Etichettatura DiOLISTIC di neuroni da roditori e non-umano Fette cervello dei primati

Summary

Dimostriamo l'uso della pistola gene di introdurre coloranti fluorescenti, come Dii, in neuroni in fettine di cervello di roditori e primati non umani di età diverse. In questo caso particolare, noi usiamo topi adulti (3-6 mesi) e adulti scimmie cynomologus (9-15 anni). Questa tecnica, originariamente descritta dal laboratorio del Dr. Lichtman (Gan

Abstract

Colorazione DiOLISTIC usa la pistola del gene per introdurre coloranti fluorescenti, come Dii, in neuroni di fette di cervello (Gan et al, 2009;. O'Brien e Lummis, 2007; Gan et al, 2000).. Qui fornire una descrizione dettagliata di ogni passo necessario insieme con le immagini esemplare di risultati buoni e cattivi che aiuteranno durante l'impostazione della tecnica. Nella nostra esperienza, a pochi passi dimostrato fondamentale per la corretta applicazione delle DiOLISTICS. Queste considerazioni sono la qualità del DII rivestite proiettili, il grado di esposizione fissativo, e la concentrazione di detersivo utilizzato nelle soluzioni di incubazione. Suggerimenti e soluzioni per i problemi più comuni sono forniti.

Questa è una tecnica di etichettatura versatile che può essere applicato a specie animali più a una vasta gamma di età. A differenza delle altre tecniche di marcatura fluorescente che sono limitati alle preparazioni di animali giovani o ristrette per topi perché si basano su l'espressione di un transgene fluorescente, l'etichettatura DiOLISTIC può essere applicato ad animali di ogni età, specie e genotipi e può essere utilizzato in combinazione con immunocolorazione per identificare una sottopopolazione di cellule. Qui mostriamo l'utilizzo di DiOLISTICS ai neuroni etichetta in fettine di cervello di topi adulti e adulti primati non umani con lo scopo di quantificare dendrite ramificazione dendritica e la morfologia della colonna vertebrale.

Protocol

1. Preparazione DII / Tungsteno Bead Bullets: DII (1-1'-Dioctadecyl-3, 3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato) proiettili devono essere preparati in anticipo di tagliare fettine di cervello. La procedura richiede circa 2-4 ore a seconda di quanti proiettili sono preparati in una volta.

1. Se a partire da un nuovo lotto di perline di tungsteno, preparare aliquote di 300 mg ciascuna. Aliquote sono preparati con la sospensione 6 grammi di tungsteno in 2 ml di cloruro di metilene. Poi, pipettare 100 l di soluzione tallone in tubi microcentrifuga per la produzione di aliquote di perle da 300 mg di tungsteno aliquote Conservare a temperatura ambiente (Nota: cloruro di metilene evapora con estrema rapidità alcol può essere utilizzato anche ridurre al minimo l'evaporazione)....
2. Quando a partire da aliquote di perline, risospendere ciascuna aliquota (300 perle di tungsteno mg) in 300 ml di cloruro di metilene e coprire rapidamente per evitare l'evaporazione. Questa quantità è sufficiente per 3 lotti di proiettili.
3. Preparare la soluzione colorante pesando 13,5 mg di lipofile DII colorante e aggiungendo 450 ml di cloruro di metilene (concentrazione finale = 3mg/100μl).
4. Rivestire le perline con colorante. Posizionare un vetrino su un pezzo di cera rivestite di carta pesano e pipettare 100 l di perline sul vetrino. Aggiungere 100 ml di soluzione Dii, mescolare accuratamente con puntale, e aria secca fino perle turno grigio chiaro.
5. Utilizzare una lama di rasoio per raschiare perline fuori dal vetrino e tagliare le perle in una polvere fine (Nota: utilizzare una nuova lama se facendo più di un colore di proiettili in modo da non contaminare coloranti)..
6. Perline raschiare sul peso perline di carta e imbuto in un tubo da 15 ml. Aggiungere 3 ml di acqua e sonicare a bagnomaria per 10-30 minuti a temperatura ambiente (Nota: dadi della polvere e sonicazione vengono applicati per minimizzare la formazione di grumi rivestito di perline che interromperà l'etichettatura sparse dei singoli neuroni)..

2. Preparazione polivinilpirrolidone (PVP) soluzione e tubazioni: per migliorare l'attaccamento tallone per il tubo proiettile (tubi TEZFEL), rivestimento con polivinilpirrolidone (PVP) soluzione.

1. Preparare 10 ml di soluzione di PVP in acqua ad una concentrazione di 10 mg PVP / ml.
2. Utilizzare una siringa da 12 ml con adattatore per tubi (tubi flessibili con diametro leggermente più grandi) per passare il PVP soluzione attraverso il tubo proiettile e poi espellerla fuori dall'altra parte. Riutilizzo soluzione per tubi cappotto più proiettile se diversi lotti sono preparati contemporaneamente. Scartare la soluzione PVP dopo l'uso.
3. Per aggiungere le perle al tubo proiettile, vortice le perle per produrre una soluzione omogenea e usare la siringa per tirare il tallone soluzione attraverso il tubo in modo che le microsfere sono equamente distribuiti in tutto il tubo. ((Nota:) cercano di minimizzare il numero di bolle d'aria nel tubo).
4. Far passare il tubo attraverso la stazione di preparazione e permettono di risolvere le perline. Usare la siringa per rimuovere delicatamente l'acqua in modo che solo le perline rimangono.
5. Spin il tubo nella stazione di preparazione e asciugare con azoto fino gocce d'acqua non sono più visibili. Questa fase dura circa 10-20 minuti.
6. Tagliare proiettili con taglierina tubi in 13 mm di lunghezza e il luogo in fiale di scintillazione contenenti Drierite o un qualche tipo di solfato di calcio anidro. Avvolgere in un foglio di fiale al riparo dalla luce.

3. Colorazione Dii: questa tecnica l'etichettatura può essere usata per colorare i neuroni nel tessuto cerebrale da specie diverse, in questo caso particolare, da topo (3-6 mesi) e primati non umani (9-15 anni).

E 'preferibile che le fette sono preparati dal tessuto cerebrale fisso ottenuto dalla perfusione transcardiac di soluzione fissativo perché la conservazione dei tessuti dovrebbe essere migliore in questa condizione. Tuttavia, la fissazione per perfusione non è sempre possibile (come è avvenuto con il tessuto scimmia) ed etichettatura DiOLISTIC può ancora essere applicata con successo in diverse procedure di preparazione dei tessuti. Qui si descrivono tre diverse procedure per la preparazione dei tessuti:

1. Fix per perfusione cerebrale transcardiac → rimuovere cervello → postfix per 10 min → fetta tagliata → macchia
2. Rimuovere cervello → blocco taglio del tessuto → blocco fissare → lavare in PBS → fetta tagliata → macchia
3. Togliere le fette tagliate cervello → → → fissare lavare → macchia

Nel presente studio, i cervelli di scimmia sono stati ottenuti da soggetti che sono stati transcardially perfusi con ghiaccio freddo artificiale fluido cerebro-spinale (ACSF) prima del raccolto del cervello e un blocco (4 mm di spessore) di tessuto che contiene il caudato uno° putamen è stata fissata per 60 minuti a temperatura ambiente. Per tutte le procedure, la soluzione fissativa contiene paraformaldeide 4% e il 4% di saccarosio in PBS (preparato fresco o usato entro 15 giorni). E 'importante notare che i tempi di fissazione sono fondamentali per la colorazione di successo. Overfixation può influenzare colorazione interrompendo l'integrità della membrana plasmatica e causando tintura a fuoriuscire dalla cellula (ulteriori informazioni in risultati).

1. Per la procedura a e b, fette (200μm) sono tagliati dal cervello fisso o il blocco dei tessuti e fette collocati in 24 pozzetti con PBS. Per la procedura c, fresche fette cerebrale acuta (200 micron) vengono tagliati con un vibratome taglio a freddo in soluzione contenente (in mm) 110 colina-Cl, 25 NaHCO _3, 1,25 NaH ₂ PO _4, 2.5 KCl, 0,5 CaCl _2, 7 MgCl _2, 25 di glucosio, 11,6 acido ascorbico, acido piruvico 3,1 (osmolarità mOsmols = 310) e subito dopo fette sono posti in piastre da 24 pozzetti e fissato per 30 minuti con la soluzione fissativa a temperatura ambiente.
2. Lavare le fette con PBS, 3 volte.
3. Prima di fette di tiro, togliere il PBS dai pozzi e, utilizzando un pennello, mettere la fetta al centro del pozzo.
4. Spara proiettili DII tramite carta 3,0 micron filtro con un sistema Helios Gun Gene a 120-180 psi di pressione del gas elio mettendo la pistola ad una distanza di 1,5 cm tra il campione e la fine della canna.
   (Nota importante:. Soltanto in neuroni nel raggio di 50 mm della superficie fetta saranno etichettati con questo metodo per cui è importante mantenere la stessa parte della fetta rivolto verso l'alto durante il lavaggio e per il montaggio in questo modo, si farà in modo che il neuroni marcati saranno a breve distanza focale quando l'imaging con un microscopio confocale).
5. Lavare le fette di 3 volte con PBS e memorizzarli in PBS per diverse ore per consentire al DII a diffondersi lungo i dendriti.
6. Montare le fette su un vetrino con Prolungare Antifade oro e coprire con un coprioggetto 18x18 millimetri No.1. (Nota: per c procedura, è meglio montare fette il giorno stesso l'integrità delle fette non è ben tenuto durante la notte).
7. Sigillare con smalto trasparente dopo il montaggio dei media si è asciugato.
8. In alternativa, le fette possono essere colorati con gli anticorpi prima di montare come descritto di seguito.
   (Nota: Le diapositive possono essere utilizzate da almeno 6 mesi a un anno se conservata al buio a 4 ° C. DII è leggero e sensibile esposizione a lungo termine alla luce provoca la macchia a svanire).

4. Colorazione anticorpale: immunocolorazione deve essere eseguita dopo passo 3.4 e prima del montaggio.

1. Permeabilizzazione: fette Incubare a 0,01% Triton X-100 in soluzione PBS per 15 minuti a temperatura ambiente (300-500 microlitri per pozzetto).
   NOTA: non utilizzare concentrazioni più elevate di detersivo come questa si dissolverà DII e ridurre significativamente la colorazione fluorescente. Cercare di minimizzare il tempo di detergente come incubazioni ampia ridurrà anche l'etichettatura DII. Se incubazioni estesi sono necessari, tenere le fette in PBS, piuttosto che a bloccare soluzione.
2. Blocco: fette Incubare a bloccare soluzione contenente siero di capra 10%, 0,01% Triton X-100 in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.
3. Anticorpo primario: Aggiungi anticorpo alla diluizione desiderata nella soluzione bloccante (coniglio ad esempio anticorpi anti-GFP in diluizione 1:1000). Aggiungere 300-500 microlitri per pozzetto e incubare per 1-2 ore. (Nota: se durante la notte sono incubazione necessario, togliere dal blocco soluzione detergente).
4. Lavare le fette con PBS per 5 - 15 min, 3 volte.
5. Anticorpo secondario: Incubare con anticorpo secondario per 30 minuti a temperatura ambiente. Preparare la soluzione secondaria di anticorpi alla diluizione desiderata nella soluzione bloccante (per esempio Alexa Fluor 488-coniugato a diluizione 1:1000).
6. Lavare le fette con PBS per 5-15 minuti, 4 volte.
7. Monte fette su vetrini con Prolungare Antifade oro e coprire con un coprioggetto 18x18 millimetri No.1. Sigillare con smalto dopo il montaggio dei media si è asciugato.

5. Rappresentante dei risultati:

1. Verifica della corretta etichettatura: sezione possono essere visualizzate in un ambito di applicazione fluorescente dissezione dotato di una lampada al mercurio e rosso fluorescente cubo filtro per confermare il successo di etichettatura DiOLISTIC. La figura 1 mostra le immagini di sezioni del cervello esemplare ben marcato ottenuto a basso ingrandimento. Due caratteristiche importanti per cercare un modello di etichettatura sono sparse (Figura 1A) e la capacità di identificare i singoli componenti cellulari (Figura 1B-C). L'etichettatura dei problemi DiOLISTIC: La figura 2 mostra esempi di sezioni in cui l'etichettatura DiOLISTIC lavorato in modo errato. Nella nostra esperienza, ci sono tre cause principali per l'etichettatura inefficiente:
   • Etichettatura è troppo rada o fitta: le cellule Pochissimi sono etichettati per sezione, in un caso o troppe cellule sono etichettati prevenire l'isolamento e lo studio dei singoli elementi cellulari. Soluzione: regolare la concentrazione di perline rivestito nella soluzione finale utilizzato per il rivestimento dei tubi proiettile TEFZEL (sezione 1.6). Diminuire o aumentare il volume di acqua (3 ml valore iniziale) utilizzato per sciogliere le perle al fine di correggere per l'etichettatura di troppo scarsa o troppo denso, rispettivamente. Inoltre, bassa efficienza di etichettatura potrebbe essere causato da meno di pressione del gas ottimale durante le riprese le perline rivestiti sulla sezioni. Questa possibilità può essere esclusa facendo in modo che il tubo proiettile TEFZEL ha rilasciato la maggior parte delle perle rivestito e appare chiaro dopo lo scatto. In caso contrario, la pressione del gas per le riprese dovrebbero essere aumentati.
   • Proiettili Bad: zolle di grandi dimensioni o gruppi di materie coloranti tungsteno rivestiti perle si formano durante la preparazione proiettile. Sezioni somiglierà esempi della Figura 2A-B. Soluzione: fare proiettili nuovo con particolare attenzione al punto 1.5 e / o estendere il tempo di sonicazione nella sezione 1.6.
   • Over-fissazione: il tessuto è mantenuto in soluzione paraformaldeide più a lungo del tempo in modo ottimale per il fissaggio (30 minuti di 200-300 micron sezioni, 1 ora per 4 sezioni mm). Questo compromette l'integrità della membrana plasmatica e produce sezioni etichettate che assomigliano a quelli mostrati nella figura 2C-D in cui l'etichettatura sembra fuori fuoco a causa della dispersione di colorante fuori delle cellule. Soluzione: ridurre i tempi di fissazione.
2. Confocale: pile immagini vengono acquisite utilizzando un microscopio confocale (Zeiss LSM 510 META) con un obiettivo 20x per tutta la cella e 63x obiettivo immersione in acqua per i segmenti di dendriti. Dii era eccitato con un DPS linea laser 561 nm e fluorescenza verde dal anticorpo secondario è stato eccitato con una linea di laser a 488 nm. Il sezionamento ottico del campione etichettato ottiene quando usando la microscopia confocale consente inoltre per l'isolamento di singole cellule marcate nel campione. Figura 3A mostra un striato neurone spinoso medio dal cervello di topo e il suo complesso disegno ramo dendrite. Immagini ad alto ingrandimento di rami dendrite di questi neuroni di roditori (Figura 3B) e primate non umano (Figura 3C) dimostrano il grado di colorazione in dendriti e spine dendritiche usando questa tecnica in entrambe le specie. Dendriti e le loro sporgenze (spine) appaiono ben definite, anche quando si considera la lunga e sottile colonna vertebrale teste così abbondante nei neuroni spinosi di media.
   
   Quando si combinano con DiOLISTICS immunostaining, l'imaging confocale è utile anche per localizzare in modo inequivocabile la macchia allo stesso piano focale e la stessa cella. Figura 4 mostra un esempio di colocalizzazione di DII etichettatura e immunocolorazione per GFP in una singola cella. L'immagine è una pila (0,7 micron z-sezione) ottenuto da una fetta striato da un topo transgenico che esprime la proteina fluorescente GFP sotto il promotore del recettore della dopamina D1.

Figura 1. Dii etichettatura dei neuroni in fettine di cervello di primati non umani. (A) a basso ingrandimento immagine di una fetta cervello colorato che contiene il nucleo caudato da una scimmia cynomolgus che mostra l'etichettatura sparse di neuroni con DII. (BC) Isolati neuroni spinosi medi possono essere facilmente identificati utilizzando un ambito fluorescente dissezione.

Figura 2. Risoluzione dei problemi di etichettatura DiOLISTIC. (AB) fette colorato da striato dorsale della scimmia (A) e mouse (B), che mostra grandi ciuffi di colorante rivestite perline e, di conseguenza, non i singoli elementi cellulari possono essere distinti. (CD) Le immagini che esemplificano il risultato dell'applicazione DiOLISTIC l'etichettatura di sezioni che sono stati tenuti in soluzione fissante per periodi prolungati di tempo o in cui la conservazione dei tessuti fallito scimmia (C) e mouse (D) dei tessuti.

Figura 3. Immagine confocale di neuroni spinosi striatali medio macchiata di DII. (A), serie di immagini di una cellula intera permette di analisi morfologica dei rami dendritici. (BC) segmenti Dendrite da mouse (B) e scimmie (C) neuroni spinosi di media mostrano una chiara etichettatura dei dendriti e spine.

Figura 4. Combinando l'etichettatura DiOLISTIC con immunocolorazione. (A) DII etichettati (B) immunocolorazione con l'utilizzo di anticorpi anti-GFP come descritto da metodi adattato da Lee et al. (2006). Stesso campo A. (C) immagine composita di rosso e di fluorescenza verde identifica DII-etichettato come un neurone GFP-positive neurone.

Discussion

Etichettatura DiOLISTIC è una delle tecniche più versatili disponibili per le cellule fluorescenti etichettatura perché può essere applicato a sezioni di tessuto da specie diverse, ad una vasta gamma di età, e di tessuti ottenuti fresche o da fissativo-perfuso animali (vedi anche Gan et al ., 2009). Il processo è relativamente veloce come ci vogliono 1-2 giorni e può essere combinato con altri approcci un'etichettatura più classici come immunocolorazione (Lee et al., 2006). Particolare attenzione deve essere prestata per evitare un eccesso di fissaggio e l'uso di alte concentrazioni di detergenti in soluzioni di incubazione perché questi comprenderà l'integrità delle membrane lipofile e causare il colorante a trapelare delle cellule. Penetrazione anticorpo può essere facilitata da basse concentrazioni di Triton X-100 (Lee et al., 2006), così come digitonina saponina o nella soluzione di incubazione (Matsubayashi et al., 2008). Alcune modifiche che possono essere applicati a questa tecnica includono l'uso di proiettili con coloranti diversi come descritto da Gan et al. (2000) o cambiare la lunghezza e il tipo di esposizione anticorpi (Neely et al., 2009).

Tradizionalmente, DII è stato utilizzato per tracciare le proiezioni dei neuroni nel cervello. Etichettatura DiOLISTIC espande la sua applicazione con la descrizione di un metodo utile per esaminare la morfologia cellulare. Morfologia neuronale è di grande interesse a causa della grande diversità trovano nel cervello e la speculazione che la forma delle cellule potrebbe riflettere sulla molteplicità funzione delle popolazioni neuronali del sistema nervoso. Un esempio di questo è il fatto che molti neuroni in sporgenza display del sistema nervoso dei mammiferi di piccole chiamato spine dendritiche, che sono il sito di sinapsi glutammatergica. In questo modo, la densità di sinapsi glutammatergica su una cella può essere correlata alla densità delle spine dendritiche, che può essere misurato utilizzando la tecnica di etichettatura qui descritti. Inoltre, altri parametri morfologici come dendrite lunghezza totale, modello di ramificazione, la forma della colonna vertebrale dendritica e la densità può essere quantificata e studiata.

L'uso di etichette fluorescenti per lo studio della morfologia neuronale ha molti vantaggi rispetto alle tecniche più tradizionali che si basano sulla microscopia in campo chiaro (es. colorazione di Golgi) perché permette di avere immagini ad alta risoluzione confocale. Un altro vantaggio di usare DII come fluoroforo in esperimenti volti a misurare la densità dendritica e la morfologia della colonna vertebrale è la sua proprietà lipofile. Partizioni Dii nella membrana plasmatica e fornisce un profilo ben definito dei processi neuronali e sporgenze dendritiche. Dato il piccolo volume della maggior parte delle spine dendritiche (meno di 1 femtoliter), marcatura di membrana più efficiente e permette una migliore visualizzazione di piccole, sottili protrusioni di colorazione citoplasmatica.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI)	Invitrogen	D-282
Methylene chloride	Mallinckrodt Baker Inc.	H485-06
Tungsten beads	Bio-Rad	165-2269	1.7 μm diameter
Polyvinylpyrrolidone	Calbiochem	529504
Tefzel bullet tubing	Bio-Rad	165-2441
Tubing cutter	Bio-Rad	165-2422
Helios Gene Gun	Bio-Rad	165-2431
Isopore membrane filter paper	EMD Millipore	TSTP02500	3.0 μm pore size
ProLong Gold Antifade	Invitrogen	P36930
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	30525-89-4	(16% w/v)