en vervolgens cellen gehydrateerd in een ethanolreeks serie van 100%, 95% en 70% gedurende vijf minuten elk. Dia's worden dan geplaatst in het water gedurende 10 minuten voorafgaand aan de antigeen ontmaskeren (ook bekend als antigen retrieval).
  4. Voor immunokleuring, is antigeen ontmaskering uitgevoerd in een magnetron in 50 mM citraat pH 6,0 buffer bij 95 ° C gedurende 15 minuten. In het kort, dia's bevattende cellen worden ondergedompeld in de 95 ° C citraatbuffer gedurende 15 minuten, dan onmiddellijk in gedistilleerd water gehouden op kamertemperatuur.
  5. Afschrikken van endogene peroxidase wordt uitgevoerd door het incuberen van dia's gedurende 30 minuten in een doven-oplossing. In het kort, voeg 47 ml 95% ethanol om een ​​50 ml conische buis, voeg 11,2 ml PBS pH 7,4 en 1,8 ml 3% waterstofperoxide voor een totaal van 60 ml.
    De quenching oplossing is vlak voor gemaakt om te gebruiken.
  6. De cellen worden vervolgens gewassen 3x in PBS pH 7,4 gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Een blokkerende oplossing (12,5 ml 95% ethanol, 1,4 ml normaal geit serum, 140 mg bovine serum albumine, en 2 druppels Tween 20) is bereid om niet-specifieke binding van antistoffen te voorkomen. Plaats op het ijs voor gebruik. (Deze blokkering oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C en maximaal 1 week).
  7. Het blokkeren van oplossing wordt toegevoegd aan het monster op de dia en wordt vervolgens bedekt met een strook van paraffine (om uitdrogen te voorkomen van het monster) en in bevochtigde kamer en geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  8. De primaire monoklonaal of polyklonaal antilichaam tegen het virale antigeen wordt bereid in het blokkeren van oplossing bij een 1:50 verdunning, vermengd met een pipet en geplaatst op ijs totdat het nodig is. Vijftig tot 100 ul van antistof-oplossing nodig zal zijn per weefselmonster, afhankelijk van de grootte van de monsters en het aantal dia's.
  9. Onmiddellijk na incubatie de blockingbuffer is afgeschud de glijbaan en 50-100 pi van het primaire antilichaam wordt toegevoegd aan het weefsel monster, die vervolgens wordt bedekt met een strook van paraffine. Exemplaren zijn geïncubeerd gedurende 1-2 uur in een vochtige kamer bij kamertemperatuur.
  10. Dia's met monsters worden vervolgens 3x wassen gedurende 5 minuten in PBS pH 7,4 waarbij een secundaire gebiotinyleerd geit anti-muis antilichaam toegevoegd in een 1:100 verdunning in PBS pH 7,4, en geïncubeerd in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur gedurende 30 - 45 minuten.
  11. Ongeveer 30 minuten voor gebruik, is de peroxidase geconjugeerd-strepavidin in PBS pH 7,4 voorbereid. Met behulp van de DAKO Cytomation Duet Kit, voeg 50 ul van oplossing A en 5 ml PBS pH 7,4, vortex, en voeg 50 ul van oplossing B en meng opnieuw.
  12. Na het antilichaam incubatie in stap 6,10 in volledige, worden de dia's gewassen 3x in PBS pH 7,4 en vervolgens het vers prepared mierikswortel peroxidase geconjugeerd-strepavidin oplossing wordt toegevoegd en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 30-45 minuten in een vochtige kamer.
  13. Na de incubatie zijn dia's gewassen 3x in PBS pH 7,4 bij kamertemperatuur. Vijf minuten voor het wassen is voltooid, de 3, 3-diamino-benzidine (DAB, SIGMA) substraat oplossing (20 mL van PBS pH 7,4, 25 pi van 3% waterstofperoxide, en een DAB tablet) wordt voorbereid. Nadat de DAB tablet volledig is opgelost, is de bruin gekleurde oplossing gefiltreerd door een 0,45 micron spuitfilter. De gefilterde DAB-oplossing wordt vervolgens toegevoegd aan de monsters na de laatste wasbeurt en de kleur ontwikkeling voor KSHV LANA in geïnfecteerde cellen wordt waargenomen in real-time onder helderveld verlichting met een Nikon Eclipse E200 microscoop. Nadat de gewenste kleur ontwikkeling is bereikt, wordt de reactie afgekoeld door incubatie in gedestilleerd water gedurende 5 minuten.
  14. Voor dubbele label IHC, na incubatie in het water de dia's met daarin exemplaren zijn gebracht door middel van de IHC-protocol voor de tweede keer vanaf de antigen retrieval stap (6,4). Maar het protocol veranderingen op de peroxidase substraat stap (6.11) in dat in plaats van de mierikswortel peroxidase geconjugeerde-strepavidin, een alkalische fosfatase conjugaat strepavidin werkzaam is
  15. De tweede etikettering wordt bereikt door een extra antigen retrieval stap in de magnetron zoals hierboven beschreven, plus een tweede immunokleuring met een monoklonaal antilichaam tegen de cellulaire eiwitten blijken te zijn ontregelde (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Cellen worden vervolgens gewassen, en vervolgens geïncubeerd met een gebiotinyleerd geit anti-mouse/rabbit IgG antilichaam (DAKO) bij een 1:100 verdunning, gevolgd door een alkalische fosfatase-conjugaat strepavidin (Vector Labs, Burlingame, CA) bij 1:500 verdunning. Kleurontwikkeling wordt bereikt door het incuberen van cellen met de ondergrond vector rode met behulp van een Vector Red alkaline fosfaat substraat kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) volgens de instructies van de fabrikant. Counter kleuring, indien gewenst, kan worden uitgevoerd met orecin of hematoxyline. Weefselmonsters worden vervolgens vast gemonteerd met Permount montage media met een afdekglas. Beelden zijn genomen in het kader helderveld verlichting met een Nikon TE-2000S microscoop gemonteerd met een CCD-camera.

7. Gene Levering door Adenovirus transductie van cellen DMVEC

  1. Normale DMVEC cellen worden gekweekt in de kamer van dia's op beplating van de dichtheid van 2,5 X10 5 cellen per kamer EBM-2 complete media.
  2. DMVEC cellen zijn gegroeid tot 80% confluentie (het nemen van 3-5 dagen), waarna 5 ul / kamer schuif raam van adenovirus uiten EGFP bij een titer 1x 10 10 deeltjes / mL.
  3. Wonen DMVEC celculturen met Adenovirus toegevoegd werden onderzocht op EGFP fluorescentie 18 uur na het toevoegen van het virus.
  4. Afzonderlijke fase en fluorescerende foto's werden genomen op een totale vergroting van 200X en samengevoegd op een NIKON TE 2000S fluorescentiemicroscoop gemonteerd met een CCD-camera.

8. Representatieve resultaten

Figuur 1
Figuur 1. Primaire DMVEC cellen van Lonza Corporation werden gehandhaafd in EBM-2-media en werden geïnfecteerd met BCBL-1 virus op een moi van 0,01. Na infectie DMVEC celmonolagen werden dagelijks onderzocht. Tien dagen na de infectie mock geïnfecteerde cellen vertonen een kasseien-achtige morfologie en KSHV geïnfecteerde cellen vertoonden een spindel celtype morfologie kenmerk van as gevormde endotheelcellen aangetroffen die besmet zijn met KSHV in KS tumorweefsel. Foto's werden gemaakt met een NIKON TE 2000S microscoop gemonteerd met een CCD-camera op een totale vergroting van 100X.

Figuur 2
Figuur 2. Dual label indirecte immunofluorescentie kleuring werd uitgevoerd op KSHV geïnfecteerde cellen DMVEC op 10 dagen na infectie. Geïnfecteerde cellen werden dual gekleurd met een monoklonaal antilichaam tegen KSHV LANA en een geit polyklonaal antilichaam aan een specifieke gastheercel eiwit blijkt te zijn gewijzigd na KSHV infectie. Een mengsel van secundaire ezel anti-muis en ezel anti-geit-antilichamen geconjugeerd met rhodamine en FITC werden toegevoegd. Cellen werden onderzocht met een Nikon TE2000S fluorescentiemicroscoop uitgerust met een CCD-camera. Montage media met DAPI werd gebruikt om de kernen te visualiseren. Alle foto's werden genomen op een totale vergroting van 200x. Geïnfecteerde cel die het virus LANA eiwit (rhodamine gekleurde) gelokaliseerd in kern een verminderde expressie van de gastheercel specifiek eiwit (FITC gekleurde) gelokaliseerd cytoplasma.

Figuur 3
Figuur 3. IHC in KS tumorweefsel voor Lana en PECAM-1 / CD31. AIDS KS tumorweefsel werd gekleurd door enkele en dubbele gelabeld IHC voor KSHV LANA en PECAM-1 / CD31. A) Toont KS weefsel gekleurd met een monoklonaal antilichaam tegen LANA en met hematoxyline. LANA positieve cellen worden geïdentificeerd door witte pijlen. B). KS weefsel gekleurd met een monoklonaal antilichaam tegen PECAMI/CD31 en vlekken lijkt specifiek voor endotheliale rond schepen afgebeeld door witte pijlen. C) Geeft KS weefsel dual gekleurd voor LANA (vector rood) en CD31 (bruin) weergegeven door de zwarte pijlen voor LANA een witte voor de cellen kleuren positief voor CD31. D) Toont een lagere vergroting van een gebied van dezelfde dia in panel C. Helderveld beelden werden gefotografeerd op een NIKON TE2000S microscoop totale vergroting van 600x AC en 200x voor Panel D.

Figuur 4
Figuur 4. Tijdelijke uitdrukking van KSHV LANA door qRT-PCR 10 dagen na infectie in vergelijking met geïnfecteerde controle cellen bespotten. Alle waarden voor KSHV geïnfecteerde DMVEC cellen werden genormaliseerd tot GAPDH. Er was geen bewijs van LANA cDNA versterking in mock geïnfecteerde cellen.

Figuur 5
Figuur 5. KS tumor weefsel microarrays. Het weefsel microarray (TMA) vertegenwoordigt 0,6 millimeter weefsel cores gekleed op een enkele dia. Elk weefsel kern vertegenwoordigt een KS tumor exemplaar van een andere patiënt. TMA werden ter beschikking gesteld via de AIDS Kanker Specimen Resource (ASCR) van Leona Ayers MD aan de Ohio State University. Paraffine ingebedde KS tumorweefsel samen met matchende normale en positieve controle weefsels werden geplaatst op glasplaatjes. KS weefselmonsters werden genomen uit de mond, huid, zachte gehemelte, tong en nek massa's. Alle patiënten waren HIV-positief.

Figuur 6
Figuur 6. Weefsel microarrays werden gekleurd voor KSHV LANA door immunohistochemie en werden geanalyseerd door helderveld microscopie. Color ontwikkeling voor LANA werd uitgevoerd met DAB als een peroxidase substraat en Lana positieve cellen werden gevisualiseerd door een intense bruine vlekken patroon. Verschillende hoeveelheden van virale belasting en spindel cel regio's kunnen worden waargenomen. A) staat centraal virale infectie in bepaalde regio van de tumor. B) vertegenwoordigt gedissemineerde infectie met een hoge virale last, die ruwweg is gecorreleerd met het aantal van de spil-cellen aanwezig zijn. Stained weefsel kernen werden waargenomen bij 200x vergroting.

Figuur 7
Figuur 7. DMVEC cellen gekweekt in EBM-2 complete media bij een dichtheid van 2,5 X10 5 cellen per well werden getransduceerd met 5 pi van Adenovirus bij een titer van 1.0X10 10. Cellen werden onderzocht op EGFP fluorescentie 18 uur na transductie. Zowel de fase en fluorescerende beelden werden genomen op een Nikon TE 2000S microscoop op een totale vergroting van 200X. Transfectie van primaire DMVEC cellen heeft zich bewezen als problematisch daarom hebben we geïdentificeerd virale vectoren die zal ons toelaten om fibulin-2 en galetin-3 leveren zeer efficiënt in het primair DMVEC. Wij vonden dat een adenovirus uiten van EGFP efficiënt kan primaire DMVEC transduceren. We vonden ook dat de lentivirale vector wij van Lentigen Corporation was even efficiënt voor transducing primaire DMVEC cellen (gegevens niet getoond).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De methodieken die in dit rapport kan worden uitgevoerd in een verscheidenheid van laboratorium-instellingen. Ze vereisen een speciale uitrusting of toegang tot de belangrijkste voorzieningen. De juiste voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het doen van experimenten met besmettelijke virale ziekteverwekkers zoals KSHV die het gebruik van een biosaftey niveau 3 (BSL-3) voorzieningen nodig hebben. Tissue acquisities moet ook worden goedgekeurd door de bevoegde institutionele herziening boards (IRB's).

Deze methodieken samen kunnen zorgen voor een basis voor het identificeren van genen die zijn ontregelde in expressie in vitro en bieden gedefinieerde methoden voor in vivo validatie van veranderde genexpressie profielen en strategieën voor het gen-levering in endotheelcellen. Deze bevindingen samen kan helpen om biochemische routes die worden beïnvloed door KSHV infectie en vervolgens door specifieke virale genen toe te lichten. Een inzicht in hoe oncogene virussen, zoals KSHV onderbreken specifieke moleculaire pathways kunnen bieden inzicht in de ontwikkeling van nieuwe therapeutica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Wij danken James EK Hildreth, Meharry Medical College, voor zijn advies en toetsing van dit manuscript. We danken ook Diana Marver voor het bewerken van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Meharry Vanderbilt Center for AIDS Research (NIH subsidie ​​P30 AI054999-05), het Centrum voor aids-Health Research verschillen, NIH subsidie ​​5U54 RR019192-05, de Meharry Centrum voor Klinisch Onderzoek, NIH Grant P20RR011792, en door de NIH subsidie ​​P01 CA113239. DJA werd gedeeltelijk gefinancierd door subsidies van de piloot Vanderbilt-Meharry Center for AIDS Research (CFAR) en de Meharry Center for Clinical Research (CRC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Invitrogen 05-0001DJ
TPA Sigma-Aldrich P1585
PBS pH 7.4 Invitrogen 10010-023
Sodium butyrate Sigma-Aldrich 19364 (FLUKA)
EBM-2 media Lonza Inc. CC-3156 + bullet kits supplement
DMVEC cells (HMVEC) Lonza Inc. CC2543
Fetal calf serum Hyclone SH30066.03
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140-122
Chamber slides Nalge Nunc international 154461
KSHV LANA Mab Vector Laboratories VP-H913 1:50 dilution/IFA
Galectin-3 goat pAb R&D Systems AF1154
Donkey-anti-goat FITC Jackson ImmunoResearch 705-095-1
Donkey-anti-goat Rho Jackson ImmunoResearch 705-295-003 1:100 dilution/IFA
Mounting media Vector Laboratories H 1500 Vectashield with DAPI
BCA Protein Assay Kit Pierce, Thermo Scientific 23235
Nitrocellulose Bio-Rad 161-0112
Donkey-anti-goat-conj. Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC 2020
Western substrate Pierce, Thermo Scientific 34075
Biotin-rabbit-anti goat Dako 305-065-045
AP-Strepavidin conj. Dako K 0492 (kit)
RNase DNase Free Set Qiagen 79254
MJ Mini Cycler Bio-Rad PTC-1148C
Bio-Photometer Eppendorf 952000006
RC 6 Plus Centrifuge Sorvall, Thermo Scientific 46910
Coulter Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter Inc. 392052
MYiQ iCycler Real Time PCR Detection System Bio-Rad 170-9770
TE 2000S Fluorescent microscope Nikon Instruments TE2000S
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938C
Eclipse E 200 Nikon Instruments E 200
Sorvall Legend RT Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Inc. 75004377

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sitas, F., Newton, R. Kaposi's sarcoma in South Africa. J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).
  2. Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. Field's Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).
  3. Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles, D. M., Moore, P. S. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
  4. Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P., Said, J. W., Knowles, D. M., M, D. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N Engl J Med. 18, 1186-1191 (1995).
  5. Cesarman, E., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: a lymphotropic human herpesvirus associated with Kaposi's sarcoma, primary effusion lymphoma, and multicentric Castleman's disease. Semin Diagn Pathol. 14, 54-66 (1997).
  6. Chiou, C. J., Poole, L. J., Kim, P. S., Ciufo, D. M., Cannon, J. S., ap Rhys, C. M., Alcendor, D. J., Zong, J. C., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J Virol. 76, 3421-3439 (2002).
  7. Staskus, K. A., Zhong, W., Gebhard, K., Herndier, B., Wang, H., Renne, R., Beneke, J., Pudney, J., Anderson, D. J., Ganem, D., Haase, A. T., T, A. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus gene expression in endothelial (spindle) tumor cells. J Virol. 71, 715-719 (1997).
  8. Alcendor, D. J., Zhu, W. Q., Desai, P., Vigil, H. E., Hayward, G. S. KSHV downregulation of galectin-3 in kaposi's sarcoma. Glycobiology. , (2009).
  9. Ciufo, D. M., Cannon, J. S., Poole, L. J., Wu, F. Y., Murray, P., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Spindle cell conversion by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: formation of colonies and plaques with mixed lytic and latent gene expression in infected primary dermal microvascular endothelial cell cultures. J Virol. 75, 5614-5626 (2001).
  10. Long, E., Ilie, M., Hofman, V., Havet, K., Selva, E., Butori, C., Lacour, J. P., Nelson, A. M., Cathomas, G., Hofman, P. LANA-1, Bcl-2, Mcl-1 and HIF-1alpha protein expression in HIV-associated Kaposi sarcoma. Virchows Arch. 2, 159-170 (2009).

Tags

Immunologie virologie Kaposi-sarcoom microarrays infectie microscopie
Het identificeren van ontregelde genen geïnduceerd door Kaposi-sarcoom-geassocieerde herpesvirus (KSHV)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alcendor, D., Knobel, S. Identifying More

Alcendor, D., Knobel, S. Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV). J. Vis. Exp. (43), e2078, doi:10.3791/2078 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter