Intraveneuze micro-injecties van de zebravis Larven tot acute nierschade Study

Summary

Beschrijven we een techniek van microinjecting de aminoglycoside, gentamicine, in 2 dagen na de fetilization (DPF) zebravis larven tot acute nierschade (AKI) te induceren. We hebben ook een methode voor het ganse berg immunohistochemie te beschrijven, plastic inbedden en snijden van de zebravis larven aan de AKI gemedieerde schade te visualiseren.

Abstract

In deze video artikel beschrijven we een zebravis model van de AKI gebruik van gentamicine als nephrotoxicant. De techniek bestaat uit het intraveneus micro-injecties op 2 DPF zebravis. Deze techniek is een efficiënte en snelle methode om oplosbare stoffen te leveren in de bloedbaan van de zebravis larven, waardoor de injectie van 15-20 vissen per uur. Naast de AKI studies, kan deze micro-injectie techniek ook worden gebruikt voor andere vormen van experimentele studies, zoals angiografie. Wij bieden een gedetailleerd protocol van de techniek van de apparatuur die nodig is om visuele maatregelen van verminderde nierfunctie. Daarnaast hebben we ook aantonen het proces van fixatie, ganse berg immunohistochemie met een nier tubuli marker, plastic inbedding en opdeling van het larvale zebravis. We laten zien dat zebravis larven ingespoten met gentamicine tonen morfologische kenmerken in overeenstemming met AKI: oedeem, verlies van cel polariteit in proximale tubulaire epitheliale cellen, en morfologische verstoring van de tubulus.

Protocol

Een deel van het volgende protocol is gebaseerd op gepubliceerde methoden gerapporteerd door (Hentschel et al.. 2005) en (Weinstein et al.. 1995) met kleine wijzigingen.

Deel 1: micro-injecties

Stel van tevoren voor micro-injectie

• De vissen worden geïnjecteerd op 2 dagen na de bevruchting (DPF). Daarom worden volwassen zebravissen gefokt 3 nachten voorafgaand aan een geplande experiment. Verzamel embryo's en ze in een petrischaal met water E3 (5mm NaCl, 0.17mM KCL, 0,33 mm _CaCl2, 0,33 mm MgSO ₄₎ plaats bij 28,5 ° C. Aan het einde van de eerste dag te verwijderen dode embryo's uit de petrischaal en aparte embryo's zodat er tachtig tot honderd embryo's per petrischaal.
• Bereid de glazen naalden te trekken uit capillaire buisjes (4 cm in lengte, 0,63 / 0,20 OD / ID millimeter (mm) R-6 Custom glazen buizen Drummond wetenschappelijk bedrijf, Broomall, PA 9-000-3000) met een elektrode puller. De tip diameter moet worden van 10-20 urn. Onder een dissectiemicroscoop (Leica S6E), tekenen met een permanent marker ongeveer 10 1mm lijnen langs de naald, met de hulp van een heerser, en slaan de naalden in een grote petrischaal op klei hellingen.
• Bereid de holding pipet: Fire-polish de punt van een dunwandige borosilicaatglas capillaire buis (152 mm, 1 / 0,75 OD / ID mm TW100-6, World precisie-instrumenten, Inc) in een bunsenbrander vlam tot de binnendiameter van de tip is 0,4-0,5 mm. Dergelijke dimensie zorgt voor een goede grip van de dooierzak van een 2 DPF zebravis larven. Houd een uiteinde van een stuk glas capillair met lange pincet, en warmte het tegenovergestelde tip met de capillair met de bunsenbrander, waardoor het verticaal over de lichtblauwe binnenkant kegel van de vlam, het heetste deel, voor 1-2 seconden, walsen te verkrijgen een nog smelten. Herhaal dit een paar keer dan is de capillaire onderzoeken onder de microscoop, op een podium micrometer (Ward's 94 W 9910). Dit is een belangrijke stap, kan het nodig zijn om brand-polish een paar holding pipetten en later kies het juiste formaat, terwijl je het manipuleren van de larven. Als je voorzichtig bent, een holding pipet duurt meerdere micro-injectie sessies.
• Vul de Manual Micro-pomp (MMP, World precisie-instrumenten, Inc,) met minerale olie, volgens de instructies van de fabrikant. De pipet houder is ingevoegd in een joystick manipulator (Narishige, MN-151), verbonden met een magnetische voet (Narishige, MN 151) om een ​​ijzeren plaat (Narishige, IP).

Micro-injectie

• Bereid 20μl van de injectie mengsel:. 2.4μl gentamicine (Sigma-Aldrich G8648, 50mg/ml in zoutoplossing) en 17.6μl 10-kDa Lucifer geel dextran (Invitrogen D1825, (1mg/ml in zoutoplossing) in de controlegroep vissen de gentamicine wordt vervangen door een zoutoplossing. De fluorescerende dextran (vele verschillende kleuren kunnen worden gebruikt) is voldoende om de juistheid van de injectie te controleren en de larven die zijn ingespoten met het nephrotoxicant te selecteren.
• Bereid twee 30mm Petri gerechten met 2ml minerale olie voor het plaatsen van de injectie mengsel en mengsel onder controle, de verdamping van de oplossingen te voorkomen.
• Bereid de verdoving: 400 mg poeder tricaïne (ethyl-m-aminobenzoaat methaansulfonaat SIGMA A-5040) 97,7 ml DD water, 2,1 ml 1 M Tris (pH 9). Aanpassen aan pH 7. Bewaar dit bestand oplossing in de diepvriezer, in porties van 4,2 ml. Voor het gebruik van tricaïne als een verdovingsmiddel verdunnen van de 4,2 ml tricaïne voorraad oplossing in 100 ml water E3 (Westerfield 1993) en laat op kamertemperatuur.

De volgende stappen worden uitgevoerd onder een dissectiemicroscoop

• Handmatig verwijderen alle resterende chorions met fijn pincet en verdoven de zebravis over te dragen in een petrischaal met tricaïne opgewarmd bij kamertemperatuur. Zebravis moeten worden blootgesteld aan tricaïne tenminste 15 minuten voor aanvang van de micro-injecties.
• Open de punt van de injectienaald met behulp van een scheermesje (VWR wetenschappelijke 55411-050). Houd het mes onder een lichte hoek naar een schuine maken en snijd de tip, zoals een tip opening van ongeveer 10-20μm diameter te verkrijgen.
• Schakel de stroom, vacuüm en luchttoevoer van de micro-injectie apparatuur (World precisie-instrumenten Inc, PV820 pneumatische picopump). Steek de naald in de naaldhouder gemonteerd op de micromanipulator en kantelen base (Word precisie-instrumenten, Inc, Model M3301R, TB-1).
• Voor het vullen van de naald, plaats een druppel (10μl) van de oplossing te worden geïnjecteerd in de 30mm petrischaal gevuld met minerale olie (Fisher Chemicals, 0121-1). Zet de handleiding micromanipulator om zo onder water de punt van de naald in de druppel van de oplossing, stelt u de picopump "hold / vent" schakelaar op "vent" ("vent" gelijk aan vacuüm op de PV820), en de naald door te trekken te vullen oplossing in door middel van de naald. Dit duurt een paar minuten, als de oplossing komt in de naald te snel,dat betekent dat de diameter van de tip is te groot, en de injecties niet accuraat zijn. Nadat de naald is gevuld, zet u de picopump op "hold" ("hold" staat gelijk aan injecteren op de PV820).
• Het ijken van de naald, stel de picopump 'gated / getimed "schakelaar op" gated ", druk op het voetpedaal om de naald ontladen, en de tijd die het duurt (in seconden) record voor de meniscus te reizen van de ene markering naar de volgende (1 mm totale afstand). Herhaal dit drie keer, neem dan de gemiddelde tijd (in seconden), en deel de waarde door 30 (volume in nanoliters (nl), overeenkomend met 1 mm lineaire afstand) om het aantal milliseconden nodig is om een ​​nl van de oplossing af te geven. Stel het bereik periode knop op dit nummer, en verplaats de 'gated / getimed "-schakelaar op' getimed '. Nu is de picopump is ingesteld op een 1nl puls van de oplossing te leveren.
• Verwijder de minerale olie schotel en de positie van de petrischaal met de larven onder de microscoop. Group de vis in het midden van de petrischaal en focus.
• Plaatst zij het bedrijf pipet in de handleiding micro-pomp (MMP, World precisie-instrumenten) aan de andere kant van de microinjector, vooraf de tip om de petrischaal, en in het vlak van focus van de microscoop. Buig het met een vrij ondiepe hoek, zodat het uiterste puntje van de holding pipet is de bodem van de petrischaal aanraken en ligt dicht bij horizontaal. Zorg ervoor dat er geen luchtbel in het systeem, waardoor de reactietijd vertragen en verminderen de precisie van de MMP.
• Veranderen naar een hogere vergroting op de microscoop en het gebruik van een superfijne wimpers met handgreep (Ted Pella 113) aan de larvale vissen dorsale zijde positie beneden met de dooier heel dicht bij het bedrijf pipet. Houd de larvale vis door zuigen de dooier in de holding pipet door het draaien tegen de klok in de micrometer rijden regelen van de handleiding micro-pomp. Zorg ervoor dat u de micrometer weer te ver, omdat de dooier kan barsten als iemand eraan trekt ook diep in de holding pipet. Focus op de vorming van gemeenschappelijke kardinaal ader, die ligt over de dooier, net onder de periderm en is de site van zeer hoge bloedstroom. Met de micromanipulator van de injectie apparaat, begeleiden de naald in de ontwikkeling van gemeenschappelijke kardinaal ader. Het is meestal nodig om de naald terug te trekken een beetje na het inbrengen, als de gemeenschappelijke kardinaal ader is zeer oppervlakkig. Injecteer 1nl van de oplossing door het indrukken van de voetpedaal, laat dan de larven uit het bedrijf pipet en terug naar embryo water. Dit is een belangrijke stap, vooral de eerste keer, want het vergt een bepaalde hoeveelheid van de praktijk in het positioneren van de vis en controleren van de zuig-en de druk van het tuig. Als de dooier van het embryo is goed gevoerd met de holding pipet, zal het niet rollen als de naald.
• Om te controleren het succes van de micro-injectie, toezicht op de aanwezigheid van de Lucifer geel dextran in het hart van de zebravis onder een fluorescentiemicroscoop. De lucifer geel blijft zichtbaar in het hart van ongeveer 20 minuten voordat afvoeren in de bloedsomloop Als de nefrotoxische oplossing de juiste manier ingespoten, binnen 2 uur na de injectie zie je heel weinig lucifer geel dextran blijven op de plaats van injectie. Als de oplossing wordt geïnjecteerd in de dooierzak, een plek van Lucifer geel dextran zal blijven op de plaats van injectie. (Afb. 1). Breng de vis op E3 ​​medium.
• Twee dagen na de injectie, ontwikkelen de larven zich pericardiale oedeem als gevolg van een verminderde nierfunctie (afb. 2).

Deel 2: Bevestiging en immunofluorescentie met Na ⁺ / K ⁺ ATPase antilichaam (α-6F)

• Op 4 DPF, zet tussen de 10 en 15 larvale zebravis in 4ml glazen flesjes (Weathon, 225.012) en bevestig ze in 1 ml Dent's (80% MeOH 20% DMSO) gedurende 4 uur bij kamertemperatuur.
• Hydrateren van de embryo's in een gegradeerde MeOH / PBT (PBS met 0,5% Tween20) series, 75:25 50:50, 25:75, 100% PBT, pipetteren de oplossing uit en het toevoegen van nieuwe oplossing met dezelfde flacon (1 ml oplossing per flacon), 20 minuten in elke oplossing. Larven mag nooit worden blootgesteld aan lucht, laat een beetje oplossing voor de larven bij het wisselen van oplossingen.
• Verwijder de PBT en vervang 1 ml met blokkerende oplossing (PBS met 1% DMSO, 0,5% Tween20, 10% normaal geit serum) gedurende 3 uur bij 4 ° C op een nutator.
• Overdracht van de larven in een 2 ml microcentrifuge. Verwijder de blokkering serum en te vervangen door 300μl primaire antilichaam in incubatie-oplossing (PBS met 1% DMSO, 0,5% Tween20, 2% Normaal geit serum) overnacht bij 4 ° C op een nutator. We maken gebruik van een monoklonaal Na ⁺ / K ⁺ ATPase antilichaam (α-6F, supernatant, Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa) op 1:25 verdunning
• Verwijder het primaire antilichaam en was 3 x 30 minuten met incubatie-oplossing bij RT.
• Incubeer met secundaire antilichaam (geit anti-muis Cy3, Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc 155-165-003) verdund 1:500 in incubatie-oplossing gedurende 2 uur bijRT.
• Was 3 x 30 minuten met PBT.

Deel 3: Plastic inbedding met JB-4

• Uitdrogen weefsels door middel van een ethanolreeks (50%, 75%, 95%, 100% x 2), 10 minuten per stap.
• Bereid de infiltratie-oplossing: 25 ml van JB-4 Embedding Oplossing A (Polysciences 0226A) en 0,24 g van de katalysator (Polysciences 02618). Het duurt een tijdje voor de katalysator te ontbinden, ongeveer 20-30 minuten. De oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C tot 1 maand.
• Giet af van de 100% ethanol en te vervangen door plastic infiltratie-oplossing. Plaats de vaatjes een 4 ° C op een rotator en laat infiltratie door te gaan totdat de larven zinken naar de bodem van de glazen flacon. Dit proces duurt meestal ongeveer 30 minuten.
• Inbedding protocol: Plaats de kunststof spuitgieten plateau (Polysciences, Inc 16643A) onder een dissectie microscoop. Overdracht van de larven, samen met de infiltratie oplossing om te dekken, in de kopjes. De kunststof inbedding media wordt bereid in een klein plastic buisje. We normaal gesproken embed 4-5 vissen in een tijd, een vis voor elke cup. Bereid 5-6 ml van de inbedding van plastic (1,2 ml van de inbedding oplossing voor elke cup) het toevoegen van 35 pi van JB-4 Embedding Oplossing "B" (Polysciences Inc 0226B) voor elke ml van infiltratie oplossing. Voeg 35 ul van JB-4 Embedding Oplossing "B" (Polysciences Inc 0226B) voor elke ml van infiltratie oplossing. Meng goed, en neer te pipetteren met een plastic Pasteur pipet enkele malen. Dit is belangrijk omdat zo niet goed gemengd de JB-4 niet goed polymeriseren. Na 5 ml verankering plastic is opgesteld, verwijder dan infiltratie plastic uit de hele monsters met een Pasteur pipet. Vul de beker met inbedding plastic. Het plastic moet uit slijk van de beker, een goede hechting van het blok houder met het model te garanderen. Voor het detecteren van zebravissen niertubuli, dwarse doorsneden zijn de beste. Voor dit doel, de vissen verticaal zijn ingebed, hoofd naar beneden. Met behulp van een wimper met handvat of fijne tang, periodiek verticale positie van de vis, totdat het plastic is hard genoeg dat ze niet verhuizen van hun positie. Het duurt ongeveer 20-30 minuten. Plaats vervolgens de EBH-2 Block Holder (Polysciences Inc 15.899) over de kopjes en laat de lade bij 4 ° C gedurende de nacht. Wanneer polymerisatie in voltooid, kunt u pop out de blokken zoals ijsblokjes.
• Alternatief inbedding protocol voor meerdere larven: Vul vormen de helft met volledige JB-4 en laat het polymeriseren. Voor de 15 mm vierkante mallen maken we gebruik van de JB-4 volume 700μl de matrijs halverwege te vullen. Voeg vervolgens de JB-4 gedrenkt larven met verharder aan de pre-gepolymeriseerde half gevulde mallen. Oriënteren de larven met het hoofd gericht naar de lange zijde van de mal en lijn de larven, zodat de oogbollen line-up (u kunt 10 vissen in een enkele vorm in een lijn). Nadat het blok wordt gepolymeriseerd je kunt knippen het blok randen, draai het zo de kant naar het mes en superlijm aan een plastic "Chuck", dat past in de microtoom. Met deze methode kun je de positie van een groot aantal larven in hetzelfde blok, in het midden van het plastic, en klaar voor doorsneden. Zorg moet worden genomen oriënteren van de blok aan het mes, zodat equivalent secties van elke vis worden genomen in een enkele sectie. Dit kan worden bereikt, terwijl het snijden door de ogen: dat wil zeggen oriënteren het blok, zodat equivalent delen van de ogen worden genomen voor elke vis. Het eindresultaat is dat je veel vis tegelijk te analyseren op een enkele microscoopglaasje.

Deel 4: Sectioning

• Zet het preparaat in de klauw houder van het microtoom (we gebruiken een Shandon Finesse Thermo Electro Corporation microtoom)
• Zet de schuif warmer tot 45 ° C.
• Giet DI-water in een bekerglas en plaats deze dicht bij de microtoom
• Voor snijden, moet u het blok is gericht, zoals voor een perfecte dwarse doorsneden van de vis te verkrijgen. De oriëntatie hoofd aanpassing hefbomen kan worden gedraaid zodat het model kop positie nauwkeurig op het mes. Begint te zagen dikke secties door de kop van de vis. Terwijl het snijden door de ogen, oriënteer het blok, zodat equivalent delen van de ogen worden genomen voor elke vis. Wanneer de borstvinnen verschijnen in de secties, dat is wanneer het pronephric tubuli te starten. Vanaf dit punt, knippen ongeveer 32 4 um secties van het blok.
• Verzamel de secties met een tang en laat ze vallen in het bekerglas met water, zonder het aanraken van het water met de tang. De sectie zal zo snel groeien als het hits van de oppervlakte van het water, nu kun je afhalen op een dia. Plaats de dia in het water bij een hoek van 45 ° en aanpak van het gedeelte met de hulp van een wimper met handvat, het aanraken van alleen de grenzen van de sectie.
• Incubeer de glaasjes op een dia warmere tot het volledig droog is.
• Delen van een afbeelding met behulp van epifluorescerende of confocale microscopie.

Deel 5: Vertegenwoordiger ResULT

Wanneer deze wordt uitgevoerd correct, ingespoten vissen verschijnen zoals in figuur 1, met weinig fluorescerende dextran (in dit geval Lucifer geel) zichtbaar in het hart en in de bloedsomloop. Als de injectie is te diep, kan geïnjecteerde materiaal te zien is geconcentreerd in de dooierzak, of het hart kan worden doorgeprikt waardoor overmatig bloeden. Als de holding pipet correct is gemaakt, zal de vis niet rollen of te verplaatsen als het wordt ingespoten, en dit zal een meer nauwkeurige injectie toe te staan. Ook is het belangrijk om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de MMP, dat zou de reactietijd vertragen en verminderen de precisie van het systeem. In het algemeen, als gevolg van gentamicine nefrotoxiciteit, 80% van de geïnjecteerde vissen ontwikkelen pericardiale oedeem (afb. 2). We maken gebruik van een fenotype gebaseerd classificatiesysteem, waarin de vis met een matige oedeem tonen duidelijk pericardiale oedeem, maar geen andere waarneembare fenotypes, terwijl ernstig oedemateuze vis zien pericardiale en romp oedeem, met een lichte tot matige as kromming. Met behulp van een nierkanaal antilichaam tegen Na ⁺ / K ⁺ ATPase (α-6F) kunnen we visualiseren het beschadigde tubuli in dwarsdoorsneden, met een duidelijke verlies van cel polariteit en tubulaire verstoring in beschadigde tubuli in vergelijking met controles (afb. 3). Dit patroon is consistent in de verschillende dwarsprofielen. Voor het verkrijgen van een perfecte dwarse doorsneden van de renale tubuli is belangrijk om de vissen de juiste positie tijdens het inbedden. Bij het vergelijken van afdelingen, zijn borstvinnen en de proximale tubuli ingewikkelde gebruikt als anatomische markers.

Figuur 1. Nephrotoxin micro-injectie. (A) Succesvolle injectie van een 10kDa dextran geconjugeerd aan lucifer geel, met vage uitdrukking in de gemeenschappelijke kardinaal ader, witte pijl. (B) Onjuist injectie, wat resulteert in een borg van 10kDa dextran geconjugeerd aan Lucifer geel die niet verdwijnen in de bloedsomloop, rode pijl.

Figuur 2. Gentamicine-gemedieerde oedeem. (A) Controle ingespoten larven zebravis. Gentamicine geïnjecteerd larvale zebravis met (B) matig of (C) ernstig oedeem. Alle larven zijn op 4 DPF met anterior naar links en dorsale om is. Zwarte pijlen wijzen naar pericardiale oedeem in B en C.

Figuur 3. AKI immunohistochemie. α-6F antilichaam kleuring voor Na ⁺ / K ⁺ ATPase 48 uur-post gentamicine-injectie (4 DPF larven) in controle (A, B) en gentamicine geïnjecteerd (C, D) larven. A, C, een vergroting van 20x en van B en D zijn 3X digitale vergrotingen van het recht tubuli in A en C. Let op het verlies van basolaterale polariteit en tubulus verstoring, witte pijl, in D ten opzichte van B.

Discussion

In deze video artikel hebben we laten zien een intraveneuze micro-injectie techniek voor een AKI-model, door het creëren van gentamicine gemedieerde proximale tubulaire schade in de zebravis larven. Deze schade resulteert in de vorming van de pericardiale en / of grove oedeem, als gevolg van een onvermogen om de vochtbalans te reguleren. We hebben ook beschreef een immunohistochemie experiment met een antilichaam dat gedifferentieerde nier tubuli (Majumdar et al.. 2000) merken, met verlies van cel polariteit en een verstoring van de proximale tubulus in beschadigde nieren. Intraveneuze micro-injecties vormen een efficiënte methode voor het leveren van een oplosbare stof in de bloedbaan van de zebravis larven. Deze techniek is een uitstekend hulpmiddel voor de invoering van een verscheidenheid aan stoffen en met behulp van een fluorescerende marker uniform injecties kunnen worden vele malen herhaald op waardoor consistente resultaten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
α6F mouse monoclonal	Developmental Studies Hybridoma Bank
Block Holder EBH-2	Polysciences, Inc.	15899
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100-6
Capillary tubes R-6 Custom Glass Tubing	Drummond Scientific	9-000-3000
Catalyst Powder	Polysciences, Inc.	02618
Cy3	Jackson ImmunoResearch	155-165-003
Dextran 10k Lucifer yellow, lysine fixable	Molecular Probes, Life Technologies	D1825
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Eyelash	Ted Pella, Inc.	113
Gentamicin sulfate	Sigma-Aldrich	G8648
Glass vials 4ml	Weathon	225012
Iron plate	Narishige International	IP
JB-4 Embedding Solution A	Polysciences, Inc.	0226A
JB-4 Embedding Solution B	Polysciences, Inc.	0226B
Joystick micromanipulator	Narishige International	MN 151
Magnetic stand	Narishige International	MN-151
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments, Inc.
Microinjection apparatus	World Precision Instruments, Inc.	PV820
Micromanipulator	World Precision Instruments, Inc.	M3301R
Microtome	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Shandon Finesse
Mineral oil, light	Fisher Scientific	0121-1
Pipette puller	Kopf Instruments	720
Plastic molding cup tray	Polysciences, Inc.	16643A
Razor blade	VWR international	55411-050
Slide warmer	Labline Instruments
Stage micrometer	WARD’s Natural Science	94 W 9910
Tilting base	World Precision Instruments, Inc.	TB 1
Tricaine powder	Sigma-Aldrich	A-5040
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949
Microscope	Leica Microsystems	S6F	Dissecting microscope
Microscope	Leica Microsystems	M205FA	Fluorescent microscope