Summary
我们展示了基因枪的使用，引入神经元在不同年龄段的啮齿类动物和非人类灵长类动物的大脑切片的荧光染料，如直接投资收益，。在这种特殊情况下，我们使用成年小鼠（3-6个月以上）和成人cynomologus猴子（9-15岁）。这项技术，最初是由实验室博士李奇曼（甘
Abstract
DiOLISTIC染色采用基因枪，引入神经 元脑片（甘等人，2009年; O'Brien和Lummis，2007年，甘等，2000）。荧光染料，如直接投资收益，。在这里，我们提供了一个好的和坏的结果，这将有助于设立的技术，当模范的图像所需的每一步的详细说明。根据我们的经验，几步证明的成功应用DiOLISTICS的关键。这些考虑因素包括DII涂层子弹的质量，固定液暴露程度，和孵化解决方案中使用的洗涤剂浓度。提供提示和常见问题的解决。
这是一个多功能的标签技术，可以适用于广泛的年龄多种动物物种。 DiOLISTIC标签，准备从年轻的动物或限制，因为他们依靠一个荧光的转基因表达对小鼠与其他荧光标记技术，可以适用于所有年龄段，物种和基因型的动物，它可以结合使用免疫识别特定的细胞亚群。在这里，我们展示了使用标签神经元的DiOLISTICS量化枝蔓分支和树突棘形态的目的从成年小鼠和成人的非人类灵长类动物的大脑切片。
Protocol
1。应做好准备DII /钨珠子弹 ：DII（1 - 1' -双十八烷基- 3，3,3'，3' - tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐）子弹提前削减大脑切片。这个过程大约需要2-4小时一次准备多少子弹。
- 如果从一个新一批钨珠的开始，准备等份，每次300毫克。等分准备暂停钨6克，在2毫升二氯甲烷。然后，吸液管100μL到离心管珠的解决方案，以生产分装的300毫克钨珠在室温店等分（ 注 ：二氯甲烷蒸发速度非常快的酒精也可用于减少蒸发 。）。 。
- 当开始从珠等份，每等份（300毫克钨珠）重悬在300μL的二氯甲烷，快速和覆盖，以防止水分蒸发。这个数量是足够的3个批次的子弹。
- 准备重达13.5毫克的亲脂性染料DII和加入二氯甲烷450μL（终浓度=3mg/100μl）染料溶液。
- 沾上染料珠。一个载玻片上放置了一块蜡涂层纸张和吸液管100μL珠重达到幻灯片。加入100μLDII的解决方案，调匀使用枪头，空气干燥，直到珠转浅灰色。
- 用刀片刮去载玻片上的珠子和骰子珠成细粉（注 ：使用新的刀片，如果做一个以上的子弹，因此不会污染染料的颜色）。
- 到刮珠重达15 ml锥形管纸和漏斗珠。在室温为10-30分钟，加入3毫升的水，在水浴超声（ 注 ：粉和超声切割应用，以尽量减少涂珠，会破坏稀疏标签的单个神经元形成团块 ） 。
2。准备聚乙烯吡咯烷酮（PVP）解决方案和管 ：为了提高珠附件子弹管（TEZFEL管），聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的解决方案，它的外衣。
- 准备10毫升PVP水溶液中，在浓度10毫克PVP /毫升。
- 使用与管适配器12 ml注射器（软管直径略大）穿过的子弹管PVP的解决方案，然后驱逐出另一端。大衣更子弹管重用的解决方案，同时准备几批。使用后丢弃的PVP解决方案。
- 要添加珠子弹管，珠产生同质性的解决方案和使用的注射器，通过管子拉珠的解决方案，使珠均匀分布整个油管的旋涡。 （ 注：尽量减少管路中的气泡数量 ）。
- 通过预习站进油管和允许的珠子解决。使用的注射器，轻轻地去除水中的，因此，只有珠保持。
- 自旋准备站和干燥的氮气管，直到水滴不再可见。这一步将需要约10-20分钟。
- 管切割机切成13毫米长度和地方在闪烁瓶含有Drierite或某种无水硫酸钙的子弹。包装在保护光箔的小瓶。
3。 DII染色：这种标签技术可用于染色来自不同物种的脑组织中的神经元，在这个特殊的情况下，从鼠标（3-6月龄）和非人类灵长类动物（9-15岁）。
最好是切片获得transcardiac灌注固定液固定脑组织的准备，因为预计将在此条件下的最佳组织保存。然而，通过灌注固定并不总是可行的（如猴组织的情况下）和DiOLISTIC标签仍然可以成功地组织编制不同的程序下应用。在这里，我们描述了三个不同的程序组织编制：
- 修复transcardiac灌注大脑→大脑→后缀删除10分钟→切割片→染色
- 移除大脑→切成块状组织修复→块→洗的PBS→切割片→染色
- 移除大脑→切割片→修复→清洗→染色
在本研究中，猴子大脑获得transcardially，与冰冷的人工脑脊髓液（学联）前脑收获和组织块（4毫米厚的），含有尾一个灌注科目ND壳固定在室温为60分钟。对于所有的程序，固定液含有4％多聚甲醛和4％蔗糖PBS（准备新鲜或使用之日起15日内）。重要的是要注意，固定的时间是染色成功的关键。 Overfixation可以影响破坏质膜的完整性，造成泄漏的细胞（见结果下的更多信息）的染料染色。
- 对于程序A和 B，被切断，从固定的脑组织块和切片置于24孔板用PBS片（200微米） 。对于程序 C，新鲜急性脑切片（200微米），切断与一个冷切割解决方案vibratome（毫米）110胆碱CL，25 碳酸氢钠 3，1.25的NaH 2 PO 4 0.5，2.5氯化钾，氯化钙，7氯化镁2，25葡萄糖，抗坏血酸11.6，3.1丙酮酸（渗透压= 310 mOsmols）和后，立即片放置在24孔板和固定固定液在室温为30分钟。
- 洗净切片，用PBS 3次。
- 拍摄前片，从水井中删除的PBS，用画笔，地点以及中心的切片。
- DII子弹射穿3.0微米的过滤器使用一个赫利俄斯基因枪系统文件放置在一个1.5厘米之间的样品和年底的每桶的距离的枪在120-180 PSI氦气压力。
（注意 ：只有50毫米的片表面内神经元将标记用这种方法，所以重要的是保持在清洗和安装朝上片相同的一面，这样 ，您将确保标记神经元时，将焦距内共聚焦显微镜成像） 。 - 洗片3次，用PBS和存储几个小时，他们在PBS让DII沿着树突传播。
- 到载玻片延长Gold抗淬灭山片和一个18 × 18毫米的第一盖玻片覆盖。 （ 注：程序C，最好是安装在同一天切片切片的完整性没有很好地维持隔夜） 。
- 安装后，媒体的透明指甲油密封干燥。
- 另外，片可与抗体染色，在安装前，如下所述。
（ 注：幻灯片，可以使用至少6个月到一年，如果在黑暗中储存在4 ° C. DII是光敏感和长期暴露在光线下会导致色斑，褪色） 。
4。抗体染色：免疫染色步骤3.4后，在安装前应进行。
- 通透：孵育切片在0.01％的Triton X - 100的PBS在室温下15分钟（每孔300-500微升）解决方案。
注意：不要使用较高浓度的清洁剂，因为这将解散DII和显着降低荧光染色。尽量减少洗涤剂中的广泛孵化也将减少DII标签。如果延长孵化是必要的，而不是保持在PBS片阻塞的解决方案。 - 阻塞：在含10％山羊血清封闭液孵育切片，在PBS的0.01％的 Triton X - 100在室温为30分钟。
- 主要抗体：添加所需的阻塞解决方案（如兔抗GFP抗体1:1000稀释）稀释抗体。每孔加入300-500μL孵育1-2小时。 （ 注 ：如果隔夜孵化是必要的，封闭液中删除洗涤剂 ） 。
- 切片用PBS清洗5 - 15分钟，3倍。
- 二次抗体与二级抗体在室温下30分钟的孵育。准备好所需的封闭液稀释（如Alexa的福陆公司的488标记的抗体1:1000稀释）二次抗体溶液。
- 洗净切片用PBS为5-15分钟，4次。
- 幻灯片片山延长Gold抗淬灭，并覆盖18 × 18毫米第一盖玻片。用指甲油密封安装后，媒体已经干涸。
5。代表性的成果：
- 正确的标签检查 ：部分可以配备一个水银灯泡和红色荧光过滤立方体确认成功DiOLISTIC标签下的荧光解剖范围的可视化。图1显示了在低倍率得到很好的标记大脑部分的模范形象。寻找的两个重要特征是稀疏的标签模式（图1A）和识别能力，个人的细胞成分（图1B - C）。 故障排除DiOLISTIC标签 ：图2显示部分的例子DiOLISTIC标签不正确的工作。根据我们的经验，为低效的标签有三个主要原因：
- 标签过于稀疏或密集 ：在一种情况下，极少数细胞标记每节，或过多的脑细胞被标记为防止单细胞成分的分离和研究。解决方案：调整用于涂料TEFZEL子弹油管（1.6节）的最终解决方案的包被的磁珠浓度。减少或增加体积的水用来溶解的珠子，以正确的过疏或太密的标签（3毫升的初始值），分别。此外，可能会造成低效率的标签不到最佳的气体压力时拍摄到的部分涂珠。确保TEFZEL子弹油管已发布的涂层珠的大部分区域，并出现清晰的拍摄后，这种可能性可以排除。否则，拍摄的气体压力应增加。
- 坏子弹 ：子弹准备过程中形成大的团块或染料涂层的钨珠集群。路段将类似于图2A - B的例子。解决方案：新的子弹，要特别注意第1.5和/或超声时间延长1.6节。
- 在固定 ：组织多聚甲醛溶液中保存的时间比优化所需的时间固定为200-300微米的部分（30分钟，1小时4毫米）。这种妥协质膜的完整性，并产生标记的部分看起来像图2C - D所示的标签似乎重点由于染料分散细胞。解决方案：减少固定时间。
- 共焦成像：图像堆栈收购共聚焦显微镜（蔡司LSM 510 META）使用20倍的目标与整个细胞和枝蔓段63X水浸泡的目的。 DII从二级抗体的存保计划的561 nm激光线和绿色荧光，使用488 nm激光线很兴奋很兴奋。使用共聚焦显微镜时取得的标记样品的光学切片进一步允许单标记细胞样品中的隔离。图3A显示了从小鼠大脑和复杂的树突分支模式的纹状体中刺神经。这些神经元的树突分支从啮齿类动物（图3B）和非人类灵长类动物（图3C）的高倍率图像证明树突和树突棘，使用这种技术在这两个物种在染色的程度。树突和突起（棘）出现良好定义的，即使考虑到长，薄的脊柱元首如此丰富的中型刺神经元。
与免疫相结合DiOLISTICS时，共焦成像，也有利于明确本地化污渍同一焦平面和相同的细胞。图4显示了一个DII的标签，在单细胞绿色荧光蛋白的免疫共定位的例子。该图像是一个栈（Z -节0.7微米）从下D1多巴胺受体启动子的荧光蛋白GFP表达的转基因小鼠的纹状体切片获得的。
图1。 DII的神经元在非人类灵长类动物的大脑切片的标签。 （一）低倍率影像显示稀疏DII的神经元标签从食蟹猴，尾状核的大脑包含了染色片（BC）的隔离介质刺神经元可以很容易地用荧光解剖范围确定。
图2。故障排除DiOLISTIC标签。从背侧纹状体的猴子（A）和鼠标染色片（AB），（b）显示的染料涂层珠子的大团块，作为一个后果，没有个别的细胞成分可以区分（CD）的图像，体现了申请DiOLISTIC标签，在保持长时间的时间或地方组织保存的固定液的部分失败的猴子（C）和鼠标（四）组织。
图3。刺的纹状体中神经元的共焦影像与DII染色 。 （一），整个细胞图像堆栈允许树突分支的形态分析。（BC）枝晶段（二）从小鼠和猴（三）中等刺神经元枝蔓和棘明确标示。
图4。结合免疫DiOLISTIC标签。 （一）DiI标记
Discussion
DiOLISTIC标签是最通用的技术可用于细胞荧光标签之一，因为它可以从不同的物种的组织切片，广泛的年龄，和组织获得新鲜或从固定液灌注动物（见也甘等，2009）。这个过程是比较快的，因为它需要1-2天，它可以与其他更经典的标签的方法，如免疫（Lee 等 ，2006）相结合。特别应重视避免过度固定和孵化解决方案使用高洗涤剂浓度，因为这些将包括的亲脂膜的完整性，并导致染料泄漏的细胞。低浓度促进抗体的渗透可以通过TRITON X - 100（Lee 等 ，2006），以及毛地黄皂苷或皂苷洗液（松林等，2008）。这种技术可以应用到的一些修改，包括与甘等人（2000）或改变抗体曝光（ 尼利等，2009）的长度和类型的多个染料使用的子弹。
传统上，DII已经用于跟踪在大脑中的神经元的预测。 DiOLISTIC标签扩展描述一个有用的方法来研究细胞的形态及其应用。极大的兴趣，因为在大脑中发现的大型多样性和猜测，细胞的形状可能反映在中枢神经系统的神经元群体的功能多重的神经元的形态。这样的一个例子是，事实上，在许多哺乳动物的中枢神经系统显示的小突起神经元称为树突棘是谷氨酸突触的网站。通过这种方式，可以到一个细胞的谷氨酸突触的密度相关的树突棘密度，使用此处所述的标记技术，可以测量。此外，如树突总长度，分枝格局，树突棘的形状和密度等形态参数可量化和研究。
使用荧光标记，为研究神经元的形态有许多优点相比，更多的传统技术依赖亮视野显微镜（如高尔基染色），因为它允许更高的分辨率共焦成像。使用DII作为一个旨在测量树突棘密度的实验中的荧光团和形态的另一个优点是其亲脂性的属性。 DII到质膜分区，并提供一个明确界定的神经元突起和树突状突起的轮廓。鉴于大多数树突棘（小于1 femtoliter）体积小，染色膜是更有效的，并允许更好的可视化小，薄的突起比胞质染色。
Disclosures
NIAAA和俄勒冈国家灵长类动物研究中心的动物护理和使用委员会的指导，所有动物的程序进行。作者们没有透露。
Acknowledgments
我们要感谢他们的协助迈克尔Feyder和特雷尔霍洛威在初始设置的技术和二三大野博士的实验室，他们共聚焦显微镜的访问。这项研究是由美国国立卫生研究所通过NIAAA和NINDS壁间方案。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI) | Invitrogen | D-282 | |
| Methylene chloride | Mallinckrodt Baker Inc. | H485-06 | |
| Tungsten beads | Bio-Rad | 165-2269 | 1.7 μm diameter |
| Polyvinylpyrrolidone | Calbiochem | 529504 | |
| Tefzel bullet tubing | Bio-Rad | 165-2441 | |
| Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | |
| Helios Gene Gun | Bio-Rad | 165-2431 | |
| Isopore membrane filter paper | EMD Millipore | TSTP02500 | 3.0 μm pore size |
| ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | (16% w/v) |
References
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