Summary
우리는 설치류와 다양한 연령대의 비 인간 영장류의 뇌 조각의 뉴런에 같은 DiI 같은 형광 염료를, 소개하는 유전자 총을의 사용을 보여줍니다. 이 특정한 경우에, 우리는 성인 생쥐 (3-6개월 세) 및 성인 cynomologus 원숭이 (9-15년 이전)를 사용합니다. 원래 박사 Lichtman의 실험실에 의해 설명이 기술은 (간
Abstract
DiOLISTIC 얼룩은 뇌의 슬라이스 (.; 오브라이언과 러미스, 2007; 간 외, 2000. 간 외, 2009)의 뉴런에 같은 DiI 같은 형광 염료를 소개하는 유전자 총을 사용합니다. 여기서 우리는 기술을 설정할 때 도움이 될 것입니다 좋은 나쁜 결과의 모범적인 이미지와 함께 필요한 각 단계에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 우리의 경험에서 몇 걸음 DiOLISTICS의 성공적인 응용 프로그램에 대한 중요한 증명. 이러한 고려 사항은 DiI - 코팅 총알의 품질, 정착액 노출의 범위 및 부화 솔루션에 사용되는 세제의 농도를 포함합니다. 일반적인 문제에 대한 도움말과 솔루션이 제공됩니다.
이 연령대의 광범위한 여러 동물 종 (种)에 적용할 수있는 다양한 분류 방법입니다. 그들은 형광 transgene의 표현에 의존하기 때문에 젊은 동물의 준비로 제한하거나 마우스로 제한 다른 형광 라벨 기술과는 달리, DiOLISTIC 라벨은 모든 연령, 종 및 genotypes의 동물에 적용할 수 있으며, 그것은 함께 사용할 수 있습니다 세포의 특정 subpopulation을 식별하는 immunostaining. 여기 dendrite 분기와 돌기 척추의 형태를 quantifying의 목적으로 성인 마우스 및 성인이 아닌 인간 영장류의 뇌 조각의 레이블 뉴런에 DiOLISTICS의 사용을 보여줍니다.
Protocol
1. 준비 DiI / 텅스텐 비드 총알 DiI (1 - 1' - Dioctadecyl - 3, 3,3 '퍼클로레이트을 3'가 - tetramethylindocarbocyanine) 총알은 뇌 조각을 잘라 미리 준비되어야합니다. 절차는 한번에 준비가되어 몇 개의 총알에 따라 약 2-4시간 걸립니다.
- 텅스텐 비즈의 새로운 배치부터 시작하는 경우, 300 MG 각각의 aliquots을 준비합니다. Aliquots은 메틸렌 염화물 2 ML에 텅스텐의 6g을 중단하여 준비가되어 있습니다. .. 그런 다음, 피펫 microfuge 튜브로 비즈 솔루션 100 μl은 상온에서 저장 aliquots 300 MG 텅스텐 구슬 aliquots를 생산 (참고 : 메틸렌 염화물이 매우 신속하게 증발 알코올도 증발을 최소화 사용할 수 있습니다.) 있습니다.
- 구슬 aliquots부터 시작하면, 메틸렌 염화물 300 μl의 각 나누어지는 (300 MG 텅스텐 비즈)을 resuspend하고 증발을 방지하기 위해 신속하게 커버. 이 수량은 총알이 3 배치를 위해 충분하다.
- lipophilic 염색 DiI의 13.5 MG 무게 및 메틸렌 염화물의 450 μl (최종 농도가 = 3mg/100μl)을 추가하여 염료 솔루션을 준비합니다.
- 염색과 코팅 비즈 있습니다. 한 조각의 유리 슬라이드를 삽입 왁스 - 코팅 슬라이드에 구슬 종이와 피펫 100 μl의 무게. , DiI 솔루션 100 μl를 추가 구슬은 밝은 회색을 돌려 때까지 피펫 팁, 공기 건조를 사용하여 철저히 섞는다.
- 유리 슬라이드에서 구슬을 다쳤고, 그리고 훌륭한 분말로 구슬을 주사위에 면도날을 사용합니다 (참고 : 염료를 오염하지 않도록 총알이 하나 이상의 색상을하는 경우 새 블레이드를 사용하여)..
- 에 스크 레이프 비즈는 15 ML 원뿔 관에 종이와 퍼널 구슬의 무게. 물 3 ML을 추가하고 실온에서 10-30 분 물 목욕에 sonicate (참고 : 가루와 sonication의 다이싱 개별 뉴런의 스파스 라벨을 방해합니다 코팅 구슬의 대단히 짧은 시간의 형성을 최소화하기 위해 적용됩니다)..
2. 총알 튜빙 (TEZFEL 튜브), polyvinylpyrrolidone (PVP) 솔루션으로 코팅을하는 비드 첨부 파일을 개선하기 위해 : polyvinylpyrrolidone (PVP) 솔루션과 튜빙을 준비.
- 10 MG PVP / ML의 농도에서 물에 PVP 솔루션 10 ML을 준비합니다.
- 다른 쪽 끝을 밖으로 추방 다음 총알의 튜브를 통해 PVP 솔루션을 전달 튜브 어댑터와 함께 12 ML 주사기 (약간 큰 직경 유연한 튜브)를 사용합니다. 여러 배치를 동시에 준비하는 경우 겉옷보다 총알 튜브 솔루션을 재사용. 사용 후 PVP 솔루션을 폐기하십시오.
- 총알의 튜브에 비즈를 추가하려면, 소용돌이 동질적인 솔루션을 생산하고 구슬이 균일하게 튜브를 통해 배포됩니다 그래서 튜브를 통해 비드 솔루션을 잡아 주사기를 사용하는 비즈. ((참고 :) 튜브에 공기 방울의 수를 최소화하기 위해 노력).
- 준비 역을 통해 튜브를 공급하고 비즈를 안정 수 있습니다. 오직 비즈 남아 있도록 부드럽게 물을 제거하기 위해 주사기를 사용합니다.
- 물방울이 더 이상 표시되지 않습니다 때까지 준비 스테이션 및 질소 가스로 건조에 튜빙을 스핀. 이 단계는 약 10-20 분 소요됩니다.
- 13mm 길이와 Drierite 또는 무수 황산 칼슘 일종의를 포함하는 섬광 튜브 안에 자리로 튜브 커터로 총알을 잘라 버릴거야. 빛과 보호하기 위해 호일에 튜브를 넣어.
3. DiI의 스테 이닝이 분류 기술은 다양한 종류의 뇌 조직에서 신경을 얼룩하는 데 사용될 수 있으며,이 특정한 경우에, 마우스 (이전 3~6개월)과 비 인간 영장류 (9~15년 이전)에서.
그것은 조직 보존이 조건 하에서 최선 것으로 예상되기 때문에 슬라이스가 정착액 솔루션의 transcardiac 재관류에 의해 얻은 고정 뇌 조직에서 준비하는 것이 바람직합니다. 그러나 재관류에 의해 고정은 항상 가능하지 않습니다 (로 원숭이 조직의 경우 예전) 및 DiOLISTIC 라벨은 여전히 성공적으로 조직 준비에 대해 서로 다른 절차에 따라 적용할 수 있습니다. 여기 우리는 조직 준비를위한 세 가지 절차를 설명합니다 :
- transcardiac 재관류에 의해 머리를 수정 → 10 분 → 컷 슬라이스에 대한 뇌 → postfix와 얼룩을 제거 →
- 뇌 → 조직의 절단 블록 → 수정 → 블록 PBS → 컷 통에 세척 → 얼룩을 제거
- 머리를 제거 → 컷 조각은 → 수정 → 세척 → 얼룩
현재 연구에서 원숭이 두뇌는 transcardially 얼음 차가운 인공 대뇌 척추 뇌 수확하기 전에 액체 (ACSF)과 꼬리가있는을 포함하는 조직의 블록 (두께 4mm)로 perfused되었습니다 과목에서 얻은되었습니다ND putamen는 실온에서 60 분에 대한 해결되었습니다. 모든 절차를 보려면, 정착액 솔루션은 4 % paraformaldehyde와 PBS (신선 준비 또는 15 일 이내에 사용) 4 %의 자당이 포함되어 있습니다. 고정 시간이 성공적으로 얼룩을 위해 중요합니다하는 것이 중요합니다. Overfixation는 플라즈마 막의 무결성을 방해하고 (결과에 따라 자세한 내용을 참조) 세포 밖으로 누출 염료의 원인으로 얼룩에 영향을 줄 수 있습니다.
- 절차 A와 B는 조각 (200μm)를 고정 뇌 또는 조직 블록과 PBS 24 - 잘 판에 배치 조각에서 절단됩니다. 절차 C는 신선한 급성 뇌 조각이 (200 μm의)이있는 냉간 가공 솔루션 vibratome (MM)를 110 콜린 - CL, 25 NaHCO 3, 1.25 아니 2 PO 4, 2.5 KCl, 0.5 CaCl 2, 7 MgCl와 버렸어요 2, 25 포도당, 11.6 아스코르비 산, 3.1 pyruvic 산성 (osmolarity = 310 mOsmols) 및 즉시 자른 후 24 - 잘 접시에 위치하고 실온에서 정착액 솔루션으로 30 분 고정됩니다.
- PBS와 슬라이스, 3 번 씻으십시오.
- 촬영 슬라이스 전에 우물에서 PBS를 제거하고, 페인트를 사용하여 잘의 중심에있는 슬라이스를 놓습니다.
- 샘플과 총신의 끝 부분 사이에 1.5 cm의 거리에서 총을 배치 120-180 PSI 헬륨 가스 압력에서 헬리 우스 진 건 시스템을 사용하여 3.0 μm의 여과지를 통해 DiI 총알을 쏴.
(중요 사항 :. 그것은 세척하는 동안 및 장착에 직면하고있는 조각의 동일한 측면을 유지하는 것이 중요하므로이 방법에서 확인되는 슬라이스 표면의 50mm 이내에만 신경이 방법으로 표시됩니다 때 공촛점 현미경으로 영상)는 라벨이 뉴런은 초점 거리에 있습니다. - PBS로 3 번 조각을 씻고 DiI가 dendrites 따라 확산 수 있도록 몇 시간 동안 PBS에 저장합니다.
- 골드 Antifade을 연장있는 유리 슬라이드에 조각 마운트 18X18 mm 제일 coverslip로 커버. (참고 : 조각의 무결성 잘 하룻밤 유지되지 않습니다과 같은 절차 C에 대해, 그것은 같은 날 조각을 탑재하는 것이 좋습니다.)
- 설치 미디어 후 투명 매니큐어와 인감이 건조하고 있습니다.
- 또는 조각은 아래에 설명된대로 장착하기 전에 항체 물들일 수 있습니다.
(참고 : 어둠에 저장되어있는 경우에는 슬라이드가 4 년 적어도 6 개월 이상 사용할 수 있습니다 ° C. DiI는 퇴색하는 얼룩의 원인이됩니다 빛으로 민감한 및 장기 노출됩니다.)
4. 항체 스테 이닝 : Immunostaining이 단계를 3.4 이후 장착하기 전에 수행해야합니다.
- Permeabilization : 0.01 %에 품어 슬라이스 트리톤 실온에서 15 분 (물론 당 300-500 μl)를 PBS 용액에서 X - 100.
참고 :이 DiI를 해산하고 크게 형광 염색법을 감소하므로 세제 높은 농도를 사용하지 마십시오. 광범위한 incubations 또한 DiI 라벨을 감소하므로 세제의 시간을 최소화하기 위해보십시오. 확장 incubations가 필요한 경우 솔루션을 차단에 PBS에서 조각을 유지하기보다는. - 차단 : 10 % 염소 혈청을 포함하는 솔루션을 차단에 품어 조각, 0.01 % 트리톤 실온에서 30 분 PBS에서 X - 100.
- 차 항체 : 차단 솔루션 (1:1000 희석에서 예 토끼 방지 GFP 항체)에서 원하는 희석에서 항체를 추가합니다. 마다 잘 300-500 μl를 추가하고 1-2 시간을위한 부화. (참고 : 야간 incubations가 필요한 경우 솔루션을 차단에서 세제를 제거합니다.)
- 5 PBS와 조각 워시 - 15 분, 3 번.
- 차 항체 : 상온에서 30 분 차 항체와 부화. 차단 솔루션에서 원하는 희석 (1:1000 희석에서 예 알렉사 - 플루어 488 복합 항체)에 보조 항체 솔루션을 준비합니다.
- 5-15 분, 4 번 PBS로 조각 씻으십시오.
- 골드 Antifade을 연장하고 18x18 mm 제일 coverslip와 커버 슬라이드에 슬라이스를 탑재합니다. 설치 미디어 후 매니큐어와 인감이 건조하고 있습니다.
5. 대표 결과 :
- 올바른 라벨에 대한 확인 : 섹션 수은 램프와 성공 DiOLISTIC 라벨을 확인하는 적색 형광 필터 큐브 장착된 형광등 해부 현미경 시각하실 수 있습니다. 그림 1은 낮은 배율에서 얻은 멋지게 표시 뇌 부분의 모범적인 이미지를 보여줍니다. 찾기 위해 두 가지 중요한 특성은 스파스 상표 패턴 (그림 1A) 및 개별 세포 구성 요소 (그림 1B - C)를 식별하는 능력입니다. 문제 해결 DiOLISTIC 분류 : 그림 2는 DiOLISTIC 상표 잘못 근무하는 섹션의 예를 보여줍니다. 우리의 경험에서 비효율적인 라벨에 대한 세 가지 주요 원인 있습니다 :
- 레이블이 너무 스파스 또는 밀도입니다 거의 세포 한 경우 섹션당 표시되거나 너무 많은 세포가 하나의 세포 요소의 격리 및 연구를 예방 표시하고 있습니다. 해결 방법 : 코팅 TEFZEL 초고속 튜브 (섹션 1.6)에 사용되는 최종 솔루션에 코팅 구슬의 농도를 조정합니다. 또는 감소로 각각 너무 스파스 혹은 너무 밀도 라벨에 대한 정확한하기 위해 구슬을 분해하는 데 사용되는 물 (3 ML 초기 값)의 볼륨을 증가시킵니다. 섹션에 코팅된 비즈 촬영 때 또한, 상표의 낮은 효율성은 최적의 가스 압력 이하로 인해 발생할 수 있습니다. 이 가능성은 TEFZEL 총알 튜빙은 코팅 구슬의 대부분을 발표했다하고 촬영 후 취소 나타나는지 확인하여 배제 수 있습니다. 그렇지 않으면, 촬영 가스 압력이 증가한다.
- 잘못된 총알 큰 대단히 짧은 시간이나 염료 코팅 텅스텐 비즈의 클러스터가 총알을 준비하는 동안 형성된다. 섹션 그림 2A - B의 예제 유사합니다. 해결 방법 : 섹션 1.5 /에 특히주의를 기울이고 새로운 총알을 만들거나 섹션 1.6에서 sonication 시간을 연장.
- 이상 - 고정 : 조직이 고정 (200-300 μm의 섹션 30 분, 4mm 섹션에 대한 1 시간)에 대한 최적의 소요 시간보다 오래 paraformaldehyde 용액에 보관됩니다. 이것은 플라즈마 막의 무결성을 떨어뜨리고 라벨 초점의 세포 밖으로 염색의 분산으로 인해 밖으로 보이는 어떤 그림 2C - D에 표시된 것과 같은 모양 표시된 섹션을 생산하고 있습니다. 해결 방법 : 고정 시간을 줄일 수 있습니다.
- 공촛점 이미징 : 이미지 스택은 dendrite 세그먼트에 대한 전체 세포 및 63x 물 침지 목적을위한 20x 목적으로 공촛점 현미경 (자이스 혈구 LSM 510 META)를 사용 찾았습니다. DiI는 488 NM 레이저 라인을 사용하여 흥분했던 이차 항체에서 DPS 561 NM 레이저 라인과 녹색 형광을 사용하여 흥분했다. 공촛점 현미경을 사용할 때 달성 표시된 샘플의 광학 sectioning 추가 샘플에서 단일 레이블 세포의 격리를 허용합니다. 그림 3A 마우스 두뇌와 복잡한 dendrite 지점 패턴에서 striatal 중간 가시의 신경 세포를 보여줍니다. 설치류 (그림 3B)과 비 인간 영장류 (그림 3C)에서 이러한 뉴런의 dendrite 지점의 높은 배율 이미지는 두 수종에이 기법을 사용 dendrites과 돌기 쪽이에 얼룩의 정도를 보여줍니다. 길고 얇은 척추 중간 가시의 뉴런에 이렇게 풍부한 머리를 고려하는 경우에도 Dendrites과 라고나할까요은 (쪽이) 뭐, 정의가 나타납니다.
immunostaining와 DiOLISTICS을 결합하면, 공촛점 영상은 명백하게 동일한 초점 비행기와 같은 세포로 얼룩을 번역에도 도움이됩니다. 그림 4는 DiI는 상표 및 단일 세포에 GFP를위한 immunostaining의 colocalization의 예를 보여줍니다. 이미지는 D1의 도파민 수용체 모터에서 형광 단백질 GFP를 표현하는 유전자 변형 마우스 striatal 슬라이스에서 얻은 한 스택 (0.7 μm의 Z - 섹션)입니다.
그림 1. 비 인간 영장류의 뇌 조각의 뉴런의 DiI 라벨. DiI과 뉴런의 스파스 라벨을 표시 cynomolgus 원숭이의 꼬리가있는 핵을 포함하는 스테인드 뇌 슬라이스의 (A) 낮은 배율 이미지. (BC) 절연 매체 가시의 뉴런이 쉽게 형광 해부 범위를 사용하여 확인할 수 있습니다.
그림 2. 문제 해결 DiOLISTIC 라벨. (AB) 등의 원숭이의 striatum (A)와 마우스의 스테인드 조각은 (B) 염료 코팅 구슬 큰 대단히 짧은 시간을 보여 주며 그 결과로, 더 개별 세포 요소를 구분할 수 없습니다. (CD) 이미지 DiOLISTIC 신청의 결과를 예시 것을 시간이나 어디 조직 보존 연장 기간에 대한 고정력있는 용액에 보관되었다 섹션에 분류하는 것은 원숭이 (C) 및 마우스 (D) 조직에 실패했습니다.
그림 3. DiI 물들일 striatal 중간 가시 신경 세포의 공촛점 이미지. (A), 전체 세포의 이미지 스택 (BC) Dendrite 세그먼트는 마우스. 돌기 가지의 형태학의 분석을 위해 수 (B)와 원숭이 (C) 중간 가시의 뉴런은 dendrite와 쪽이의 명확한 라벨을 보여줍니다.
그림 4. immunostaining와 DiOLISTIC 라벨을 결합하여. (A) DiI가 표시
Discussion
그것이 연령대의 다양한 다양한 종류의 조직 섹션에 적용하고, 조직에 신선한 또는 정착액 - perfused 동물에서 얻을 수 있기 때문에 DiOLISTIC 라벨링은 (또한 간 외 볼 찬란 라벨 세포에 사용할 수있는 가장 융통성있는 기술 중 하나입니다 . 2009 년). 이 과정은 1-2 일 정도가 소요로 비교적 빠른이며, 그것은 같은 immunostaining (리 외., 2006)와 같은 다른 많은 고전적인 분류 방법과 함께하실 수 있습니다. 이들은 lipophilic 막의 무결성을 구성하여 염료가 세포 밖으로 누출 원인이되므로 특별한주의가 고정과 부화 솔루션에 높은 세제 농도의 사용을 통해 피하기 위해 지불되어야합니다. 항체 침투가 낮은 농도로 용이 수있는 트리톤 X - 100 인큐베이션 솔루션 (리 외., 2006)뿐만 아니라 digitonin 또는 사포닌 (마쓰 바 야시 외., 2008). 이 기법에 적용할 수있는 몇 가지 수정은 간 외. (2000) 또는 항체 노출 (닐리 외., 2009)의 길이와 유형을 변경하여 설명한 여러 염료와 총알의 사용을 포함합니다.
전통적으로, DiI은 두뇌에의 연결을 계획을 추적하는 데 사용되었습니다. DiOLISTIC 라벨은 세포 형태를 검사하기 위해 유용한 방법을 설명하여 응용 프로그램을 확장합니다. 의 연결 형태 큰 관심 때문에 두뇌와 세포 모양은 신경 시스템의 연결 인구의 기능 다중성에 반영이 될지도 모른다는 추측에있는 큰 다양성이다. 이 중 한 예는 포유류의 신경 시스템의 디스플레이 작은 돌출부 많은 뉴런들이 시냅스 glutamatergic의 사이트에 아르 돌기 쪽이라는 사실이다. 이러한 방법으로 세포에 glutamatergic 시냅스의 밀도는 본 설명 라벨 기법을 사용하여 측정할 수 돌기 쪽이의 밀도에 상관하실 수 있습니다. 또한, 이러한 dendrite 전체 길이, 분기 패턴, 돌기 척추의 형상 및 밀도 등의 형태학의 매개 변수가 계량하고 공부하실 수 있습니다.
그것이 높은 해상도 공촛점 이미징을 허용하기 때문에 명시야 현미경 (예 : 잠돌군 Zz의 얼룩)에 의존하는 전통적인 기법과 비교의 연결 형태를 공부에 대한 형광 상표의 사용은 많은 장점이 있습니다. 형태 돌기 척추 밀도를 측정하기위한 실험에 형광단로 DiI을 사용의 또 다른 이점은 lipophilic 속성입니다. DiI의 플라즈마 막으로 파티션하고의 연결 프로세스와 돌기 라고나할까요의 잘 정의된 개요를 제공합니다. 대부분의 돌기 쪽이 (이하 한 femtoliter)의 소량을 감안할 때, 멤브레인 얼룩이보다 효율적이고 세포질 얼룩보다 작고 얇은 라고나할까요보다 시각화를위한 수 있습니다.
Disclosures
모든 동물의 절차 NIAAA 그리고 오리건 국립 메이트 연구 센터에서 동물 케어 및 사용위원회의 지침에 따라 수행되었다. 저자는 공개 없어요.
Acknowledgments
우리가 그들의 공촛점 현미경에 대한 액세스 기술과 박사 후미 오노의 실험실 최대 초기 설정 중에 도움 마이클 Feyder와 테럴 홀로을 인정하고 싶습니다. 이 연구는 NIAAA와 NINDs의 교내 프로그램을 통해 건강의 국립 연구소에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI) | Invitrogen | D-282 | |
| Methylene chloride | Mallinckrodt Baker Inc. | H485-06 | |
| Tungsten beads | Bio-Rad | 165-2269 | 1.7 μm diameter |
| Polyvinylpyrrolidone | Calbiochem | 529504 | |
| Tefzel bullet tubing | Bio-Rad | 165-2441 | |
| Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | |
| Helios Gene Gun | Bio-Rad | 165-2431 | |
| Isopore membrane filter paper | EMD Millipore | TSTP02500 | 3.0 μm pore size |
| ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | (16% w/v) |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOLISTIC" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harb Protoc. , pdb.prot5202-pdb.prot5202 (2009).
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