DiOLISTIC Маркировка нейроны от грызунов и не-человека Предстоятель фрагменты мозга

Summary

Мы демонстрируем использование генной пушки ввести флуоресцентными красителями, например, DII, в нейроны в мозге ломтики от грызунов и не-человеческое приматов разных возрастов. В данном конкретном случае мы используем взрослых мышей (3-6 месяцев) и взрослых cynomologus обезьян (9-15 лет). Этот метод, впервые описана в лаборатории доктора Лихтман (Ган

Abstract

DiOLISTIC окрашивания использует генной пушки ввести флуоресцентными красителями, например, DII, в нейроны головного мозга ломтиками (Ган и др., 2009;. О'Брайен и Ламмис, 2007; Ган и др., 2000.). Здесь мы предлагаем подробное описание каждого шага необходимо вместе с образцовой образы хороших и плохих результатов, которые помогут при создании техники. По нашему опыту, в нескольких шагах доказал решающее значение для успешного применения DiOLISTICS. Эти соображения включают качество DII пулями, степень воздействия фиксатора, и концентрация моющего средства в инкубационном решений. Советы и решения общих проблем предоставляются.

Это универсальный метод маркировки, которые могут быть применены к нескольким видам животных в широком диапазоне возрастов. В отличие от других флуоресцентных методов маркировки, которые ограничены препаратов из молодых животных или ограниченных для мышей, потому что они полагаются на выражение флуоресцентные трансгенов, DiOLISTIC маркировки может быть применена к животным всех возрастов, видов и генотипов, и он может быть использован в сочетании с иммуноокрашивания определить конкретные субпопуляции клеток. Здесь мы демонстрируем использование DiOLISTICS маркировать нейронов в мозге ломтики от взрослых мышей и взрослых без человеческих приматов с целью количественной дендритов ветвление и дендритных морфологии позвоночника.

Protocol

1. Подготовка DII / Вольфрам из бисера Пули: DII (1-1'-Dioctadecyl-3, 3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine перхлорат) пули должны быть подготовлены до начала резки ломтиками мозга. Процедура занимает около 2-4 часов в зависимости от того, сколько пуль готовы сразу.

1. Если, начиная с новой партии вольфрамовых шариков, подготовить порции по 300 мг каждая. Порции готовятся путем приостановления 6 граммов вольфрама в 2 мл хлористого метилена. Затем пипеткой по 100 мкл раствора в бисер микроцентрифужную труб для производства аликвоты 300 бусин мг вольфрама магазин аликвот при комнатной температуре (примечание: метиленхлорид испаряется очень быстро Алкоголь может также использоваться минимизации испарения)....
2. При запуске из аликвот из бисера, ресуспендируют каждую аликвоту (300 бусин мг вольфрама) в 300 мкл метиленхлорида и крышка быстро, чтобы предотвратить испарение. Это количества достаточно для 3 партии пуль.
3. Подготовка раствора красителя путем взвешивания 13,5 мг липофильный краситель DII и добавлением 450 мкл метиленхлорида (конечная концентрация = 3mg/100μl).
4. Пальто бисер с красителем. Место стекло на лист, покрытых воском весят бумаги и пипетки 100 мкл из бисера на слайде. Добавить 100 мкл раствора DII, тщательно перемешайте использованием пипетки, и воздух сухой, пока бисером свою очередь, светло-серый.
5. Используйте лезвие, чтобы очистить от бусины стекло и кости бисером в мелкий порошок (Примечание: использовать новое лезвие, если делать больше, чем один цвет пуль, чтобы не загрязнять красителей)..
6. Очистите бисером на вес бумаги и бусин в воронку 15 мл коническую трубку. Добавьте 3 мл воды и разрушать ультразвуком на водяной бане в течение 10-30 минут при комнатной температуре (примечание: игра в кости в порошок и ультразвука применяются для минимизации образования сгустков покрытием бусы, которые будут нарушать редкие маркировки отдельных нейронов)..

2. Подготовка поливинилпирролидона (ПВП) решение и труб: Для улучшения шарик привязанности к пулю трубки (трубки TEZFEL), пальто с поливинилпирролидона (ПВП) решение.

1. Подготовка 10 мл ПВП раствора в воде при концентрации 10 мг PVP / мл.
2. Используйте 12 мл шприца с трубкой адаптер (гибкий шланг с чуть большего диаметра), чтобы пройти через раствор ПВП пуля трубки, а затем изгнать его из другого конца. Повторное решение, чтобы покрыть более пуля трубку, если несколько партий готовы одновременно. Отменить решение ПВП после использования.
3. Чтобы добавить бисера пуля трубки, вихревые бусин для производства гомогенного раствора и использовать шприц, чтобы вытащить шарик раствора через трубку так, чтобы бусины равномерно распределены по всей трубки. ((Примечание:) стараются свести к минимуму число пузырьков воздуха в трубку).
4. Поток трубы через приготовительные станции и позволит бисером, чтобы обосноваться. Используйте шприц, чтобы аккуратно удалить воду так, чтобы только остаться бисером.
5. Спиновые трубы на станции приготовительные и сухой азотом, пока капельки воды не было видно. Этот шаг займет около 10-20 мин.
6. Вырезать пули с трубками катер на 13 мм длины и место в сцинтилляционных флаконах, содержащих Drierite или какой-то безводного сульфата кальция. Оберните флаконов в фольгой для защиты от света.

3. DII Окрашивание: Эта маркировка методика может быть использована для окраски нейронов в мозговой ткани из различных видов; в данном случае, от мыши (3-6 месяцев) и не-человеческое приматов (9-15 лет).

Желательно, чтобы ломтики готовятся из фиксированной ткани мозга получить transcardiac перфузии фиксирующий решение, потому что ткани сохранение как ожидается, будет лучше всего под это условие. Тем не менее, фиксация перфузии не всегда возможно (как было в случае с обезьяны ткани) и DiOLISTIC маркировки все еще может с успехом применяться при различных процедурах подготовки ткани. Здесь мы опишем три различные процедуры для подготовки ткани:

1. Fix мозга transcardiac перфузии мозга удалить → → постфикс в течение 10 мин → вырезать часть пятна →
2. Удалить мозга → вырезать блок ткани → исправить блок → мыть в ФБС → вырезать часть пятна →
3. Удалить мозга → вырезать ломтики → исправить → мыть → пятно

В настоящем исследовании обезьян мозги были получены от субъектов, которые были transcardially озарен ледяной искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) до мозга урожая и блок (4 мм) из ткани, содержащей хвостатогоой путамен было зафиксировано в течение 60 мин при комнатной температуре. Для всех процедур, фиксирующий раствор содержит 4% параформальдегида и 4% сахарозы в PBS (подготовленные свежие или использован в течение 15 дней). Важно отметить, что фиксация раз являются критически важными для успешного окрашивания. Overfixation могут повлиять на окрашивание, нарушая целостность плазматической мембраны и вызывает красителя к утечке из клетки (см. дополнительную информацию по результатам).

1. Для процедуры и б, ломтики (200 мкм), вырезаны из фиксированного мозга или блок ткани и срезов помещены в 24-луночный планшет с PBS. Для процедуры с, свежий острый ломтики мозга (200 мкм) срезают vibratome в холодный раствор резка, содержащий (в мМ) 110 Холин-Cl, 25 NaHCO _3, 1,25 NaH ₂ PO _4, 2,5 KCl, CaCl 0,5 _2, 7 MgCl _2, 25 глюкозой, аскорбиновой кислоты 11,6, 3,1 пировиноградной кислоты (осмолярность = 310 mOsmols) и сразу после ломтиками помещаются в 24-луночных планшетах и фиксированной в течение 30 мин с фиксатором растворе при комнатной температуре.
2. Промыть ломтики с PBS, 3 раза.
3. Перед съемкой ломтиками, удалить PBS из скважин и, используя кисти, место среза в центре хорошо.
4. Стреляйте DII пули через 3,0 мкм фильтр бумаги с помощью генной пушки Гелиос системы на 120-180 фунтов на квадратный дюйм давления гелия газа, поставив пистолет на расстоянии 1,5 см между образцом и концом ствола.
   (Важное примечание:. Только нейронов пределах 50 мм от поверхности среза будут помечены этим методом, поэтому важно держать одну сторону среза вверх во время мытья и для монтажа Таким образом, вы убедитесь, что меченых нейронов будет в пределах фокусного расстояния, когда изображение с конфокальной микроскопии).
5. Промыть ломтики с PBS 3 раза и хранить их в PBS в течение нескольких часов, чтобы позволить DII распространяться по дендритов.
6. Горы ломтиками на предметное стекло с Продли Золотой Antifade и накрыть 18x18 мм № 1 покровное. (Примечание: для процедуры с, лучше монтировать ломтики в тот же день, как целостность ломтики не очень хорошо поддерживается на ночь).
7. Печать с четкими лак для ногтей после монтажа СМИ сушат.
8. Кроме того, ломтики можно окрашивали антителами перед установкой, как описано ниже.
   (Примечание: Слайды могут быть использованы по крайней мере 6 месяцев до года при условии хранения в темноте при 4 ° C. DII является светочувствительных и долгосрочного воздействия света вызовет пятно исчезать).

4. Антитела Пятно: Иммуноокрашивание должна быть выполнена после шага 3.4 и до начала монтажа.

1. Пермеабилизации: Инкубируйте срезов в 0,01% Тритон Х-100 в PBS решение в течение 15 мин при комнатной температуре (300-500 мкл на лунку).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте более высокие концентрации моющего средства, поскольку это будет растворяться DII и значительно снизить флуоресцентного окрашивания. Постарайтесь свести к минимуму время в производстве моющих средств, как обширные инкубации также снизит маркировки DII. Если расширенные инкубации необходимо, сохранить ломтики в PBS, а не в блокировании решения.
2. Блокировка: Инкубируйте ломтики в блокирующем растворе, содержащем 10% сыворотки козьего, 0,01% Тритон Х-100 в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре.
3. Первичное антитело: Добавить антитела в нужном разведении в блокировании решения (например, кролика анти-GFP антител в разведении 1:1000). Добавить 300-500 мкл на лунку и инкубировать в течение 1-2 часов. (Примечание: если ночь инкубации необходимости удалить моющим средством от блокирования раствора).
4. Промыть ломтики с PBS в течение 5 - 15 минут, 3 раза.
5. Вторичные антитела: Инкубируйте с вторичными антителами в течение 30 мин при комнатной температуре. Подготовка вторичного решение антитела в нужные разведения в блокировании решения (например, Alexa Fluor 488-конъюгированных антител в разведении 1:1000).
6. Промыть ломтики с PBS в течение 5-15 мин, в 4 раза.
7. Горы ломтики на слайды с Продли Золотой Antifade и накрыть 18x18 мм № 1 покровное. Печать с лаком для ногтей после монтажа СМИ сушат.

5. Представитель Результаты:

1. Проверка правильности маркировки: Раздел могут быть визуализированы под флуоресцентным рассекает сферу оснащен ртутной лампы и красный флуоресцентный фильтр куб для подтверждения успешного DiOLISTIC маркировки. На рисунке 1 показано образцовое изображение хорошо помечены разделы мозга, полученных при малом увеличении. Два важных характеристик для поиска являются редкими шаблон маркировки (рис. 1А) и способность идентифицировать отдельных клеточных компонентов (рис. 1B-C). Устранение неполадок DiOLISTIC маркировки: Рисунок 2 показывает примеры разделов, в которых DiOLISTIC маркировки работал некорректно. По нашему опыту, Есть три основных причины для неэффективных маркировке:
   • Маркировка является слишком малая или плотной: Очень немногие клетки помечены на секцию в одном случае или слишком много клеток помечены предотвращения выделения и изучения одного клеточных элементов. Решение: регулировать концентрацию покрытием бусины в окончательном решении используется для покрытия трубы TEFZEL пуля (раздел 1.6). Уменьшение или увеличение объема воды (3 мл начального значения), используемые для растворения бисером, чтобы исправить слишком малая или слишком насыщенная маркировки, соответственно. Кроме того, низкая эффективность маркировки может быть вызвано менее оптимальное давление газа при съемке покрытой бисером на разделы. Эта возможность может быть исключена, убедившись, что TEFZEL трубки пулю выпустила большую часть покрыта бисером и, кажется, ясно после стрельбы. В противном случае давление газа для съемки должна быть увеличена.
   • Плохо пули: большие скопления или кластеры красителя покрытием бисером вольфрама образуются при пули подготовки. Разделы будет напоминать примеры на рисунке 2А-B. Решение: сделать новые пули обращая особое внимание на раздел 1.5 и / или продлить время обработки ультразвуком в разделе 1.6.
   • Чрезмерная фиксация: ткань хранится в параформальдегида решение для более оптимально необходимое время для крепления (30 минут на 200-300 мкм разделы, 1 час на 4 мм разделы). Это ставит под угрозу целостность плазматической мембраны и производит помечены разделы, которые выглядят так, как показано на рисунке 2C-D, в котором маркировки кажется, не в фокусе из-за дисперсии красителя из клеток. Решение: сократить время фиксации.
2. Конфокальной микроскопии: Изображение стеки, приобретенный с помощью конфокальной микроскопии (Zeiss LSM 510 META) с 20-кратным цель для всей клетке и 63x цель погружением в воду сегменты дендритов. DII возбуждалась использованием DPS 561 нм лазерной линии и зеленой флуоресценции от вторичного антитела возбуждалась использованием 488 нм лазера. Оптического секционирования меченых образцов достигается при использовании конфокальной микроскопии в дальнейшем позволяет для изоляции одного меченых клеток в исследуемом образце. На рис.3 показана полосатой колючих нейронов среды из мозга мышей и его сложный узор ветвь дендрита. Изображения с высоким увеличением дендритных ветвей эти нейроны от грызунов (рис. 3В) и не-человеческое приматов (Рис. 3С) демонстрируют степень окрашивания в дендритов и дендритных шипиков с помощью этой техники у обоих видов. Дендриты и их выступы (шипы) появляются четко определены, даже при рассмотрении длинные, тонкие позвоночника главы так много в среде нейронов колючих.
   
   При объединении DiOLISTICS с иммунной, конфокальной микроскопии также полезно в однозначно локализовать пятно на той же фокальной плоскости и той же клетке. Рисунок 4 показывает пример колокализации DII маркировки и иммуногистохимическое GFP в одной ячейке. Изображение одной стопки (0,7 мкм Z-разделе), полученных из полосатой ломтик от трансгенных мышей выражения флуоресцентного белка GFP под рецепторов допамина промоутер D1.

Рисунок 1. DII маркировки нейронов в мозге ломтики из не-человеческое приматов. () Низкая увеличения изображения из окрашенных срез мозга, содержащего хвостатого ядра от циномолгус обезьяна, которая показывает редкие маркировки нейронов с DII. (BC) Изолированные нейроны средний колючий можно легко идентифицировать с помощью флуоресцентных рассекает области.

Рисунок 2. Устранение неполадок DiOLISTIC маркировки. (АВ) Витражи ломтики из спинной стриатуме обезьяна () и мыши (Б), показывающие большие скопления красителя покрытой бисером и, как следствие, ни один человек клеточные элементы могут быть выделены. (CD) Изображения, которые иллюстрируют результат применения DiOLISTIC маркировки на разделы, которые хранились в фиксирующий раствор в течение длительных периодов времени, или там, где ткань сохранение неудачу в обезьян (C) и мыши (D) ткани.

Рисунок 3. Конфокальной образ полосатой среду колючих нейронов окрашивали DII. (А), изображение стопки целой клетки позволяет морфологический анализ дендритных ветвей. (BC) сегментов Dendrite от мыши (Б) и обезьяны (C) среде нейронов колючих показывают четкую маркировку дендритов и шипами.

Рисунок 4. Объединение DiOLISTIC маркировки с иммунной окраски. (А) DII помечены (B) Иммуноокрашивание с использованием анти-GFP антитело, как описано методами адаптированный Lee и соавт. (2006). То же самое поле, как А. (С) составное изображение красного и зеленого свечения указывает DII меченых нейронов, как GFP-положительных нейронов.

Discussion

DiOLISTIC маркировка является одним из наиболее универсальных методов, доступных для флуоресцентной маркировки клетки, поскольку она может быть применена к срезах тканей из разных видов, широкий диапазон возрастов, а также ткани, полученной из свежих или фиксатором-перфузии животных (см. также Ган и др. ., 2009). Процесс относительно быстро, как это занимает 1-2 дней, и он может быть объединен с другими, более классической маркировки подходы, такие как иммунное (Lee и соавт., 2006). Особое внимание следует уделить, чтобы избежать чрезмерной фиксации и использование высоких концентраций детергентов в инкубации, потому что эти решения будет состоять целостности липофильные мембраны и вызывать красителя к утечке из клетки. Антитела проникновения может способствовать низкие концентрации Тритон Х-100 (Lee и соавт., 2006), а также дигитонин или сапонина в инкубационном растворе (Matsubayashi и соавт., 2008). Некоторые изменения, которые могут быть применены к этой технике относятся использование пули с несколькими красителями, как описано в Гане и соавт. (2000) или изменение длины и типа антител экспозиции (Нили и соавт., 2009).

Традиционно, DII была использована для определения проекций нейронов в головном мозге. DiOLISTIC маркировка расширяет его применение с описания метода целесообразно рассмотреть морфологии клеток. Нейронные морфологии представляет большой интерес из-за большого разнообразия в мозге и предположение, что формы клеток могли бы отразиться на функции кратности нейронных популяций в нервной системе. Одним из примеров этого является тот факт, что многие нейроны в нервной системе млекопитающих отображения небольших выступов называемых дендритных шипиков, которые сайт глутаматергической синапсов. Таким образом, плотность синапсов глутаматергической на ячейке может быть соотнесена с плотностью дендритных шипиков, которая может быть измерена с помощью маркировки методике, описанной в настоящем документе. Кроме того, другие морфологические параметры, такие как общая длина дендритов, ветвления, дендритные формы позвоночника и плотность может быть определена количественно и изучены.

Использование флуоресцентной маркировки для изучения морфологии нейронов имеет много преимуществ по сравнению с более традиционными методами, которые опираются на яркие микроскопии области (например Гольджи окрашивание), поскольку он позволяет более высокое разрешение конфокальной микроскопии. Еще одним преимуществом использования DII как флуорофора в экспериментах, направленных на измерение плотности дендритных позвоночника и морфология является его липофильные свойства. DII перегородками на плазматической мембраны и обеспечивает также определены контуры нейронных процессов и дендритных выступов. Учитывая небольшой объем наиболее дендритных шипиков (менее 1 femtoliter), мембранного окрашивания является более эффективным и позволяет лучше визуализировать небольшие, тонкие выступы, чем цитоплазматические окрашивания.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI)	Invitrogen	D-282
Methylene chloride	Mallinckrodt Baker Inc.	H485-06
Tungsten beads	Bio-Rad	165-2269	1.7 μm diameter
Polyvinylpyrrolidone	Calbiochem	529504
Tefzel bullet tubing	Bio-Rad	165-2441
Tubing cutter	Bio-Rad	165-2422
Helios Gene Gun	Bio-Rad	165-2431
Isopore membrane filter paper	EMD Millipore	TSTP02500	3.0 μm pore size
ProLong Gold Antifade	Invitrogen	P36930
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	30525-89-4	(16% w/v)