Intravenöse Mikroinjektionen mit Zebrabärblingembryonen zu Acute Kidney Injury Study

Summary

Wir beschreiben eine Technik der Mikroinjektion der Aminoglykosid, Gentamicin, in 2 Tagen nach fetilization (dpf) Zebrafischlarven zu akutem Nierenversagen (AKI) zu induzieren. Wir beschreiben ein Verfahren zur whole mount Immunhistochemie, Kunststoff eingebettet und Schnitte mit Zebrabärblingembryonen der AKI-vermittelten Schaden zu visualisieren.

Abstract

In diesem Video-Artikel beschreiben wir ein Zebrafisch-Modell der AKI mit Gentamicin als nephrotoxicant. Die Technik besteht aus intravenösen microinjections auf 2 dpf Zebrafisch. Diese Technik stellt eine effiziente und schnelle Methode, um lösliche Stoffe in die Blutbahn des Zebrafisch-Larven liefern, so dass für die Injektion von 15-20 Fische pro Stunde. Neben AKI Studien kann diese Mikroinjektionstechnik auch für andere Arten von experimentellen Studien, wie der Angiographie verwendet werden. Wir bieten Ihnen ein detailliertes Protokoll der Technik von Geräten benötigt, um visuelle Maßnahmen verringerte Nierenfunktion. Darüber hinaus haben wir auch zeigen, den Prozess der Fixierung, whole mount Immunhistochemie mit einem Nierenkanälchen Marker-, Kunststoff-Einbettung und Schneiden der Larven Zebrafisch. Wir zeigen, dass Zebrafischlarven mit Gentamicin injiziert zeigen morphologischen Merkmalen im Einklang mit AKI: Ödeme, Verlust von Zellpolarität in proximalen tubulären Epithelzellen und morphologischen Störungen des Röhrchens.

Protocol

Ein Teil der folgenden Protokoll basiert auf den veröffentlichten Methoden (Hentschel et al. 2005) und (Weinstein et al. 1995) mit leichten Modifikationen berichtet wurden.

Teil 1: Mikroinjektionen

Richten Sie im Voraus für die Mikroinjektion

• Die Fische werden an 2 Tagen nach der Befruchtung (dpf) injiziert. Daher sind erwachsene Zebrafisch 3 Nächte vor einer geplanten Experiment gezüchtet. Sammeln Embryonen und legen Sie sie in einer Petrischale mit Wasser E3 (5mm NaCl, 0,17 mm KCL, 0,33 mm CaCl _2, 0,33 mm MgSO ₄₎ bei 28,5 ° C. Am Ende des ersten Tages entfernen abgestorbene Embryonen aus der Petrischale und getrennte Embryonen, so dass es 8-10 Embryonen pro Petrischale sind.
• Bereiten Sie die Glasnadeln Ziehen von Kapillaren (4 cm in der Länge, 0,63 / 0,20 OD / ID Millimeter (mm) R-6 Benutzerdefinierte Rohrglas Drummond Scientific Company, Broomall, PA 9-000-3000) mit einer Elektrode Abzieher. Die Spitze Durchmesser sollte von 10-20 mu m liegen. Unter einem Binokular (Leica S6E), mit einem Permanent-Marker ziehen etwa 10 1mm Linien entlang der Nadel, mit der Hilfe eines Herrschers, und speichern Sie die Nadeln in einer großen Petrischale auf Ton Rampen.
• Bereiten Sie die Haltepipette: Fire-polish der Spitze eines dünnwandigen Borosilikatglas Kapillarrohr (152 mm, 1 / 0,75 OD / ID mm TW100-6, World Precision Instruments, Inc.) in einer Bunsenbrennerflamme, bis der innere Durchmesser die Spitze ist 0,4-0,5 mm. Solche Dimension ermöglicht eine gute Griffigkeit der Dottersack eines 2 dpf Zebrafisch-Larven. Halten Sie das eine Ende eines Stückes Glaskapillare mit langen Zangen und Wärme das Gegenteil Spitze mit der Kapillare mit dem Bunsenbrenner, indem sie senkrecht über dem hellblauen Innenkonus der Flamme, die heißesten, für 1-2 Sekunden, Rollen sie zur Erlangung einer sogar schmelzen. Wiederholen Sie dies einige Male untersuchen Sie anschließend die Kapillare unter dem Mikroskop, auf einer Bühne Mikrometer (Ward 94 W 9910). Dies ist ein kritischer Schritt, könnte es notwendig sein, Feuer-polish ein paar Holding Pipetten und wählen Sie die entsprechende Größe später, während Sie die Manipulation der Larven. Wenn Sie vorsichtig sind, dauert eine Haltepipette für mehrere Mikroinjektion Sitzungen.
• Füllen Sie das Handbuch Mikroliterspritze Pump (MMP, World Precision Instruments, Inc.,) mit Mineralöl, nach den Anweisungen des Herstellers. Der Pipettenhalter ist in einem Joystick Manipulator (Narishige, MN-151), mit einem magnetischen Standfuß (Narishige, MN 151) auf einer Eisenplatte (Narishige, IP) verbunden eingefügt.

Mikroinjektion

• Bereiten 20 &mgr; l der Injektion Mischung:. 2.4μl Gentamicin (Sigma-Aldrich G8648, 50mg/ml in Kochsalzlösung) und 17.6μl 10-kDa Lucifer Yellow Dextran (Invitrogen D1825, (1mg/ml in Kochsalzlösung) In der Kontrollgruppe Fisch die Gentamicin ist mit Kochsalzlösung ersetzt. Die fluoreszierenden Dextran (viele verschiedene Farben verwendet werden kann) ist ausreichend, um die Genauigkeit der Injektion zu überprüfen und wählen Larven, die mit dem nephrotoxicant injiziert wurden.
• Werden 2 30mm Petrischalen mit 2 ml Mineralöl für die Platzierung der Injektion Mischung und Kontrolle Mischung unter, um ein Verdampfen der Lösungen zu verhindern.
• Bereiten Sie die Narkose: 400 mg Tricaine Pulver (Ethyl-m-Aminobenzoesäure Methansulfonat SIGMA A-5040) 97,7 ml DD-Wasser, 2,1 ml 1M Tris (pH 9). Passen Sie auf pH 7. Bewahren Sie diese Stammlösung in die Tiefkühltruhe, in Aliquots von 4,2 ml. Zur Nutzung Tricaine als Anästhetikum verdünnen 4,2 ml Tricaine Stammlösung in 100 ml Wasser E3 (Westerfield 1993) und lassen bei Raumtemperatur.

Die folgenden Schritte sind unter einem Binokular durchgeführt

• Entfernen Sie alle verbleibenden Chorion mit feinen Pinzetten und betäuben das Zebrafisch-Übertragung sie in einer Petrischale mit Tricaine erwärmt bei Raumtemperatur. Zebrafische sollten Tricaine mindestens 15 Minuten vor Beginn der microinjections ausgesetzt werden.
• Öffnen Sie die Spitze der Injektionsnadel mit einer Rasierklinge (VWR Scientific 55411-050). Halten Sie die Klinge in einem leichten Winkel zu einer Fase erstellen und schneiden Sie die Spitze wie ein Trinkgeld Öffnung von ca. 10-20 um Durchmesser zu erhalten.
• Schalten Sie die Stromversorgung, Vakuum-und Luftversorgung der Mikroinjektion Geräten (World Precision Instruments Inc., PV820 pneumatische picopump). Legen Sie die Nadel in den Nadelhalter am Mikromanipulator und Kippen Basis (Word Precision Instruments, Inc., Model M3301R, TB-1) montiert.
• Zum Füllen der Kanüle einen Tropfen (10 &mgr; l) der Lösung in der 30mm-Petrischale mit Mineralöl (Fisher Chemicals, 0121-1) gefüllt injiziert werden. Drehen Sie den manuellen Mikromanipulator so tauchen die Spitze der Nadel in den Tropfen Lösung, stellen Sie die picopump "hold / vent"-Schalter auf "vent" ("vent" entspricht auf der PV820 Vakuum), und füllen Sie die Nadel durch Ziehen Lösung in der Nadelspitze. Das dauert ein paar Minuten, wenn die Lösung wird in die Nadel zu schnell,das bedeutet, dass der Durchmesser der Spitze zu groß ist, und die Injektionen nicht genau. Nachdem die Nadel gefüllt ist, stellen Sie die picopump auf "hold" ("hold" entspricht auf der PV820 injizieren).
• Zur Kalibrierung der Nadel, setzen Sie die picopump "gated / timed"-Schalter auf "gated", drücken Sie das Fußpedal, um die Nadel Entlastung, und notieren Sie die Zeit, die (in Sekunden) für den Meniskus, um von einer Markierung zur nächsten (1 Reise mm Gesamtlänge). Wiederholen Sie die 3-fache, nehmen Sie die durchschnittliche Zeit (in Sekunden), und teilen Sie den Wert von 30 (Volumen in Nanoliter (nl) entsprechend 1 mm Luftlinie), um die Anzahl der Millisekunden benötigt, um 1 nl Lösung liefern zu bestimmen. Stellen Sie den Bereich Zeit-Knopf, um diese Zahl, und verschieben Sie die "gated / timed"-Schalter auf "getimte". Nun ist die picopump ist auf einen 1NL Puls der Lösung zu liefern.
• Entfernen Sie die Mineralöl-Schüssel und die Position der Petrischale mit den Larven unter dem Mikroskop. Gruppe der Fisch in der Mitte der Petrischale und Fokus.
• Legen Sie die Haltepipette im Handbuch Mikrospritze Pumpe (MMP, World Precision Instruments) auf der gegenüberliegenden Seite des Mikroinjektor verschaffen, ihre Spitze auf die Petrischale, und in die Fokusebene des Mikroskops. Bend it mit einem ziemlich flachen Winkel, so dass die Spitze der Haltepipette berührt den Boden der Petrischale und liegt in der Nähe horizontal. Stellen Sie sicher, keiner Luftblase im System haben, was die Reaktionszeit verlangsamen und verringern die Genauigkeit der MMP.
• Wechseln Sie zu einem höheren Vergrößerung unter dem Mikroskop und mit einem superfeinen Wimpern mit Griff (Ted Pella 113) auf die Fischlarven Dorsalseite Position nach unten mit dem Eigelb sehr auf die Haltepipette schließen. Halten Sie die Fischlarven durch Saugen das Eigelb in die Haltepipette durch Drehen gegen den Uhrzeigersinn die Mikrometerschraube Steuerung des manuellen Mikrospritze Pumpe. Achten Sie darauf, nicht auf den Mikrometer zu weit drehen, wie das Eigelb kann platzen, wenn gezogen zu tief in die Haltepipette. Konzentrieren Sie sich auf die Bildung von gemeinsamen Cardinalvene, die über den Dotter, direkt unterhalb des Periderm liegt und die Website von sehr hoher Durchblutung. Mit dem Mikromanipulator des Injektionsgeräts, führen Sie die Nadel in die Entwicklung gemeinsamer Cardinalvene. Es ist in der Regel notwendig, um die Nadel zurück ziehen ein wenig nach dem Einsetzen, wie die gemeinsame Cardinalvene ist sehr oberflächlich. Inject 1NL der Lösung, indem Sie das Fußpedal, dann die Larven aus den Haltepipette und senden es an Embryos Wasser. Dies ist ein kritischer Schritt, vor allem das erste Mal, weil es eine gewisse Übung in der Positionierung der Fische und die Steuerung der Saug-und Druckseite des Rigs benötigt. Wenn das Eigelb des Embryos ist richtig mit dem Haltepipette gehalten wird, wird er nicht wälzen, wenn die Nadel eindringt.
• Um zu überprüfen, den Erfolg der Mikroinjektion, überwachen die Anwesenheit des Lucifer Yellow Dextran im Herzen der Zebrafische können unter einem Fluoreszenzmikroskop. Der Luzifer-Gelb bleibt sichtbar in das Herz für ca. 20 Minuten vor dem Ableiten in das Kreislaufsystem Wenn die nephrotoxischen Lösung ist richtig, innerhalb von 2 Stunden nach der Injektion injiziert werden Sie sehen sehr wenig Lucifer Yellow Dextran übrigen an der Injektionsstelle. Wenn die Lösung in den Dottersack, ein Ort von Lucifer Yellow Dextran injiziert wird, wird an der Injektionsstelle zu bleiben. (Abb. 1). Bringen Sie den Fisch auf E3 Medium.
• Zwei Tage nach der Injektion, entwickeln sich die Larven pericardial Ödemen als Folge einer verminderten Nierenfunktion (Abb. 2).

Teil 2: Fixierung und Immunfluoreszenz mit Na ⁺ / K ^{+-ATPase-Antikörper} (α-6F)

• Bei 4 dpf, zwischen 10 und 15 Larven Zebrafisch in 4ml Glasfläschchen (Weathon, 225012) setzen und befestigen Sie sie in 1ml Dent (80% MeOH 20% DMSO) für 4 Stunden bei RT.
• Rehydrieren die Embryonen in einer abgestuften MeOH / PBT (PBS mit 0,5% Tween20) Serie, 75:25 50:50, 25:75, 100% PBT, Pipettieren der Lösung aus und fügen neue Lösung für das gleiche Fläschchen (1 ml Lösung pro Durchstechflasche), 20 Minuten in jeder Lösung. Larven sollten nie der Luft ausgesetzt sein, lassen Sie ein wenig Lösung für die Larven beim Wechsel Lösungen.
• Entfernen PBT und ersetzen 1ml mit Blocking-Lösung (PBS mit 1% DMSO, 0,5% Tween20, 10% normalem Ziegenserum) für 3 Stunden bei 4 ° C auf einem Kolbenpendel.
• Übertragen Sie die Larven in einem 2ml Mikrozentrifuge. Entfernen Blockierserum und ersetzen mit 300μl Primärantikörper in Inkubationslösung (PBS mit 1% DMSO, 0,5% Tween20, 2% normalem Ziegenserum) über Nacht bei 4 ° C auf einem Kolbenpendel. Wir verwenden einen monoklonalen Na ⁺ / K ^{+-ATPase-Antikörper} (α-6F, Überstand, Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa) am 01.25 Verdünnung
• Entfernen Sie den primären Antikörper und Waschen 3 x 30 Minuten mit Inkubationslösung bei RT.
• Inkubieren mit sekundärem Antikörper (Ziege anti-Maus-Cy3, Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. 155-165-003) 1:500 verdünnt in Inkubationslösung für 2 Stunden beiRT.
• Wash 3 x 30 Minuten mit PBT.

Teil 3: Kunststoff-Einbettung mit JB-4

• Entwässern Gewebe durch ein abgestuftes Ethanol-Reihe (50%, 75%, 95%, 100% x 2), 10 Minuten pro Schritt.
• Bereiten Sie die Infiltration Lösung: 25 ml JB-4 Embedding Lösung A (Polysciences 0226A) und 0.24g des Katalysators (Polysciences 02618). Es dauert eine Weile für den Katalysator zu lösen, etwa 20-30 Minuten. Die Lösung kann bei 4 ° C gelagert werden bis zu 1 Monat.
• Dekantieren von der 100% Ethanol und ersetzen mit Kunststoff-Infiltration Lösung. Legen Sie die Fläschchen ein 4 ° C auf einem Rotator und ermöglichen Infiltration bis die Larven sinken auf den Boden der Glasflasche vor. Dieser Prozess dauert etwa 30 Minuten.
• Embedding-Protokoll: Legen Sie die Kunststoffspritzerei Tassenrost (Polysciences, Inc. 16643A) unter einem Binokular. Übertragen Sie die Larven, zusammen mit Infiltration Lösung zu decken, in die Tassen. Die Kunststoff-Einbettung von Medien in einem kleinen Plastikschlauch vorbereitet. Wir normalerweise einbetten 4-5 Fische auf einmal, einen Fisch für jede Tasse. Bereiten Sie 5-6 ml der Einbettung Kunststoff (1,2 ml der Einbettung Lösung für jede Tasse) Zugabe von 35 ul von JB-4 Embedding-Lösung "B" (Polysciences Inc. 0226B) für jeden ml der Infiltration Lösung. Add 35 ul JB-4 Embedding-Lösung "B" (Polysciences Inc. 0226B) für jeden ml der Infiltration Lösung. Gut mischen, und Abpipettieren mit einer Kunststoff-Pasteurpipette mehrmals. Dies ist wichtig, denn wenn nicht gut gemischt die JB-4 wird nicht richtig polymerisieren. Nach 5ml der Einbettung Kunststoff hergestellt worden ist, zu entfernen Infiltration Kunststoff aus aller Proben mit einer Pasteurpipette. Füllen Sie den Becher mit Einbettung Kunststoff. Der Kunststoff muss Schlamm aus der Tasse, um eine gute Befestigung der Blockhalter auf die Probe zu gewährleisten. Um festzustellen, Zebrafisch Nierentubuli sind Querschnitte der beste. Zu diesem Zweck den Fisch vertikal eingebettet sind, mit gesenktem Kopf. Mit Hilfe der Wimper mit Griff oder feinen Pinzette, in regelmäßigen Abständen Position der Fische vertikal, bis der Kunststoff ist hart genug, dass sie nicht von ihrer Position zu bewegen. Es dauert etwa 20-30 Minuten. Legen Sie dann die EBH-2 Block Halter (Polysciences Inc. 15899) über die Tassen und lassen Sie das Fach bei 4 ° C über Nacht. Wenn die Polymerisation in abgeschlossen haben, können Sie Pop aus den Blöcken wie Eiswürfel.
• Alternative Einbettung Protokoll für mehrere Larven: Fill Formen zur Hälfte mit kompletten JB-4 und lassen Sie es zu polymerisieren. Für die 15 mm im Quadrat Formen verwenden wir die JB-4 Volumen bei 700μl an der Form halber Strecke zu füllen. Anschließend fügen Sie den JB-4 getränkt Larven mit Härter zur vorpolymerisierte halb gefüllten Formen. Orient die Larven mit dem Kopf in Richtung des langen Seite der Form und Ausrichtung der Larven so die Augäpfel Line-Up (Sie können 10 Fische in einem Guss in eine Linie gestellt). Nach dem Block polymerisiert können Sie schneiden den Block Kanten, so drehen die Seite nach dem Messer und Sekundenkleber es zu einer plastischen "Chuck", die in das Mikrotom passt. Mit dieser Methode können Sie Position eine große Anzahl von Larven im gleichen Block, in der Kunststoff-zentriert, und bereit für Querschnitte. Ist darauf zu achten Ausrichtung der Block mit dem Messer, so dass entsprechende Abschnitte der einzelnen Fisch in einem einzigen Abschnitt getroffen werden. Dies kann beim Schneiden durch die Augen werden: dh Ausrichtung der Block, so dass entsprechende Abschnitte der Augen für jeden Fisch getroffen werden. Das Endergebnis ist, dass man viele Fische gleichzeitig zu analysieren auf einem einzigen Objektträger.

Teil 4: Schnitte

• Stellen Sie die Probe in das Futter Inhaber des Mikrotoms (wir verwenden eine Shandon Finesse Thermo Electro Inc. Mikrotom)
• Stellen Sie den Schiebeschalter wärmer bis 45 ° C.
• Gießen DI-Wasser in ein Becherglas und stellen Sie es auf das Mikrotom in der Nähe
• Vor Schneiden darauf, dass der Block wie orientiert sich an perfekten Querschnitt des Fisches zu erhalten. Die Orientierung Kopf Verstellhebel kann gedreht ermöglicht, die Probe Kopfhaltung genau auf das Messer sein. Fang an zu schneiden dicke Schnitte durch den Kopf des Fisches. Während Schnitte durch die Augen, orientieren den Block, so dass entsprechende Abschnitte der Augen sind für jeden Fisch entnommen. Wenn die Brustflossen in die Abschnitte angezeigt werden, ist, dass, wenn die pronephric Tubuli beginnen. Ab diesem Zeitpunkt etwa 32 4 um Abschnitte aus dem Block geschnitten.
• Sammeln Sie die Abschnitte mit einer Pinzette und lassen Sie sie in das Becherglas mit Wasser löschen, ohne sie zu berühren das Wasser mit der Zange. Der Abschnitt wird so schnell expandieren, da sie die Oberfläche des Wassers trifft, jetzt können Sie es auf einer Folie zu sammeln. Legen Sie die Folie in das Wasser in einem 45 ° Winkel und nähern sich der Abschnitt mit Hilfe der Wimper mit Griff, berühren nur die Grenzen des Abschnitts.
• Inkubieren Sie die Dias auf einer Folie wärmer, bis sie vollständig trocken sein.
• Bildausschnitte mit epifluoreszenten oder konfokalen Mikroskopie.

Teil 5: Repräsentative Resultate

Wenn richtig ausgeführt, erscheinen injiziert Fische wie in Abbildung 1, mit wenig fluoreszierenden Dextran (in diesem Fall Lucifer Yellow) sichtbar in das Herz und in den Blutkreislauf. Wenn die Injektion zu tief ist, kann injizierten Materials gesehen konzentriert in den Dottersack, oder das Herz durchstochen verursacht starke Blutungen werden. Wenn die Haltepipette richtig gemacht wird, wird der Fisch nicht rollen oder zu verschieben, wenn sie injiziert, und dies wird eine genauere Injektion zu ermöglichen. Auch ist es wichtig, sicherzustellen, dass keine Luftblasen in der MMP haben, was die Reaktionszeit verlangsamen und verringern die Genauigkeit des Systems. Im Allgemeinen als Folge der Gentamicin Nephrotoxizität, entwickeln 80% der injizierten Fische pericardial Ödem (Abb. 2). Wir verwenden einen Phänotyp Klassifikationssystem, in dem die Fische mit Ödeme evident pericardial Ödeme zeigen, aber keine anderen beobachtbaren Phänotyp, während stark ödematösen Fisch Perikarderguss und Rumpf Ödeme zeigen, mit leichten bis moderaten Achse Krümmung. Mit einem Nierenkanälchen Antikörper gegen Na ⁺ / K ^+-ATPase (α-6F) können wir die beschädigten Röhren in Querschnitten sichtbar zu machen, mit einem offensichtlichen Verlust von Zellpolarität und tubuläre Störung beschädigt Tubuli als die Kontrollen (Abb. 3) verglichen. Dieses Muster stimmt über mehrere Querschnitte. Um eine einwandfreie Querschnitte der Nierentubuli zu erhalten ist wichtig, um die Fische richtig zu positionieren während der Einbettung. Beim Vergleich Abschnitten werden Brustflossen und proximalen gewundenen Kanälchen als anatomische Marker verwendet.

Abbildung 1. Nephrotoxin Mikroinjektion. (A) Erfolgreiche Injektion eines 10kDa Dextran konjugiert lucifer gelb, mit schwachen Ausdruck in der gemeinsamen Cardinalvene, weißen Pfeil. (B) Falsche Injektion, was zu einer Anzahlung in Höhe von 10kDa Dextran konjugiert Lucifer Yellow, die nicht in das Kreislaufsystem, roter Pfeil verfliegt.

Abbildung 2. Gentamicin-vermittelte Ödem. (A) Control Larven Zebrafisch injiziert. Gentamicin injiziert Larven Zebrafisch mit (B) moderate oder (C) schwere Ödeme. Alle Larven sind bei 4 dpf mit anteriorer nach links und dorsal wird. Schwarze Pfeile zeigen auf pericardial Ödeme in B und C.

Abbildung 3. AKI Immunhistochemie. α-6F Antikörper-Färbung für Na ⁺ / K ^+-ATPase 48 Stunden-post Gentamicin Injektion (4 dpf Larven) in Kontrolle (A, B) und Gentamicin injiziert (C, D) Larven. A, C bei 20-facher Vergrößerung und der B-und D sind 3X digitale Vergrößerungen des rechten Kanälchen in A und C. Hinweis Verlust der basolateralen Polarität und Tubulus Störung, weißen Pfeil in D im Vergleich zu B.

Discussion

In diesem Video-Beitrag haben wir gezeigt, eine intravenöse Mikroinjektionstechnik für eine AKI-Modell, durch die Schaffung von Gentamicin vermittelten proximal tubuläre Schädigung in Zebrafisch-Larven. Dieser Schaden führt zur Bildung von Herzbeutel und / oder grober Ödeme, was die Unfähigkeit, Wasser zu regulieren. Wir beschrieben eine immunhistochemische Experiment mit einem Antikörper, differenziert Nierentubuli (Majumdar et al. 2000) markiert, zeigt Verlust der Zellpolarität und eine Störung des proximalen Tubulus in geschädigten Nieren. Intravenöse microinjections stellen eine effiziente Methode für die Bereitstellung einer löslichen Substanz in den Blutkreislauf des Zebrafisch-Larven. Diese Technik ist ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Einführung einer Vielzahl von Stoffen und mit Hilfe eines fluoreszierenden Marker einheitliche Injektionen können ein Vielfaches so für konsistente Ergebnisse wiederholt werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
α6F mouse monoclonal	Developmental Studies Hybridoma Bank
Block Holder EBH-2	Polysciences, Inc.	15899
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100-6
Capillary tubes R-6 Custom Glass Tubing	Drummond Scientific	9-000-3000
Catalyst Powder	Polysciences, Inc.	02618
Cy3	Jackson ImmunoResearch	155-165-003
Dextran 10k Lucifer yellow, lysine fixable	Molecular Probes, Life Technologies	D1825
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Eyelash	Ted Pella, Inc.	113
Gentamicin sulfate	Sigma-Aldrich	G8648
Glass vials 4ml	Weathon	225012
Iron plate	Narishige International	IP
JB-4 Embedding Solution A	Polysciences, Inc.	0226A
JB-4 Embedding Solution B	Polysciences, Inc.	0226B
Joystick micromanipulator	Narishige International	MN 151
Magnetic stand	Narishige International	MN-151
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments, Inc.
Microinjection apparatus	World Precision Instruments, Inc.	PV820
Micromanipulator	World Precision Instruments, Inc.	M3301R
Microtome	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Shandon Finesse
Mineral oil, light	Fisher Scientific	0121-1
Pipette puller	Kopf Instruments	720
Plastic molding cup tray	Polysciences, Inc.	16643A
Razor blade	VWR international	55411-050
Slide warmer	Labline Instruments
Stage micrometer	WARD’s Natural Science	94 W 9910
Tilting base	World Precision Instruments, Inc.	TB 1
Tricaine powder	Sigma-Aldrich	A-5040
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949
Microscope	Leica Microsystems	S6F	Dissecting microscope
Microscope	Leica Microsystems	M205FA	Fluorescent microscope