Summary
Fattori cellula ospite giocano un ruolo critico nella creazione e mantenimento di sarcoma di Kaposi (KS). Delineiamo metodi per identificare i fattori cellula ospite alterato nelle cellule DMVEC KSHV-infetti, e nel tessuto tumorale KS. Geni cellulari alterato da virus servirà come potenziale bersaglio (s) per nuove terapie.
Abstract
Attualmente KS è la più predominante l'HIV / AIDS neoplasie correlate in Sud Africa e quindi il mondo. 1,2 Si caratterizza come un tumore angioproliferative delle cellule dell'endotelio vascolare e produce rare malattie linfoproliferative delle cellule B nella forma di linfomi versamento pleurico (PEL) e alcune forme di malattia multicentrica di Castleman. 3-5 solo 1-5% delle cellule KS lesioni sostenere attivamente la replicazione litica di associato al sarcoma di Kaposi herpesvirus (KSHV), l'agente eziologico associato con KS, ed è chiaro che fattori cellulari devono interagiscono con fattori virali nel processo di oncogenesi e progressione del tumore. 6,7 Identificare romanzo host-fattore determinanti che contribuiscono a KS patologia è essenziale per lo sviluppo di marcatori prognostici per la progressione del tumore e delle metastasi, nonché per lo sviluppo di nuove terapie per il trattamento del KS . 8 La dettagli del video che accompagna i metodi che utilizziamo per identificare i programmi della cellula ospite espressione genica nel derma cellule endoteliali microvascolari (DMVEC) dopo l'infezione KSHV e nel tessuto tumorale KS 9. Una volta che i geni disregolazione sono identificati con l'analisi microarray, i cambiamenti nell'espressione delle proteine sono confermata da immunoblot e doppia immunofluorescenza etichettati. Cambiamenti nell'espressione della trascrizione dei geni disregolazione sono confermati in vitro con quantitativi in tempo reale reazione a catena della polimerasi (QRT-PCR). Validazione dei risultati in vitro utilizzando archivio tessuto tumorale KS è eseguita da due immunochimica etichettati e microarray di tessuto. 8,10 Il nostro approccio per individuare i geni disregolazione nel microambiente tessuto tumorale KS permetterà lo sviluppo in vitro e successivamente in sistemi modello in vivo per la scoperta e la valutazione delle potenzialità terapeutiche nuove per il trattamento del KS.
Protocol
1. KSVH Coltivazione e infezione di DMVEC
- La linea BCBL-1 delle cellule, originariamente isolato da un linfoma umano cavità del corpo a base, è colto in completo RPMI 1640 media (Gibco, Grand Island, NY). BCBL-1 le cellule vengono rimosse da azoto liquido, trasportati in ghiaccio secco, e presto scongelati per 1 minuto a 37 ° C. A 50 ml di aliquota BCBL-1 le cellule ad una densità di 1x10 4 cellule / ml è aggiunto a 500 ml di RPMI 1640 mezzi di comunicazione integrata con 10% siero di vitello fetale, 1x penicillina / streptomicina e distribuito in 175 fiaschi cm, a 50 mL / beuta .
- I palloni di BCBL-1 le cellule vengono poi incubate a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO 2 fino a quando la densità cellulare ha raggiunto 3x106 cellule / ml. Litica replicazione del virus ciclo è indotta con l'aggiunta di TPA a butirrato 20ng / mL e di sodio a 0,3 ng / mL.
- Ventiquattro ore dopo l'induzione delle cellule vengono lavate due volte in PBS pH7.4 in un volume di 40 mL per centrifugazione a 1500 rpm in una centrifuga Sorvall leggenda RT (per rimuovere butirrato), e induzione è proseguita con TPA a 20 ng / ml nel RPMI 1640 per 5 giorni in più.
- Virus Free Cell è isolato e concentrato per centrifugazione differenziale. In breve, cellule e detriti cellulari vengono prima di pellet a 10.000 giri in un RC-6 Plus centrifuga Sorvall a 4 ° C per 30 minuti. Surnatante contenente il virus viene rimosso e cellula contiene minacce di pellet in un Beckman Coulter Optima L-90K ultracentrifuga a 4 ° C per 1 ora a 25.000 giri al minuto.
- Il virus-free surnatante viene rimosso e il pellet risospeso virale nei media di congelamento (10% dimetilsolfossido e 90% di siero fetale bovino) e conservati a -80 ° C fino al momento dell'uso.
KSHV infezione di cellule primarie DMVEC. - Cellule DMVEC a 2-5 passaggio di livello sono placcati ad una densità iniziale di 1 x 10 5 in piatti a base 100x20mm colture di tessuti o diapositive da camera, e vengono mantenuti in completo EMB-2 media (Lonza, Basilea, Svizzera) a 37 ° C in un atmosfera del 5% di CO 2. Al 80% confluenza, DMVEC sono infettati in un moi di 0,01; finta infetti (media only) le cellule sono utilizzati come controlli. Mezzi freschi si aggiunge alle cellule ogni 2 giorni.
- Monostrati cellulari DMVEC e diapositive da camera vengono esaminati ogni giorno per la prova di infezione come ha fatto notare la formazione del fuso cellule. Dopo il primo segno della formazione del fuso cellule (7-14 giorni) abbiamo interrompere i cambiamenti dei media. Tuttavia, i tempi di incubazione più lungo al di sopra di 15-21 giorni, senza fornire mezzi freschi possono compromettere l'integrità delle cellule DMVEC conseguente cellule morenti o sollevare fuori il piatto cultura.
- Nel punto di massima spindling durante l'infezione, monostrati cellulari sono raccolte per la preparazione di pellet cellulari per proteine o l'estrazione di RNA. Cellule infettate DMVEC su vetrini da camera vengono lavate due volte con 1 ml / finestra con pre-riscaldato PBS pH 7,4. Cellule su vetrini da camera vengono raccolte dopo il lavaggio 2X con PBS pH 7,4. Ha permesso loro di asciugare completamente prima di rimuovere le camere e ponendo le diapositive in 100% di metanolo tenuto a -20 ° C fino al momento della colorazione di immunofluorescenza (IFA).
2. RNA totale isolamento e produzione di cDNA da Mock e KSHV infetti DMVEC
- RNA totale è estratto da KSHV infetti DMVEC e deridere cellule infettate con un Qiagen RNesay Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Protocollo del produttore per la lavorazione dei tessuti animali è impiegato, ma senza i passi omogeneizzazione, se le cellule in coltura sono la fonte utilizzata per l'isolamento di RNA.
- Selezionare l'opzione offerta di trattare l'RNA con DNAseI sulla colonna utilizzando il Qiagen RNA libero DNAsi Kit, secondo le raccomandazioni del costruttore trova nell'appendice del manuale di istruzioni. DNAaseI degrada ogni genomico contaminante o DNA virale dalla preparazione RNA. Il trattamento DNAseI è fondamentale per le applicazioni a valle compresa RT-PCR, qRT-PCR e analisi microarray.
- L'RNA è lavato in base alle istruzioni e qualsiasi residuo di etanolo nel tampone di lavaggio viene rimosso per centrifugazione della colonna ancora una volta di quanto suggerito dal produttore. Etanolo residuo compromette la purezza del RNA dopo l'eluizione.
- Dopo l'ultimo lavaggio un passo ulteriore centrifugazione viene eseguita prima che l'RNA può essere eluito dalla colonna. L'RNA è eluita dalla colonna con 30 ml di acqua RNAsi libero. L'RNA viene poi quantificato e analizzato per la purezza in una AG-6131 Eppendorf Bio-fotometro. Il rapporto di densità ottica (260/280 nm) dovrebbe essere between1.8-2.0 che è tipico per l'RNA di elevata purezza.
- Per l'analisi microarray, l'RNA viene analizzato su un Agilent 2100 Bioanalyzer utilizzando l'algoritmo software di RIN. L'analisi sul Bioanalyzer vi fornisce un numero di integrità dell'RNA (RIN) da 1-10, ma i numeri RIN 7-10 hanno dimostrato di produrre risultati coerenti e più affidabili per l'analisi microarray o qRT-PCR. Il numero medio di RIN RNA isolaTed con il kit Qiagen RNAeasy nelle nostre mani range 7,5-9.
- La quantificazione di RNA si ottiene con l'aggiunta di 1 ml di RNA eluito a 99 ml di 10mM Tris-EDTA pH 7,6. L'RNA e il buffer è mescolato con una pipetta e aggiunto una cuvetta pulita per l'analisi spettrofotometrica con un Eppendorf Bio-fotometro.
- RNA messaggero di un microgrammo di ogni campione è innescato usando esameri casuali fornito dal produttore, prima di trascrizione inversa con un kit di retromarcia ad alta capacità di trascrizione del DNA (Applied Biosystems, Foster City, CA.).
sintesi di cDNA - Per sintetizzare cDNA a singolo filamento di RNA totale usiamo un High-Capacity cDNA kit di trascrizione inversa da Applied Biosystems e procedere secondo le istruzioni del produttore.
- Un master mix 2x di reagenti è fatto e 0,5 a 1 mg di RNA in un volume di 10 L viene aggiunto a 10 microlitri della miscela dei reagenti 2x master. La soluzione risultante 1x viene delicatamente mescolato e la trascrizione inversa viene eseguita in un MJ BIORAD Mini-termali con idromassaggi cycler secondo le istruzioni del produttore.
- Fino a due microgrammi di RNA totale può essere utilizzato per 20 microlitri di reazione. Il cDNA viene quantificato a 260 nm in un AG-6131 Eppendorf Bio-fotometro, e conservati a -80 ° C fino al momento della qRT-PCR.
3. Microarray Analisi comparativa dei Mock e KSHV cellule infette DMVEC
Il nostro laboratorio esegue analisi microarray presso l'Università Vanderbilt Medical Center Microarray strumento principale risorsa condivisa su una tassa per il servizio base. Confrontiamo i file di output per la disregolazione della trascrizione dei geni nelle cellule infette KSHV DMVEC per deridere le cellule di controllo infettate. Trascrizione dei geni nelle cellule disregolazione KSHV infette che sono rilevanti per l'angiogenesi, la proliferazione cellulare o che rappresentano biomarcatori metastatico sono validati in vitro utilizzando cellule infette KSHV DMVEC utilizzando real time PCR, Western blot, e dual IFA, i risultati vengono confrontati con i risultati in archivio tumore KS tessuti.
4. RT-PCR quantitativa Geni Analisi trascrizionale disregolazione Trovato in Mock-e KSHV infettati DMVEC
- Real Time PCR viene eseguita in 96 pozzetti ottico (Sorenson Bioscience, Inc.), utilizzando la trascrittasi inversa generata cDNA proveniente da un campione di RNA e l'utilizzo di un singolo colore MyiQ Real Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) e 25 volumi di reazione microlitri. Questa procedura viene eseguita in una cappa di sicurezza biologica al fine di evitare eventuali contaminazioni da DNA estraneo / cDNA che potrebbero essere presenti nella stanza.
- Un master mix è preparato in provette da 1,5 ml per ogni set di primer (in base alle istruzioni del produttore) usando SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) e selezionati in avanti e primer reverse per ogni gene di interesse, ad una concentrazione di 250 Nm per pozzetto, realizzato in RNAase DNAase libero H 2 O. Ogni campione deve essere fatta in triplice copia.
- Sequenze primer per qRT-PCR per i geni della cellula ospite includono sequenze primer per KSHV LANA, che è la latenza associata al virus antigene nucleare che è altamente espresso in cellule infette KSHV DMVEC e tumori KS.
- Il 10 ng / ul cDNA magazzino da finto cellule infette infette e KSHV DMVEC sono diluiti 1:03 con RNAase DNAase libero H 2 O; 3μL di questa diluizione si aggiunge a ciascun pozzetto. Controllo di pozzi d'acqua sostituto di cDNA.
- Il 96 pozzetti è sigillata con nastro adesivo ottico (Bio-Rad Laboratories), delicatamente mescolato e centrifugata per 2 minuti a 1000 rpm, temperatura ambiente, per raccogliere la miscela di reazione sul fondo dei pozzetti. La Bio-Rad sistema di rilevazione MyiQ e la lampada è accesa in questo momento per consentire a 10 minuti a periodo di riscaldamento prima di iniziare la corsa.
- I centrifugati 96 pozzetti viene poi messo in una Bio-Rad M Colore singolo iQ reale sistema di Tempo di rilevamento PCR, il programma di sequenze ciclo è entrato e salvati, e la corsa iniziata.
- La sequenza di ciclismo è la seguente: 95 ° C per 3 minuti, 95 ° C per 15 secondi, 60 ° C per 1 minuto, 95 ° C per 1 minuto, 55 ° C per 1 minuto e 55 ° C per 30 secondi per 81 cicli totali. Una curva di fusione è incluso in questo programma come un controllo di efficienza primer. Un insieme Primer GAPDH è amplificato, e incluso per la normalizzazione.
- L'analisi dei dati è fatto con il Bio-Rad iQ5 Optical System Software versione 2.
5. Analisi doppia etichetta Immunofluorescenza di cellule infette KSHV DMVEC
- Diapositive da camera (rimossi dalle camere) contenenti sia DMVEC confluenti infetti e non infetti vengono lavati due volte con PBS pH 7,4, aria secca, e fissati in -20 ° C pre-raffreddata metanolo assoluto per 10 minuti e mantenuto a -20 ° C.
- Vetrini con le cellule sono esimoit aria secca per 15 minuti, e collocato in una vaschetta Coplin sul ghiaccio contenente Tris salino (0.05m Tris pH 7,4) per 5 minuti. Le cellule vengono poi incubate per 1 ora a 37 ° C in una camera umidificata con una miscela di anticorpi monoclonali per KSHV LANA a una diluizione 1:50 in PBS pH 7,4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) più un anticorpo policlonale di capra (1: 100 diluizione in PBS pH 7,4) contro la proteina fattore ospitare trovato per essere dyregulated da microarray utilizzando KSHV cellule infette DMVEC.
- Le cellule vengono poi lavate 3 volte con Tris salino (mai permettono alle cellule di asciugare) e poi incubate per 30 minuti con una miscela di un asino secondario anti-topo IgG coniugato con rodamina rosso-X e asino anti-capra coniugato a FITC (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), sia a una diluizione 1:100 in PBS.
- Le cellule vengono poi lavati 3 volte in soluzione salina Tris in una vaschetta Coplin e mentre le diapositive sono ancora umidi, le diapositive sono montate con Vectashield montaggio di mezzi (Vector Laboratories, Burlingame, CA) contenente 1,5 g / ml di DAPI e un coprioggetto.
- Fluorescenza si osserva e le immagini fotografate con un microscopio a fluorescenza Nikon TE 2000S montato con un charge-coupled device (CCD) della fotocamera. Le fotografie sono scattate con obiettivo 20x per un ingrandimento totale di 200x.
- Fotografie separati allo stesso ingrandimento utilizzata per DAPI (200x), sono presi usinge illuminazione UV, con un filtro verde per rodamina e un filtro blu per FITC. Le immagini vengono poi unite mediante software freeware di Nikon.
6. Doppia immunoistochimica con etichetta su Ks tessuti e Tissue Microarrays Ks per KSHV Lana e il marcatore cellule endoteliali Pecam-1/cd31
- Doppia immunoistochimica etichettato viene eseguita con il kit DAKO colorazione strepavidin duetto ABC per KSHV LANA e quelli delle proteine della cellula ospite risultata alterata dopo l'infezione del virus. IHC viene eseguita su archivio KS-AIDS tessuto fissato in formalina e inclusi in paraffina.
- Cinque sezioni micron vengono tagliati con un microtomo e poste su vetrini chemate prima dell'immunocolorazione.
- Diapositive paraffina sono deparaffinzed in xilene per 10 minuti sotto una cappa aspirante, e quindi le cellule vengono idratati in una serie graduata di etanolo al 100%, 95% e 70% per cinque minuti ciascuno. Le diapositive vengono poi poste in acqua per 10 minuti prima di smascherare l'antigene (noto anche come recupero di antigene).
- Per immunostaining, smascheramento dell'antigene viene eseguita in un forno a microonde in 50 mM citrato pH 6.0 tampone a 95 ° C per 15 minuti. In breve, le diapositive contenenti le cellule sono immerse nel 95 ° tampone citrato C per 15 minuti, quindi subito messo in acqua distillata tenuto a temperatura ambiente.
- Tempra della perossidasi endogena è eseguita incubando i vetrini per 30 minuti in una soluzione di tempra. In breve, aggiungere 47 ml di etanolo al 95% in una provetta da 50 ml, aggiungere 11,2 ml di PBS pH 7,4 e 1,8 ml di perossido di idrogeno al 3% per un totale di 60 ml.
La soluzione tempra è fatta al momento dell'uso. - Le cellule vengono poi lavate 3 volte in PBS pH 7,4 per 5 minuti a temperatura ambiente. Una soluzione bloccante (12,5 ml di etanolo al 95%, 1,4 ml di siero di capra normale, 140 mg di albumina sierica bovina, e 2 gocce di Tween 20) è pronto a prevenire legame aspecifico degli anticorpi. Mettere in ghiaccio prima dell'uso. (Questa soluzione bloccante può essere conservato a 4 ° C e fino a 1 settimana).
- Blocco soluzione è aggiunta al campione sul vetrino e viene poi coperto con una striscia di paraffina (per evitare la disidratazione del campione) e posto in camera umidificata e incubate per 1 ora a temperatura ambiente.
- L'anticorpo primario monoclonale o policlonale per l'antigene virale è preparato nel bloccare soluzione a una diluizione 1:50, mescolato con una pipetta e immessi sul ghiaccio fino al momento dell'uso. Cinquanta a 100 ml di soluzione di anticorpi saranno necessari per campione di tessuto a seconda delle dimensioni degli esemplari e il numero di diapositive.
- Immediatamente dopo l'incubazione la soluzione di saturazione è scrollato di dosso la diapositiva e 50-100 microlitri della anticorpo primario viene aggiunto al campione di tessuto che viene poi coperto con una striscia di paraffina. I campioni sono incubati per 1-2 ore in una camera umidificata a temperatura ambiente.
- Le diapositive contenenti i campioni vengono poi lavare 3 volte per 5 minuti ciascuno in PBS pH 7,4 a cui si aggiunge una secondario biotinilato di capra anti-topo a una diluizione 1:100 in PBS pH 7.4, e incubate in una camera umidificata a temperatura ambiente per 30 - 45 minuti.
- Circa 30 minuti prima di usare, la perossidasi-coniugato strepavidin in PBS pH 7,4 viene preparata. Uso del kit Duet Cytomation DAKO, aggiungere 50 ml di soluzione A e 5 ml di PBS pH 7,4, vortice, e quindi si aggiungono 50 ml di soluzione B e mescolare nuovamente.
- Dopo l'incubazione degli anticorpi in 6,10 passo in completo, le diapositive vengono lavati 3 volte in PBS pH 7.4 e poi il fresco prepared perossidasi-coniugato strepavidin soluzione viene aggiunta e incubazione a temperatura ambiente per 30-45 minuti in una camera umidificata.
- Dopo l'incubazione, i vetrini vengono lavati 3 volte in PBS pH 7,4 a temperatura ambiente. Cinque minuti prima del lavaggio è completo, il 3, 3-diammino-benzidina (DAB, SIGMA) soluzione di substrato (20 ml di PBS pH 7,4, 25 ml di perossido di idrogeno al 3%, e 1 DAB compressa) è preparato. Dopo la tavoletta DAB è completamente sciolto, la soluzione di colore bruno viene filtrata attraverso un filtro da 0,45 micron siringa. La soluzione DAB filtrata viene quindi aggiunta ai modelli dopo l'ultimo lavaggio e lo sviluppo del colore per KSHV LANA nelle cellule infette si osserva in tempo reale sotto illuminazione brightfield utilizzando un microscopio Nikon Eclipse E200. Una volta che lo sviluppo del colore desiderato è raggiunto, la reazione è spento da incubazione in acqua distillata per 5 minuti.
- Per il dual etichettati IHC, dopo incubazione in acqua le slide contenenti i campioni sono messi attraverso il protocollo IHC per la seconda volta a partire dalla fase di recupero dell'antigene (6,4). Tuttavia i cambiamenti protocollo al passo substrato della perossidasi (6.11) in quanto al posto della perossidasi-coniugato strepavidin, una fosfatasi alcalina strepavidin coniugato è impiegato
- L'etichettatura secondo è ottenuto un ulteriore passo recupero dell'antigene nel forno a microonde, come descritto sopra, più un immunostaining secondo con un anticorpo monoclonale per la proteina cellulare trovato per essere disregolazione (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Le cellule sono poi lavate, e poi incubate con un biotinilato di capra anti-mouse/rabbit IgG (DAKO) ad una diluizione 1:100 seguita da una fosfatasi alcalina strepavidin coniugato (Labs Vector, Burlingame, CA) alla diluizione 1:500. Sviluppo del colore si ottiene incubando le cellule con il rosso vettore di supporto con un Red Vector alcalino Kit substrato fosfato (Vector Laboratories, Burlingame, CA) secondo le istruzioni del produttore. Colorazione contatore, se desiderato, può essere eseguita con o orecin ematossilina. Campioni di tessuto sono poi montati in modo permanente con permount mezzi di montaggio con un vetro di copertura. Le immagini sono prese in condizioni di illuminazione campo chiaro con un TE-2000S microscopio Nikon montato con una telecamera CCD.
7. Consegna trasduzione genica adenovirus di celle DMVEC
- Normali cellule sono coltivate in DMVEC diapositive da camera al rivestimento di densità 2,5 X10 5 celle per camera EBM-2 mezzi di comunicazione completo.
- DMVEC cellule sono coltivate a 80 confluenza% (tenendo 3-5 giorni) dopo di che 5 ul / slide finestra di camera di EGFP adenovirus esprimere a titolo 1X 10 10 particelle / ml.
- Vivere colture cellulari DMVEC con Adenovirus aggiunto sono stati esaminati per fluorescenza EGFP 18 ore dopo l'aggiunta del virus.
- Singola fase e fotografie fluorescenti sono state scattate con un ingrandimento totale di 200X e fuse in un microscopio NIKON TE 2000S fluorescente montato con una telecamera CCD.
8. Rappresentante Risultati
Figura 1. Cellule primarie DMVEC da Lonza Corporation sono stati mantenuti in EBM-2 media e sono stati infettati con BCBL-1 virus con una moi di 0,01. Dopo l'infezione DMVEC monostrati cellulari sono stati esaminati tutti i giorni. Dieci giorni dopo l'infezione delle cellule infette mostrano una finta ciottoli simile morfologia e le cellule infettate KSHV esibito una cella mandrino caratteristica morfologia di tipo a forma di fuso cellule endoteliali infetti con KSHV nel tessuto tumorale KS. Le fotografie sono state scattate con un microscopio NIKON TE 2000S montato con una camera CCD con un ingrandimento totale di 100X.
Figura 2. Doppio etichettati colorazione di immunofluorescenza indiretta è stata effettuata su KSHV cellule infette DMVEC a 10 giorni dall'infezione. Cellule infette sono state colorate a doppia con un anticorpo monoclonale KSHV LANA e un anticorpo policlonale di capra di una specifica proteina della cellula ospite risultata essere modificati dopo l'infezione KSHV. Una miscela di asino secondario anti-mouse e asino anti-capra anticorpi coniugati con rodamina FITC e sono state aggiunte. Le cellule sono state esaminate con un microscopio Nikon TE2000S fluorescenti muniti di una telecamera CCD. Mezzi di montaggio con DAPI è stato utilizzato per visualizzare nuclei. Tutte le fotografie sono state scattate con un ingrandimento totale di 200x. Cellule infette che esprime la proteina del virus LANA (rodamina macchiato) localizzate al nucleo mostrare ridotta espressione delle proteine della cellula ospite specifico (FITC macchiato) localizzato citoplasma.
Figura 3. IHC nel tessuto tumorale per la KS e PECAM LANA-1 / CD31. AIDS tessuto tumorale KS è stato macchiato da single e dual etichettati IHC per KSHV e PECAM LANA-1 / CD31. A) mostra macchiato tessuto KS con un anticorpo monoclonale di Lana e di contrasto con ematossilina. LANA cellule positive sono identificati da frecce bianche. B). KS tessuto colorate con un anticorpo monoclonale per PECAMI/CD31 e colorazione sembra specifico per endoteliali intorno ai vasi rappresentato dalle frecce bianche. C) Mostra macchiato tessuto doppio KS per LANA (vettore rosso) e CD31 (marrone) rappresentati da frecce nere per LANA bianco per le cellule colorazione positiva per CD31. D) mostra un ingrandimento inferiore di una zona dalla stessa diapositiva nel pannello C. immagini Brightfield sono stati fotografati in un microscopio NIKON TE2000S con un ingrandimento totale di 600x e 200x AC per il pannello D.
Figura 4. Espressione temporale di KSHV LANA da qRT-PCR 10 giorni dall'infezione rispetto a deridere le cellule di controllo infettate. Tutti i valori per KSHV cellule infette DMVEC sono stati normalizzati per GAPDH. Non c'è stata evidenza di amplificazione LANA cDNA in finto cellule infette.
Figura 5. KS microarray di tessuto tumorale. Il microarray tissutale (TMA) rappresenta il core di 0,6 millimetri di tessuto disposti su una singola diapositiva. Ciascun core del tessuto rappresenta un esemplare KS tumore da un paziente diverso. TMA sono stati resi disponibili attraverso la risorsa del campione Cancro AIDS (ASCR) di Leona Ayers MD presso la Ohio State University. Paraffina tessuto tumorale KS con abbinati i tessuti normali e di controllo positivo sono stati collocati su vetrini. KS campioni di tessuto sono stati prelevati dalla bocca, pelle, palato molle, della lingua, e le masse del collo. Tutti i pazienti erano HIV positivi.
Figura 6. Microarray di tessuto sono state colorate per KSHV LANA mediante immunoistochimica e sono stati analizzati al microscopio brightfield. Sviluppo del colore per LANA è stata effettuata con DAB come substrato perossidasi e cellule LANA positive sono state visualizzate da un modello di intensa colorazione marrone. Diverse quantità di carica virale delle cellule e delle regioni del mandrino può essere osservato. A) rappresenta focale infezione virale nella regione definita del tumore. B) rappresenta l'infezione disseminata, con un notevole carico virale che è più o meno correlata con il numero di cellule presenti mandrino. Nuclei di tessuto colorato sono stati osservati a 200x di ingrandimento.
Figura 7. DMVEC cellule coltivate in EBM-2 mezzi di comunicazione completa con una densità di 2,5 X10 5 cellule per pozzetto sono state trasdotte con 5 ml di Adenovirus in un titolo di 1.0X10 10. Cellule sono state esaminate per fluorescenza EGFP 18 Messaggio trasduzione ore. Entrambe le fasi e le immagini fluorescenti sono state scattate in un microscopio Nikon TE 2000S con un ingrandimento totale di 200X. Trasfezione di cellule primarie DMVEC ha dimostrato di essere problematico vettori quindi abbiamo identificato virale che ci permetterà di offrire fibulin-2 e galetin-3 in modo molto efficiente in DMVEC primaria. Abbiamo scoperto che un adenovirus esprimere EGFP in modo efficiente trasdurre DMVEC primaria. Abbiamo anche trovato che i vettori lentivirali abbiamo ottenuto da Lentigen Corporation è stata altrettanto efficace per trasduzione cellule primarie DMVEC (dati non riportati).
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Discussion
Le metodologie utilizzate in questo rapporto possono essere eseguite in una varietà di impostazioni di laboratorio. Essi richiedono alcune apparecchiature speciali o l'accesso alle strutture di base. Precauzioni devono essere prese quando si fa esperimenti infettive agenti patogeni virali come KSHV che può richiedere l'uso di un livello biosaftey 3 (BSL-3) strutture. Acquisizioni tessuti devono essere approvate dai consigli appropriati revisione istituzionale (IRB).
Queste metodologie insieme possono fornire una base per identificare geni che sono disregolazione espressione in vitro e fornire i metodi definiti per la validazione in vivo di profili di espressione genica alterata e strategie per la consegna del gene in cellule endoteliali. Questi risultati nel loro insieme possono aiutare a chiarire i percorsi biochimici che sono colpiti da infezioni KSHV e successivamente da specifici geni virali. La comprensione di come i virus oncogeni come KSHV interrompere specifici percorsi molecolari in grado di fornire spunti per lo sviluppo di nuove terapie.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo James EK Hildreth, Meharry Medical College, per i suoi consigli e la revisione di questo manoscritto. Ringraziamo anche Diana Marver per l'editing del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Vanderbilt Meharry Centro per la ricerca sull'AIDS (NIH concedere AI054999 P30-05), il Centro per la Salute AIDS Research disparità, NIH concedere 5U54 RR019192-05; Meharry il Centro per la Ricerca Clinica, NIH di Grant P20RR011792 e dal NIH concedere P01 CA113239. DJA è stata in parte finanziata da sovvenzioni pilota della Vanderbilt-Meharry Centro per la ricerca sull'AIDS (CFAR) e il Centro Meharry per la Ricerca Clinica (CRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| PBS pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | 19364 (FLUKA) | |
| EBM-2 media | Lonza Inc. | CC-3156 | + bullet kits supplement |
| DMVEC cells (HMVEC) | Lonza Inc. | CC2543 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SH30066.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Chamber slides | Nalge Nunc international | 154461 | |
| KSHV LANA Mab | Vector Laboratories | VP-H913 | 1:50 dilution/IFA |
| Galectin-3 goat pAb | R&D Systems | AF1154 | |
| Donkey-anti-goat FITC | Jackson ImmunoResearch | 705-095-1 | |
| Donkey-anti-goat Rho | Jackson ImmunoResearch | 705-295-003 | 1:100 dilution/IFA |
| Mounting media | Vector Laboratories | H 1500 | Vectashield with DAPI |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce, Thermo Scientific | 23235 | |
| Nitrocellulose | Bio-Rad | 161-0112 | |
| Donkey-anti-goat-conj. | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC 2020 | |
| Western substrate | Pierce, Thermo Scientific | 34075 | |
| Biotin-rabbit-anti goat | Dako | 305-065-045 | |
| AP-Strepavidin conj. | Dako | K 0492 (kit) | |
| RNase DNase Free Set | Qiagen | 79254 | |
| MJ Mini Cycler | Bio-Rad | PTC-1148C | |
| Bio-Photometer | Eppendorf | 952000006 | |
| RC 6 Plus Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 46910 | |
| Coulter Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 392052 | |
| MYiQ iCycler Real Time PCR Detection System | Bio-Rad | 170-9770 | |
| TE 2000S Fluorescent microscope | Nikon Instruments | TE2000S | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938C | |
| Eclipse E 200 | Nikon Instruments | E 200 | |
| Sorvall Legend RT Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75004377 |
References
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