Summary
Factores de la célula huésped juegan un papel crítico en el establecimiento y mantenimiento de sarcoma de Kaposi (SK). Resumimos los métodos para identificar los factores de la célula huésped alterada en las células infectadas por HVSK DMVEC, y en el tejido tumoral KS. Genes celulares alteradas por el virus servirá como posible objetivo (s) de nuevas terapias.
Abstract
Actualmente KS es el más predominante del VIH / SIDA relacionados con tumores malignos en el sur de África y de ahí el mundo. 1,2 Se caracteriza por ser un tumor angioproliferative de las células endoteliales vasculares y produce enfermedades raras células B linfoproliferativos en forma de linfomas derrame pleural (PEL) y algunas formas de enfermedad de Castleman multicéntrica. 5.3 Sólo 1.5% de las células KS lesiones apoyar activamente la replicación lítica del sarcoma de Kaposi asociado al virus del herpes (HVSK), el agente etiológico asociado con sarcoma de Kaposi, y está claro que los factores celulares que interactuar con factores virales en el proceso de oncogénesis y la progresión del tumor 6,7. Identificación de la novela factor del huésped determinantes que contribuyen a la patología de KS es esencial para el desarrollo de marcadores de pronóstico para la progresión tumoral y la metástasis, así como para el desarrollo de nuevas terapias para el tratamiento del sarcoma de Kaposi 8. Los detalles del vídeo que acompaña a los métodos que utilizamos para identificar a la célula huésped programas de expresión de genes alterados en las células endoteliales microvasculares dérmicas (DMVEC) después de la infección HVSK y en el tejido tumoral KS. 9 Una vez que los genes desregulados son identificados por análisis de microarrays, los cambios en la expresión de la proteína se confirmada por inmunoblot y la inmunofluorescencia doble etiquetado. Cambios en la expresión transcripcional de genes desregulados se confirmó in vitro por cuantitativa en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa (QRT-PCR). La validación de los resultados in vitro usando tejidos de archivo tumor KS también se realiza por inmunohistoquímica doble etiquetado y de microarrays de tejidos 8,10. Nuestro enfoque para identificar los genes que están alteradas en el microambiente del tejido del tumor KS permitirá el desarrollo de la in vitro y, posteriormente, en los sistemas modelo in vivo para descubrimiento y evaluación de nuevos terapéuticos potenciales para el tratamiento del sarcoma de Kaposi.
Protocol
1. KSVH cultivo y la infección de DMVEC
- La línea celular BCBL-1, originalmente aislado de un linfoma de cavidades corporales basados en humanos, se cultiva en completo RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY). BCBL-1 se extraen células del nitrógeno líquido, transportado en hielo seco, y rápidamente se descongela durante 1 minuto a 37 ° C. Una alícuota de 50 L de BCBL-1 en las células a una densidad de 1x10 4 células / ml a 500 ml de medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino, penicilina 1x / estreptomicina y se distribuye en frascos de 175 cm, a 50 ml / frasco .
- Los frascos de BCBL-1 células se incubaron a 37 º C en una atmósfera de 5% de CO 2 hasta que la densidad celular alcanzó 3x106 células / ml. Replicación lítica del virus del ciclo es inducida por la adición de TPA en butirato 20ng / mL y el sodio a 0,3 ng / mL.
- Veinticuatro horas después de la inducción las células se lavan dos veces en PBS pH 7,4 en un volumen de 40 ml por centrifugación a 1500 rpm en una centrífuga Sorvall Legend RT (para eliminar el butirato), y la inducción se continúa con TPA a 20 ng / mL en RPMI 1640 durante 5 días más.
- Virus libre de células se aísla y se concentra por centrifugación diferencial. Brevemente, las células y restos celulares son los primeros gránulos a 10.000 rpm en un Sorvall RC-6 Plus se centrifuga a 4 ° C durante 30 minutos. Sobrenadante que contiene el virus se elimina y se sedimentaron virus libre de células en un Beckman Coulter Optima L-90K ultracentrifugación a 4 ° C durante 1 hora a 25.000 rpm.
- El virus de la libre sobrenadante y el precipitado resuspendido viral en los medios de congelación (dimetilsulfóxido al 10% y el 90% de suero fetal bovino) y almacenados a -80 ° C hasta que se necesite.
HVSK infección de las células primarias DMVEC. - Células DMVEC a 2-5 paso a nivel se siembran a una densidad inicial de 1 x 10 5 en 100x20mm platos de cultivo de tejidos o la cámara de diapositivas, y se mantienen en completa dos EMB-media (Lonza, Basilea, Suiza) a 37 ° C en un atmósfera de 5% de CO 2. El 80% de confluencia, DMVEC se infectan a una moi de 0,01; simulacros de infectados (único medio de comunicación), las células se utilizaron como controles. Medio fresco se añade a las células de cada 2 días.
- Monocapas DMVEC celular y cámara de diapositivas se examinan diariamente para signos de infección como se indica por la formación de células fusiformes. Después de la primera señal de la formación de células fusiformes (7-14 días) que deje de cambios en los medios. Sin embargo, ya los tiempos de incubación de más de 15-21 días sin proporcionar los medios de comunicación fresca puede comprometer la integridad de las células DMVEC resultando en las células que mueren o el levantamiento de la placa de cultivo.
- En el punto de spindling máximo durante la infección, monocapas de células se cosechan para la preparación de gránulos de las células de proteínas o la extracción de RNA. Las células infectadas DMVEC en cámara de diapositivas se lavan dos veces con 1 ml / ventana con pre-calentado PBS pH 7,4. Las células en cámara de diapositivas se cosechan después de lavar 2 veces con PBS pH 7,4. Permite que se sequen completamente antes de retirar las cámaras y la colocación de las diapositivas en el 100% de metanol a cabo en -20 ° C hasta que sea necesario para la tinción de inmunofluorescencia (IFA).
2. El aislamiento de ARN total y producción de cDNA de Mock y HVSK infectados DMVEC
- El ARN total se extrae de infectados por HVSK DMVEC y se burlan de las células infectadas mediante un Qiagen RNesay Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). El protocolo del fabricante para el procesamiento de los tejidos animales se emplea, pero sin los pasos de la homogeneización, si las células cultivadas son la fuente utilizada para el aislamiento de ARN.
- Seleccione la opción que se ofrece para el tratamiento de la ARN con DNAseI en la columna con el ARN Qiagen DNAsa Kit, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante ubicada en el apéndice del manual de instrucciones. DNAaseI degrada los contaminantes o genómica de ADN viral de la preparación de ARN. El tratamiento DNAseI es crítico para aplicaciones aguas abajo como RT-PCR, PCR QRT y análisis de microarrays.
- El ARN se lava de acuerdo con las instrucciones y cualquier etanol residual en el tampón de lavado se elimina mediante la centrifugación de la columna una vez más que lo sugerido por el fabricante. Etanol residual pone en peligro la pureza del ARN después de la elución.
- Después del lavado final una centrifugación adicional se lleva a cabo antes de que el ARN puede ser eluida de la columna. El ARN se eluye de la columna con 30 l de RNasa libre de agua. El ARN se cuantifica y analiza la pureza en un Eppendorf AG-6131 Bio-fotómetro. La relación de la densidad óptica (260/280 nm) debe ser between1.8-2.0 que es típico de ARN de alta pureza.
- Para el análisis de microarrays, el RNA se analiza en un Agilent 2100 Bioanalyzer utilizando el algoritmo de software RIN. El análisis de la bioanalizador le proporciona un número de la integridad del ARN (RIN) de 1-10, sin embargo el número RIN 7-10 han demostrado dar resultados consistentes y fiables para los análisis de microarrays o QRT-PCR. El promedio de número de RIN de aislamiento de ARNted con el kit Qiagen RNAeasy en nuestras manos rangos 7.5 a 9.
- La cuantificación del ARN se logra mediante la adición de una L de ARN eluido de la columna a 99 l de 10 mM Tris-EDTA pH 7,6. El ARN y el tampón se mezcla con una pipeta y se añade a una cubeta limpia para el análisis espectrofotométrico con un Eppendorf Bio-fotómetro.
- El ARN mensajero en un microgramo de cada muestra se prepara con hexámeros aleatorios proporcionado por el fabricante, antes de la transcripción reversa con una alta capacidad de cDNA kit de transcripción reversa (Applied Biosystems, Foster City, CA.).
La síntesis de ADNc - Para sintetizar cDNA de cadena simple de ARN total se utiliza un kit de alta capacidad de cDNA transcripción reversa de Applied Biosystems y proceder de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
- Una mezcla maestra 2x de reactivos se hace y 0,5 a 1 g de ARN en un volumen de 10 l, se añade a 10 l de la mezcla maestra reactivo 2x. La solución resultante se mezcla suavemente 1x y la transcripción inversa se realiza en un BioRad MJ Mini-Térmica termociclador de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
- Un máximo de dos microgramos de ARN total se puede utilizar por 20 l de reacción. El cDNA es cuantificada a 260 nm en un Eppendorf AG-6131 Bio-fotómetro, y almacenadas a -80 ° C hasta que sea necesario para QRT-PCR.
3. Análisis comparativo de microarrays de bocetos y HVSK DMVEC células infectadas
Nuestro laboratorio realiza análisis de microarrays en la Vanderbilt University Medical instalaciones del Centro de Recursos de microarrays núcleo de la base de honorarios por servicio. Se comparan los archivos de salida para la desregulación de la transcripción de los genes en las células infectadas por HVSK DMVEC para burlarse de las células infectadas de control. Transcripcional genes están alteradas en las células infectadas por HVSK que son relevantes para la proliferación de células angiogénesis, o que representan biomarcadores metastásico son validadas in vitro utilizando células infectadas por HVSK DMVEC utilizando PCR en tiempo real, Western blot, y dos IFA, los resultados se comparan con los resultados en archivos tumor KS tejidos.
4. RT-PCR cuantitativa genes análisis transcripcional desregulación encuentra en Maqueta y HVSK infectados DMVEC
- PCR en tiempo real se realiza en 96 y placas de óptica (Sorenson Bioscience, Inc.) utilizando la transcriptasa inversa generó cDNA procedentes de una muestra de ARN purificado y el uso de un solo color MyiQ en tiempo real sistema de detección de PCR (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y 25 volúmenes de reacción de l. Este procedimiento se realiza en una cabina de seguridad biológica para evitar una posible contaminación por ADN extraño / cDNA que pueden estar presentes en la sala.
- Una mezcla maestra se prepara en tubos de 1,5 ml por cada juego de primers (de acuerdo con las instrucciones del fabricante) con SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y selecciona adelante y atrás primers para cada gen de interés, a una concentración de 250 nM por pozo, hecho en ADNasa libre de ARNasa H 2 O. Cada muestra se realizó por triplicado.
- Primer secuencias de QRT-PCR para los genes de la célula huésped incluyen secuencias de los cebadores de HVSK LANA, que es la latencia del virus antígeno asociado a la nuclear, que está altamente expresada en las células infectadas HVSK DMVEC y los tumores del SK.
- El 10 ng / ul ADNc acciones de simulacros de infectados y HVSK células infectadas DMVEC se diluyen 1:03 con ADNasa libre de ARNasa H 2 O; 3μL de esta dilución se añade a cada pocillo. Control de los pozos de agua sustituto de cDNA.
- La placa de 96 y está sellada con cinta aislante óptico (Bio-Rad Laboratories), se mezcló suavemente y se centrifuga durante 2 minutos a 1000 rpm, a temperatura ambiente, para recoger la mezcla de reacción en la parte inferior de los pozos. El sistema Bio-Rad MyiQ detección y la lámpara se enciende en este momento para permitir a 10 minutos de calentamiento antes de comenzar la carrera.
- El centrifugado placa de 96 pocillos se coloca en un Bio-Rad Sistema M iQ único color real de detección de PCR en tiempo, el programa de secuencias de ciclo de introducir y guardar, y comenzó la carrera.
- La secuencia del ciclo es el siguiente: 95 ° C durante 3 minutos, 95 ° C durante 15 segundos, 60 ° C durante 1 minuto, 95 ° C durante 1 minuto, 55 ° C durante 1 minuto y 55 ° C durante 30 segundos para 81 ciclos. Una curva de fusión se incluyen en este programa como un cheque por la eficiencia de imprimación. Un conjunto de cebadores GAPDH se amplifica, y se incluye para la normalización.
- Análisis de los datos se hace con el Bio-Rad iQ5 versión del software del sistema óptico 2.
5. Análisis de doble etiqueta de inmunofluorescencia HVSK DMVEC células infectadas
- Cámara de diapositivas (retirado de las cámaras), que contiene tanto DMVEC confluentes infectadas y no infectadas se lavaron dos veces con PBS pH 7,4, secado al aire, y se fija en -20 ° C antes de la helada metanol absoluto durante 10 minutos y se mantiene a -20 ° C.
- Portaobjetos con células ªen secado al aire durante 15 minutos, y se coloca en un frasco de Coplin de hielo que contenía Tris salino (0,05 M Tris pH 7,4) durante 5 minutos. Las células se incuban durante 1 hora a 37 ° C en una cámara húmeda con una mezcla de anticuerpos monoclonales para HVSK LANA a una dilución 1:50 en PBS pH 7,4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA), además de un anticuerpo policlonal de cabra (1: 100 de dilución en PBS pH 7,4) frente a la proteína del factor de host que se encuentra por dyregulated utilizando microarrays HVSK DMVEC las células infectadas.
- Las células se lavan 3 veces con Tris salino (nunca permitir que las células que se seque) y se incubaron durante 30 minutos con una mezcla de un burro secundario anti-ratón IgG conjugado con rodamina rojo-X y el burro de cabra anti-anticuerpo conjugado con FITC (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), ambos a una dilución 1:100 en PBS.
- Las células son luego lavados 3 veces en Tris salina en un frasco de Coplin y mientras que las diapositivas están todavía húmedas, las diapositivas están montados con Vectashield montaje de los medios de comunicación (Vector Laboratories, Burlingame, CA) que contiene 1,5 g / ml de DAPI y cubreobjetos uno.
- Se observa fluorescencia y las imágenes fotografiadas con un microscopio Nikon TE 2000S fluorescente montado con un dispositivo de carga acoplada (CCD). Las fotografías son tomadas con un objetivo de 20x para una ampliación total de 200x.
- Fotografías por separado con el mismo aumento utilizado para DAPI (200x), se toman usinge iluminación UV, con un filtro verde para la rodamina y un filtro azul para FITC. Las imágenes son más tarde se fusionó con el software gratuito de Nikon.
6. La inmunohistoquímica doble etiquetado en los tejidos y Ks Ks Microarrays de tejidos para HVSK Lana y el marcador de células endoteliales Pecam-1/cd31
- Inmunohistoquímica doble etiquetado se lleva a cabo con el kit Dako strepavidin tinción ABC dúo de HVSK LANA y las proteínas de la célula huésped encuentra alterada después de la infección por el virus. IHC se realiza en el archivo SK-SIDA tejido fijado en formalina y embebidos en parafina.
- Cinco secciones micras se cortan con un microtomo y se colocan en portaobjetos Chemate antes de la inmunotinción.
- Diapositivas incluidas en parafina se deparaffinzed en xileno durante 10 minutos bajo una campana, y luego las células se hidratan en una serie de etanol escalonadas al 100%, 95% y 70% durante cinco minutos cada uno. Las diapositivas se colocan en agua durante 10 minutos antes de desenmascarar el antígeno (también conocida como la recuperación de antígeno).
- Por inmunoticción, desenmascarar el antígeno se realiza en un horno de microondas en 50 mM citrato buffer de pH 6,0 a 95 ° C durante 15 minutos. En pocas palabras, las diapositivas que contienen las células se encuentran sumergidos en tampón citrato 95 ° C durante 15 minutos, e inmediatamente después se coloca en agua destilada, mantenida a temperatura ambiente.
- Extinción de la peroxidasa endógena se realiza mediante la incubación de diapositivas durante 30 minutos en una solución de enfriamiento. En pocas palabras, agregar 47 ml de etanol al 95% a un tubo cónico de 50 ml, añadir 11,2 ml de PBS pH 7,4 y 1,8 ml de peróxido de hidrógeno al 3% para un total de 60 ml.
La solución de enfriamiento se hace justo antes de su uso. - Las células se lavan 3 veces en PBS pH 7,4 durante 5 minutos cada una a temperatura ambiente. Una solución de bloqueo (12,5 ml de etanol al 95%, 1,4 ml de suero normal de cabra, 140 mg de albúmina sérica bovina, y 2 gotas de Tween 20) se prepara para evitar que la unión no específica de anticuerpos. Lugar en el hielo antes de su uso. (Esta solución de bloqueo se puede almacenar a 4 ° C y para un máximo de 1 semana).
- Solución de bloqueo, se añade a la muestra en el portaobjetos y se cubre con una tira de parafina (para evitar la desecación de la muestra) y se coloca en cámara húmeda y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente.
- El principal anticuerpo monoclonales o policlonales contra el antígeno viral se prepara en solución de bloqueo a una dilución de 1:50, se mezcla con una pipeta y se coloca en hielo hasta que se necesite. Cincuenta a 100 L de solución de anticuerpos será necesaria por muestra de tejido, dependiendo del tamaño de los ejemplares y el número de diapositivas.
- Inmediatamente después de la incubación de la solución de bloqueo se agita fuera de la diapositiva y 50-100 l del anticuerpo primario se añade a la muestra de tejido que luego se cubre con una tira de parafina. Las muestras se incuban durante 1-2 horas en una cámara húmeda a temperatura ambiente.
- Las diapositivas que contienen las muestras son luego lavar 3 veces durante 5 minutos cada uno en PBS pH 7,4 al que se añade un segundo biotina de cabra anti-ratón de anticuerpos en una dilución de 1:100 en PBS pH 7,4, y se incubaron en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 30 - 45 minutos.
- Aproximadamente 30 minutos antes de usar, el conjugado con peroxidasa-strepavidin en PBS pH 7,4 se prepara. Utilizando el Kit Dúo DAKO Cytomation, se añaden 50 l de la solución A y 5 ml de PBS pH 7,4, vórtice, a continuación, añadir 50 l de la solución B y mezclar de nuevo.
- Después de la incubación de anticuerpos en el 6,10 en el paso completo, las diapositivas se lavan 3 veces en PBS pH 7,4 y luego el recién prperoxidasa de rábano conjugada epared-strepavidin solución y se incuba a temperatura ambiente durante 30-45 minutos en una cámara húmeda.
- Después de la incubación, los portaobjetos se lavaron 3 veces en PBS pH 7,4 a temperatura ambiente. Cinco minutos antes de que el lavado sea totalmente efectivo, el 3, 3-diamino-bencidina (DAB, SIGMA) solución de sustrato (20 ml de PBS pH 7,4, 25 l de peróxido de hidrógeno al 3%, y una tableta de DAB) se prepara. Después que la tableta se disuelva por completo DAB, la solución de color marrón se filtra a través de un filtro de jeringa de 0,45 micrómetros. La solución DAB filtrado se añade a las muestras después del último lavado y el desarrollo del color de HVSK LANA en las células infectadas se observa en tiempo real con iluminación campo claro con un microscopio Nikon Eclipse E200. Una vez que el desarrollo del color deseado, la reacción se apaga por la incubación en agua destilada durante 5 minutos.
- Por doble etiquetado IHC, después de la incubación en agua las diapositivas que contienen las muestras se introducen en el protocolo de IHC, por segunda vez a partir de la etapa de recuperación de antígeno (6,4). Sin embargo, los cambios de protocolo en la etapa de sustrato de peroxidasa (6,11) en el que en lugar de la peroxidasa de rábano conjugada-strepavidin, una fosfatasa alcalina strepavidin conjugado se emplea
- El etiquetado segundo se consigue un paso adicional de recuperación de antígeno en el microondas como se describió anteriormente, más un segundo inmunotinción con un anticuerpo monoclonal contra la proteína celular, que están alteradas (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Las células son posteriormente lavados, y luego incubadas con un biotina cabra anti-ratón/conejo de anticuerpos IgG (Dako) a una dilución 1:100 seguida de una fosfatasa alcalina strepavidin conjugado (Vector Labs, Burlingame, CA) en la dilución 1:500. El desarrollo del color se logra por las células incubadas con el rojo vector sustrato utilizando un vector rojo kit alcalina sustrato fosfato (Vector Laboratories, Burlingame, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tinción de venta libre, si así se desea, se puede realizar con o orecin hematoxilina. Las muestras de tejido luego se monta permanentemente con Permount medios de montaje con una cubierta de vidrio. Las imágenes son tomadas bajo iluminación claro con una Nikon TE-2000S microscopio montado con una cámara CCD.
7. Gen de entrega de transducción de adenovirus de las células DMVEC
- Las células normales DMVEC se cultivan en la cámara de diapositivas en el revestimiento de la densidad de 2,5 x10 5 células por la cámara de EBM-2 los medios de comunicación completa.
- DMVEC células se cultivan en la confluencia del 80% (teniendo en 3-5 días) después de los cuales 5 ul / ventana de la cámara de diapositivas de adenovirus que expresan EGFP a un título 1X 10 10 partículas / ml.
- Cultivos vivos DMVEC celular con adenovirus añadido fueron examinados para EGFP fluorescencia 18 horas después de la adición de los virus.
- Fase y fotografías fluorescentes fueron tomadas en una ampliación total de 200X y se fusionó en un microscopio Nikon TE 2000S fluorescente montado con una cámara CCD.
8. Resultados representante
Figura 1. Células primarias de DMVEC de Lonza Corporación se mantuvieron en un EBM-dos los medios de comunicación y se infectaron con el virus de la BCBL-1 a una moi de 0,01. Después de la infección monocapas de células DMVEC fueron examinados diariamente. Diez días después de la infección las células infectadas por burlarse de mostrar un adoquín-como la morfología y las células infectadas por HVSK exhibió un tipo de células fusiformes morfología característica de las células endoteliales en forma de huso encontraron infectados con HVSK en el tejido tumoral KS. Las fotografías fueron tomadas con un microscopio Nikon TE 2000S montado con una cámara CCD con un aumento total de 100X.
Figura 2. Doble etiquetado inmunofluorescencia indirecta se realizó en las células infectadas por HVSK DMVEC a los 10 días post infección. Las células infectadas se tiñeron de doble con un anticuerpo monoclonal a HVSK LANA y un anticuerpo policlonal de cabra a una proteína de la célula huésped específico que se encuentra para ser modificado después de la infección por HVSK. Una mezcla de burro secundario anti-ratón de cabra y el asno anti-anticuerpos conjugados con rodamina y FITC han añadido. Las células fueron examinados con un microscopio Nikon TE2000S fluorescente equipado con una cámara CCD. Medios de montaje con DAPI se utiliza para visualizar los núcleos. Todas las fotografías fueron tomadas con un aumento total de 200x. Células infectadas que expresan la proteína del virus de LANA (rodamina manchada) localizada en el núcleo muestran una menor expresión de la proteína de la célula huésped específico (FITC manchada) localizada en el citoplasma.
Figura 3. IHC en el tejido del tumor para KS LANA y PECAM-1 CD31 /. Sida tejido tumoral KS fue manchado por IHC marcado uno y dos por HVSK LANA y PECAM-1 / CD31. A) Muestra de tejido teñido KS con un anticuerpo monoclonal de LANA y de contraste con hematoxilina. LANA células positivas se identifican por las flechas blancas. B). KS tejidos teñidos con un anticuerpo monoclonal para PECAMI/CD31 y tinción específica para endotelial aparece alrededor de los vasos representado por las flechas blancas. C) muestra manchas KS tejido doble de LANA (vector rojo) y CD31 (marrón) lo señalan las flechas negro para LANA un blanco para las células de tinción positiva para CD31. D) muestra un aumento menor de un área de la misma diapositiva en el panel C. imágenes campo claro fueron fotografiados en un microscopio NIKON TE2000S con un aumento total de 600x 200x AC y para el Grupo D.
Figura 4. Expresión temporal de HVSK LANA de QRT-PCR 10 días después de la infección en comparación con el simulacro de control de las células infectadas. Todos los valores de las células infectadas por HVSK DMVEC se normalizaron a GAPDH. No se encontraron pruebas de amplificación de cDNA LANA en simulacros de las células infectadas.
Figura 5. KS microarrays de tejido tumoral. El microarray tisular (TMA) representa un 0,6 milímetros núcleos de tejido dispuestas en una sola diapositiva. Cada núcleo de tejido representa una muestra del tumor de un paciente con KS diferentes. TMA se pusieron a disposición a través del recurso de muestras SIDA Cáncer (ASCR) de Leona Ayers MD Universidad Estatal de Ohio. Embebidos en parafina de tejidos KS tumor, junto con los tejidos encontrados control normal y positivo se colocaron en portaobjetos de vidrio. Muestras de tejido KS fueron tomadas de la boca, la piel, el paladar blando, la lengua y las masas cervicales. Todos los pacientes eran VIH positivos.
Figura 6. Microarrays de tejidos fueron teñidas con HVSK LANA mediante técnicas de inmunohistoquímica y se analizaron mediante microscopía de campo claro. El desarrollo de color de LANA se realizó con DAB como sustrato de peroxidasa y células LANA positivo se visualizaron mediante un patrón de coloración marrón intenso. Diferentes cantidades de carga viral y las regiones de células fusiformes se puede observar. A) representa la infección focal viral en la región definida del tumor. B) representa una infección diseminada con una alta carga viral que es más o menos correlacionados con el número de células fusiformes presentes. Núcleos de tejido teñido se observaron a 200x aumentos.
Figura 7. DMVEC células cultivadas en un EBM-dos los medios de comunicación completa con una densidad de 2,5 x10 5 células por así fueron transducidas con 5 L de adenovirus a un título de 1.0x10 10. Las células fueron examinados para EGFP fluorescencia 18 horas después de transducción. Tanto en fase como imágenes fluorescentes fueron tomadas en un microscopio Nikon TE 2000S con un aumento total de 200X. La transfección de células primarias de DMVEC ha demostrado ser problemática por lo tanto, hemos identificado los vectores virales que nos permitirá ofrecer fibulina-2 y galetin 3-de manera muy eficiente en DMVEC primaria. Hemos encontrado que un adenovirus que expresan EGFP eficiente puede transducir DMVEC primaria. También se encontró que el vector lentiviral se obtuvieron a partir de Lentigen Corporation fue igual de eficaz para transducir células primarias DMVEC (datos no mostrados).
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Discussion
Las metodologías utilizadas en este informe se puede realizar en una variedad de entornos de laboratorio. Que requieren algún equipo especial o acceso a instalaciones básicas. Las debidas precauciones se deben tomar al hacer experimentos con virus patógenos infecciosos como HVSK que puede requerir el uso de un nivel biosaftey 3 (BSL-3) instalaciones. Adquisiciones de los tejidos también debe ser aprobado por las juntas de revisión institucional adecuado (IRB).
Estas metodologías en conjunto pueden proporcionar una base para la identificación de genes que están alteradas en la expresión in vitro y proporcionar los métodos definidos para la validación in vivo de la alteración de los perfiles de expresión génica y las estrategias para la entrega de genes en las células endoteliales. Estos resultados tomados en conjunto pueden ayudar a dilucidar las vías bioquímicas que se ven afectados por la infección por HVSK y posteriormente por los genes específicos del virus. La comprensión de cómo los virus oncogénicos como HVSK interrumpir vías moleculares específicas podría proporcionar información en el desarrollo de nuevas terapias.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a James EK Hildreth, Meharry Medical College, por su asesoramiento y revisión de este manuscrito. También queremos agradecer a Diana Marver para la edición del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Centro de Meharry Vanderbilt para la Investigación del SIDA (NIH P30 AI054999-05), el Centro de Salud SIDA disparidades de Investigación, NIH RR019192 5U54-05, el Centro de Meharry de Investigación Clínica, de Subvenciones del NIH P20RR011792, y por el NIH conceder P01 CA113239. DJA fue parcialmente financiado por las subvenciones piloto del Centro Vanderbilt-Meharry for AIDS Research (CFAR) y el Centro para la Investigación Clínica Meharry (CRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| PBS pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | 19364 (FLUKA) | |
| EBM-2 media | Lonza Inc. | CC-3156 | + bullet kits supplement |
| DMVEC cells (HMVEC) | Lonza Inc. | CC2543 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SH30066.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Chamber slides | Nalge Nunc international | 154461 | |
| KSHV LANA Mab | Vector Laboratories | VP-H913 | 1:50 dilution/IFA |
| Galectin-3 goat pAb | R&D Systems | AF1154 | |
| Donkey-anti-goat FITC | Jackson ImmunoResearch | 705-095-1 | |
| Donkey-anti-goat Rho | Jackson ImmunoResearch | 705-295-003 | 1:100 dilution/IFA |
| Mounting media | Vector Laboratories | H 1500 | Vectashield with DAPI |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce, Thermo Scientific | 23235 | |
| Nitrocellulose | Bio-Rad | 161-0112 | |
| Donkey-anti-goat-conj. | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC 2020 | |
| Western substrate | Pierce, Thermo Scientific | 34075 | |
| Biotin-rabbit-anti goat | Dako | 305-065-045 | |
| AP-Strepavidin conj. | Dako | K 0492 (kit) | |
| RNase DNase Free Set | Qiagen | 79254 | |
| MJ Mini Cycler | Bio-Rad | PTC-1148C | |
| Bio-Photometer | Eppendorf | 952000006 | |
| RC 6 Plus Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 46910 | |
| Coulter Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 392052 | |
| MYiQ iCycler Real Time PCR Detection System | Bio-Rad | 170-9770 | |
| TE 2000S Fluorescent microscope | Nikon Instruments | TE2000S | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938C | |
| Eclipse E 200 | Nikon Instruments | E 200 | |
| Sorvall Legend RT Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75004377 |
References
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