Intravenös Microinjections av Zebrafish Larver att studera akut njurskada

Summary

Vi beskriver en teknik för microinjecting aminoglykosid, gentamicin, i 2 dagar efter fetilization (DPF) zebrafisk larver att inducera akut njurskada (AKI). Vi beskriver en metod för hela berget immunohistokemi, plast inbäddning och snittning av zebrafisk larver att visualisera AKI medierad skador.

Abstract

I denna video artikeln beskriver vi en zebrafisk modell av AKI med gentamicin som nephrotoxicant. Tekniken består av intravenös microinjections den 2 DPF zebrafisk. Denna teknik är en effektiv och snabb metod för att leverera lösliga ämnen i blodet av zebrafisk larver, vilket möjliggör injektion av 15-20 fiskar per timme. Förutom AKI studier kan detta mikroinjektion tekniken också användas för andra typer av experimentella studier, såsom angiografi. Vi erbjuder ett detaljerat protokoll av tekniken från utrustning som krävs för att visuellt mått på nedsatt njurfunktion. Dessutom visar vi även processen med fixering, hela montera immunohistokemi med en njure tubuli markör, plast inbäddning och snittning av larver zebrafisk. Vi visar att zebrafisk larver injiceras med gentamicin visa morfologiska drag överensstämmer med AKI: ödem, förlust av cellens polaritet i proximala tubulära epitelceller, och morfologiska störningar i tubuli.

Protocol

En del av följande protokoll baseras på publicerad metoder rapporterades av (Hentschel et al. 2005) och (Weinstein et al. 1995) med smärre ändringar.

Del 1: Microinjections

Ställ in i förväg för mikroinjektion

• Fisken injiceras på två dagar efter befruktningen (DPF). Därför är vuxna zebrafisk uppfödda 3 nätter före en planerad experiment. Samla embryon och placera dem i en petriskål med E3 vatten (5mm NaCl, 0.17mM KCL, 0.33mM CaCl _2, 0.33mM MgSO ₄₎ vid 28,5 ° C. Vid slutet av den första dagen bort döda embryon från petriskålen och separat embryon så att det finns 80-100 embryon per petriskål.
• Förbered glaset nålar dra från kapillärrör (4 inches i längd, 0,63 / 0,20 OD / ID millimeter (mm) R-6 Custom glasrör Drummond vetenskapliga företag, Broomall, PA 9-000-3000) med en elektrod avdragare. Tipset diameter bör vara på 10-20 ìm. Enligt en dissekera mikroskop (Leica S6E), med en permanent markör dra ca 10 1mm linjer längs nålen, med hjälp av en linjal och lagra nålar i en stor petriskål på lera ramper.
• Förbered hålla pipetten: Fire-polish spetsen av en tunn borosilikatglas kapillärrör (152 mm, 1 / 0,75 OD / ID mm TW100-6, World Precision Instruments, Inc.) i en Bunsenbrännare lågan tills inner diameter spetsen är 0,4-0,5 mm. Sådana mått kan för bra grepp i gulesäcken med ett 2 DPF zebrafisk larver. Håll ena änden av en glasbit kapillär med långa tången och värm den motsatta spetsen med den kapillära med bunsenbrännare, placera den vertikalt över ljusblå inre konen av lågan, den varmaste delen, under 1-2 sekunder, rulla den för att få en ännu smälta. Upprepa detta några gånger sedan undersöka kapillära under mikroskop, på en scen mikrometer (Wards 94 W 9910). Detta är ett kritiskt steg, kan det vara nödvändigt att brand-polska några innehav pipetter och välj lämplig storlek senare, medan du manipulera larver. Om du är försiktig, varar ett innehav pipett för flera mikroinjektion sessioner.
• Fyll Manuell Mikrosprutor Pump (MMP, World precisionsinstrument, Inc.) med mineralolja, enligt instruktionerna från tillverkaren. Pipetten hållaren sitter i en joystick manipulator (Narishige, MN-151), i samband med en magnetisk monter (Narishige, MN 151) till en järnplåt (Narishige, IP).

Mikroinjektion

• Förbered 20μl av injektionen blandning:. 2.4μl gentamicin (Sigma-Aldrich G8648, 50mg/ml i koksaltlösning) och 17.6μl 10-kDa Lucifer gul dextran (Invitrogen D1825, (1mg/ml i koksaltlösning) i kontrollgruppen fisk gentamicin ersätts med koksaltlösning. Den fluorescerande dextran (många olika färger kan användas) är tillräcklig för att kontrollera riktigheten av injektionen och välj larver som injicerats med nephrotoxicant.
• Förbered två 30mm petriskålar med 2 ml mineralolja för att släppa ut injektion blandning och kontroll blandning som, för att förhindra avdunstning av lösningarna.
• Förbered bedövningsmedel: 400 mg tricaine pulver (etyl-m-aminobensoat methanesulfonate SIGMA A-5040) 97,7 ml DD vatten, 2,1 ml 1M Tris (pH 9). Justera till pH 7. Lagra denna stamlösning i frysen, i alikvoter av 4,2 ml. För att använda tricaine som bedövningsmedel späda 4,2 ml tricaine stamlösning i 100 ml E3 vatten (Westerfield 1993) och låt stå i rumstemperatur.

Följande steg utförs under en dissekera mikroskop

• Manuellt ta bort eventuella chorions kvar med fina pincett och Bedöva zebrafisk överföra dem i en petriskål med tricaine värmas i rumstemperatur. Zebrafisk bör utsättas för tricaine minst 15 minuter innan microinjections.
• Öppna toppen av kanylen med hjälp av ett rakblad (VWR vetenskapliga 55.411-050). Håll bladet på en liten vinkel för att skapa en avfasning och skär spetsen, såsom att få ett tips öppning på ca 10-20 mikroM diameter.
• Slå på strömmen, vakuum och luft leverans av mikroinjektion apparater (World precisionsinstrument Inc., PV820 pneumatiska picopump). Stick in nålen i nålen hållaren monterad på mikromanipulator och luta bas (Word Precision Instruments, Inc., Modell M3301R, TB-1).
• För att fylla nål och placera en droppe (10μl) av den lösning som ska injiceras i 30mm petriskål fylld med mineralolja (Fisher Chemicals, 0121-1). Vrid den manuella mikromanipulator så att dränka spetsen av nålen i droppe lösning, ställ in picopump "hålla / vent" läge "vent" ("vent" motsvarar vakuum på PV820) och fyll nålen genom att dra lösning genom nålspetsen. Detta kommer att ta några minuter, om lösningen kommer in nålen för fort,Det betyder att diametern på toppen är för stor, och injektioner kommer inte vara korrekt. När nålen är fylld, ställ picopump att "hålla" ("hold" motsvarar injicera på PV820).
• För att kalibrera nålen, ställ picopump "gated / tidsinställda" byta till "gated", tryck på pedalen att släppa nålen och registrera den tid det tar (sekunder) för menisken att resa från en markering till nästa (1 mm totala sträckan). Upprepa 3 gånger, tar den genomsnittliga tiden (i sekunder), och dividera värdet med 30 (volym i nanoliters (NL) motsvarande 1 mm linjär avstånd) för att fastställa antalet millisekunder som krävs för att leverera 1 NL lösning. Justera ratten intervallet perioden till detta nummer, och flytta "gated / tidsinställda" byta till "tidsinställda". Nu picopump är inställd på att leverera en 1nl puls lösning.
• Ta bort skålen mineralolja och placera petriskål med larver i mikroskop. Grupp fisken i mitten av petriskål och fokus.
• Placera hålla pipetten i manualen mikrosprutan pumpen (MMP, World precisionsinstrument) på motsatt sida av microinjector, avancera sin spets till petriskål, och in i planet för fokus i mikroskop. Böj den med en ganska flack vinkel, så att den yttersta spetsen av innehavet pipetten vidrör botten av petriskålen och nära horisontell. Se till att inte ha någon luftbubbla i systemet, vilket skulle bromsa svarstid och minskar precisionen i MMP.
• Byt till en högre förstoring på mikroskop och använda en superfin ögonfransar med handtag (Ted Pella 113) för att placera larver sidan fisken rygg ner med gulan mycket nära att hålla pipetten. Håll larver fisk genom att suga äggulan in i anläggningen pipetten genom att vrida moturs på mikrometer-enheten kontrollerar den manuella mikrosprutan pumpen. Se till att inte stänga av mikrometer för långt, eftersom äggulan kan spricka om det dras för djupt in i anläggningen pipetten. Fokusera på att bilda gemensamma kardinalen ven, som ligger över äggulan, precis under periderm och är platsen för mycket höga blodflödet. Med mikromanipulator av injektionen apparater, styra nålen i att utveckla gemensamma kardinalen ven. Det är oftast nödvändigt att dra nålen tillbaka lite efter insättningen, som gemensam kardinal ven är mycket ytlig. Injicera 1nl lösning genom att trycka på fotpedalen och släpp sedan larverna från anläggningen pipetten och returnera den till embryo vatten. Detta är ett kritiskt steg, speciellt första gången, eftersom det kräver en viss praxis vid placeringen av fisk och kontrollera sug-och tryck riggen. Om äggulan av embryot är korrekt hålls med innehavet pipett, kommer det rulla inte lika nålen går in.
• För att verifiera framgångarna med mikroinjektion, övervaka förekomsten av Lucifer gula dextran i hjärtat av zebrafisk under ett fluorescerande mikroskop. Lucifers gula förblir synlig i hjärtat i ca 20 minuter innan de upplöstes i cirkulationssystemet Om nefrotoxiska lösningen injiceras korrekt inom 2 timmar efter injektionen kommer du att se väldigt lite Lucifer gula dextran kvar på injektionsstället. Om lösningen injiceras i gulesäcken, en fläck av Lucifer gula dextran kommer att förbli vid injektionsstället. (Bild 1). Återgå fisken till E3 medium.
• Två dagar efter injektion, larverna utvecklas perikardiell ödem som en följd av nedsatt njurfunktion (Fig. 2).

Del 2: fixering och immunofluorescens med Na ⁺ / K ⁺ ATPas antikropp (α-6F)

• Vid 4 DPF, sätta mellan 10 och 15 larver zebrafisk i 4 ml glasflaskor (Weathon, 225.012) och fäst dem i 1 ml Dent: s (80% MeOH 20% DMSO) i 4 timmar vid RT.
• Rehydrera embryona i en graderad MeOH / PBT (PBS med 0,5% Tween20) serien, 75:25 50:50, 25:75, 100% PBT, pipettera lösningen ut och lägga till nya lösningen på samma flaskan (1 ml lösning per injektionsflaska), 20 minuter i varje lösning. Larver ska aldrig utsättas för luft, lämna en liten lösning som täcker larverna vid byte lösningar.
• Ta bort PBT och ersätt 1 ml med blockerande lösningen (PBS med 1% DMSO, 0,5% Tween20, 10% normala get serum) i 3 timmar vid 4 ° C på en nutator.
• Överför larver i en 2 ml mikrofugrör. Ta bort blockering serum och ersätt med 300μl primära antikroppen i ruvmaskinen lösning (PBS med 1% DMSO, 0,5% Tween20, 2% Normal get serum) över natten vid 4 ° C på en nutator. Vi använder en monoklonal Na ⁺ / K ⁺ ATPas antikropp (α-6F, supernatanten utvecklingsstudier Hybridoma Bank, Iowa) vid 1:25 utspädning
• Ta bort den primära antikroppen och tvätta 3 x 30 minuter med inkubering lösning på RT.
• Inkubera med sekundär antikropp (get-anti-mus cy3, Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. 155-165-003) utspädd 1:500 i inkubation lösning för 2 timmar vidRT.
• Tvätta 3 x 30 minuter med PBT.

Del 3: Plast bädda med JB-4

• Torka vävnader genom en graderad etanol serie (50%, 75%, 95%, 100% x 2), 10 minuter per steg.
• Förbered infiltration lösning: 25 ml JB-4 Bädda lösning A (Polysciences 0226A) och 0.24g katalysator (Polysciences 02.618). Det tar ett tag för katalysator för att lösa upp, ca 20-30 minuter. Lösningen kan lagras vid 4 ° C upp till 1 månad.
• Dekantera av 100% etanol och ersätta med plast infiltration lösning. Placera rören en 4 ° C på en rotator och låt infiltration fortsätta tills larverna sjunka till botten av glaset flaskan. Denna process tar vanligtvis cirka 30 minuter.
• Bädda protokoll: Placera plastgjutning kopp facket (Polysciences, Inc. 16643A) under en dissekera mikroskop. Överför larver, tillsammans med infiltration lösning för att täcka, i koppar. Plasten bädda media är upprättad i ett litet plaströr. Vi bädda normalt 4-5 fiskar åt gången, en fisk för varje kopp. Förbered 5-6 ml bädda plast (1,2 ml bädda lösning för varje kopp) lägga till 35 ìl av JB-4 Bädda lösning "B" (Polysciences Inc. 0226B) för varje ml av infiltration lösning. Tillsätt 35 ìl av JB-4 Bädda lösning "B" (Polysciences Inc. 0226B) för varje ml av infiltration lösning. Blanda väl, pipettera upp och ned med en plast pasteurpipett flera gånger. Detta är viktigt eftersom om den inte blandas väl JB-4 kommer inte att polymerisera ordentligt. Efter 5ml att bädda plasten har tagits fram, ta bort infiltration plast från runt prover med en pasteurpipett. Fyll koppen med inbäddning plast. Plasten ska sippra ut ur koppen, för att säkerställa god fastsättning av blocket innehavaren till provet. För att upptäcka zebrafisk njurtubuli, tvärgående delarna är de bästa. För detta ändamål är fisken inbäddade vertikalt huvudet ner. Med hjälp av en ögonfrans med handtag eller fin pincett, tidvis ställning fisken vertikalt, tills plasten är svårt nog att de inte flytta från sin position. Det tar ungefär 20-30 minuter. Sedan placerar EBH-2 Block Holder (Polysciences Inc. 15.899) över koppar och lämna facket vid 4 ° C över natten. När polymerisation helt, kan du hoppar ut blocken som isbitar.
• Alternativa bädda protokoll för flera larver: Fyll formar till hälften med fullständig JB-4 och låt det polymerisera. För 15 mm kvadratiska formar vi använder JB-4 volym på 700μl att fylla formen halvvägs. Lägg sedan JB-4 indränkt larver med härdare till pre-polymeriserade halvfylld formar. Orient larverna med huvudet pekande mot långsidan av mögel och anpassa larverna så ögonglober line up (du kan lägga 10 fiskar i en enda mögel i en rad). När blocket är polymeriserade kan du skära blocket kanterna, vrid den så är vänd kniven och superlim det till en plast "Chuck" som passar i mikrotomen. Med denna metod du kan placera ett stort antal larver i samma kvarter, centrerad i plast, och redo för tvärsnitt. Försiktighet måste tas orientera blocket till kniven så att motsvarande delar av varje fisk tas i ett enda avsnitt. Detta kan göras samtidigt sektionering genom ögonen: så att likvärdiga delar av ögon tas för varje fisk, dvs orientera blocket. Slutresultatet är att du kan analysera många fiskar samtidigt på en enda objektglas.

Del 4: Sektionering

• Ställ in prov i chucken innehavaren av mikrotom (vi använder en Shandon Finesse Thermo Electro Corporation mikrotom)
• Ställ in bilden varmare till 45 ° C.
• Häll DI-vatten i en bägare och placera den nära mikrotomen
• Före snittning, se blocket är inriktad som att få ett perfekt tvärgående delar av fisken. Inriktningen huvudet justeringen spakar kan vridas så att placera provet huvudet exakt till kniven. Starta skär tjocka sektioner genom huvudet på fisken. Medan sektionering genom ögonen, orientera blocket så att motsvarande avsnitt i ögonen tas för varje fisk. När bröstfenorna visas i sektioner, är att när pronephric tubuli början. Från denna punkt, skär ca 32 4 um avsnitt från blocket.
• Samla delar med pincett och låt dem falla i bägaren med vatten, utan att vidröra vattnet med pincett. Avsnittet kommer att expandera så fort den träffar vattenytan, nu kan du hämta den på en bild. Sätt in bilden i vattnet i 45 ° vinkel och förhållningssätt avsnittet med hjälp av en ögonfrans med handtag, röra endast gränser avsnitt.
• Inkubera glasen på en bild varmare tills den är helt torr.
• Bild sektioner med hjälp epifluorescent eller konfokalmikroskopi.

Del 5: Representant Results

När utförs korrekt, injiceras fisk visas som i figur 1, med lite fluorescerande dextran (i detta fall Lucifer gul) syns i hjärtat och i cirkulationssystemet. Om injektionen för djupt, kan injiceras materialet ses koncentreras i gulesäcken, eller hjärtat kan punkteras orsakar kraftig blödning. Om innehavet pipetten görs korrekt, kommer fisken rulla eller flytta när det injiceras, och detta kommer att möjliggöra en mer exakt injektion. Dessutom är det viktigt att se till att inte ha några luftbubblor i MMP, vilket skulle bromsa svarstid och minskar precisionen i systemet. Allmänhet, som en följd av gentamicin nefrotoxicitet, 80% av den injicerade fiskarna utveckla perikardiell ödem (Fig. 2). Vi använder en fenotyp baserad klassificeringssystemet, som fiskar med måttliga ödem visar tydligt perikardiell ödem men inga andra observerbara fenotyper, medan kraftigt ödematös fisk visar perikardiell och bål ödem, med lätt till måttlig axel krökning. Med hjälp av en renala tubuli antikropp mot Na ⁺ / K ⁺ ATPas (α-6F) kan vi visualisera den skadade tubuli i tvärgående sektioner, med en tydlig förlust av cellens polaritet och tubulär störningar i skadade tubuli jämfört med kontroller (Fig. 3). Detta mönster går genom flera tvärgående sektioner. För att få perfekt tvärgående delar av njurtubuli är viktigt att placera fisken på rätt sätt under inbäddning. När man jämför avsnitt, är bröstfenor och proximala invecklad tubuli används som anatomiska markörer.

Figur 1. Nefrotoxin mikroinjektion. (A) Framgångsrika injektion av en 10kDa dextran konjugerat till Lucifer gult, med svag uttryck i den gemensamma kardinalen ven, vita pilen. (B) felaktig injektion, vilket ger en insättning på 10kDa dextran konjugerat till Lucifer gula som inte försvinna i cirkulationssystemet, röd pil.

Figur 2. Gentamicin-medierad ödem. (A) Kontroll injiceras larver zebrafisk. Gentamicin injiceras larver sebrafisk med (B) måttlig eller (C) svåra ödem. Alla larver är på 4 DPF med främre till vänster och rygg är uppe. Svarta pilar pekar på perikardiell ödem i B och C.

Figur 3. AKI immunohistokemi. α-6F antikroppar färgning för Na ⁺ / K ⁺ ATPas 48 timmar-post gentamicin injektion (4 DPF larver) i kontroll (A, B) och gentamicin injiceras (C, D) larver. A, C är på 20X förstoring och B och D 3x digital förstoring av rätten tubuli i A och C. Notera förlust av basolateral polaritet och tubuli störningar, vita pilen, D jämfört med B.

Discussion

I denna video artikeln har vi visat en intravenös mikroinjektion teknik för en AKI modell, genom att skapa gentamicin medierad proximal tubulär skada i zebrafisk larver. Dessa skador resulterar i bildandet av perikardiell och / eller grov ödem, vilket avspeglar en oförmåga att reglera vattenbalansen. Vi beskrev också en immunohistokemi experiment med en antikropp som markerar differentierade njurtubuli (Majumdar et al. 2000), som visar förlust av cellens polaritet och en störning av den proximala tubuli i skadade njurar. Intravenös microinjections utgör en effektiv metod för att leverera ett lösligt ämne i blodet av zebrafisk larver. Denna teknik är ett utmärkt verktyg för införandet av en mängd olika ämnen och med hjälp av en fluorescerande injektioner markör enhetlig kan upprepas många gånger möjliggör konsekventa resultat.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
α6F mouse monoclonal	Developmental Studies Hybridoma Bank
Block Holder EBH-2	Polysciences, Inc.	15899
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100-6
Capillary tubes R-6 Custom Glass Tubing	Drummond Scientific	9-000-3000
Catalyst Powder	Polysciences, Inc.	02618
Cy3	Jackson ImmunoResearch	155-165-003
Dextran 10k Lucifer yellow, lysine fixable	Molecular Probes, Life Technologies	D1825
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Eyelash	Ted Pella, Inc.	113
Gentamicin sulfate	Sigma-Aldrich	G8648
Glass vials 4ml	Weathon	225012
Iron plate	Narishige International	IP
JB-4 Embedding Solution A	Polysciences, Inc.	0226A
JB-4 Embedding Solution B	Polysciences, Inc.	0226B
Joystick micromanipulator	Narishige International	MN 151
Magnetic stand	Narishige International	MN-151
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments, Inc.
Microinjection apparatus	World Precision Instruments, Inc.	PV820
Micromanipulator	World Precision Instruments, Inc.	M3301R
Microtome	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Shandon Finesse
Mineral oil, light	Fisher Scientific	0121-1
Pipette puller	Kopf Instruments	720
Plastic molding cup tray	Polysciences, Inc.	16643A
Razor blade	VWR international	55411-050
Slide warmer	Labline Instruments
Stage micrometer	WARD’s Natural Science	94 W 9910
Tilting base	World Precision Instruments, Inc.	TB 1
Tricaine powder	Sigma-Aldrich	A-5040
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949
Microscope	Leica Microsystems	S6F	Dissecting microscope
Microscope	Leica Microsystems	M205FA	Fluorescent microscope