Summary
אנו מדגימים את השימוש באקדח הגן להציג צבעי ניאון, כגון DiI, לתוך הנוירונים פרוסות המוח של מכרסמים פרימטים שאינם בני אדם בגילאים שונים. במקרה הספציפי הזה, אנו משתמשים בעכברים בוגרים (3-6 חודשים) וקופים cynomologus מבוגר (9-15 שנים). טכניקה זו, שתוארה לראשונה על ידי במעבדה של ד"ר ליכטמן (גן
Abstract
מכתים DiOLISTIC משתמש באקדח הגן להציג צבעי ניאון, כגון DiI, לתוך הנוירונים של פרוסות המוח (גן et al, 2009;. אובריין Lummis, 2007; גן et al, 2000).. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של כל צעד נדרש יחד עם תמונות למופת של תוצאות טובות ורעות, שיסייע בעת הגדרת את הטכניקה. מניסיוננו, כמה צעדים הוכיח קריטי עבור יישום מוצלח של DiOLISTICS. שיקולים אלה כוללים את איכות DiI מצופים גומי, היקף החשיפה מקבע, ואת הריכוז של חומר הניקוי המשמשים את פתרונות הדגירה. טיפים ופתרונות לבעיות נפוצות מסופקים.
זוהי טכניקה תיוג צדדי כי ניתן להחיל על בעלי חיים מרובים בו מגוון רחב של גילאים. שלא כמו אחרים בטכניקות תיוג פלורסנט כי מוגבלים ההכנות של בעלי חיים צעירים או מוגבלת עכברים, כי הם מסתמכים על הביטוי של transgene ניאון, תיוג DiOLISTIC ניתן להחיל על בעלי חיים מכל הגילאים, המינים גנוטיפים וזה יכול להיות בשילוב עם immunostaining לזהות subpopulation מסוימים של תאים. כאן אנו מדגימים את השימוש DiOLISTICS לנוירונים התווית פרוסות המוח של עכברים בוגרים ומבוגרים שאינם בני אדם פרימטים במטרה לכימות דנדריט הסתעפות ומורפולוגיה עמוד השדרה הדנדריטים.
Protocol
1. הכנת DiI / Tungsten כדורים ביד: DiI (1-1'-Dioctadecyl-3, 3,3 ", 3'-tetramethylindocarbocyanine פרכלורט) הכדורים צריכים להיות מוכנים מראש של חיתוך פרוסות המוח. ההליך אורך כ 2-4 שעות, תלוי כמה כדורים מוכנים בבת אחת.
- אם החל אצווה חדשה של חרוזים טונגסטן, להכין aliquots של 300 מ"ג כל אחד. Aliquots מוכנים ידי השעיית 6 גרם של טונגסטן ב 2 מ"ל של מתילן כלוריד. ואז, פיפטה 100 μl של פתרון חרוז לתוך צינורות microfuge לייצר aliquots של 300 חרוזים טונגסטן מ"ג aliquots חנות בטמפרטורת החדר (הערה: מתילן כלוריד מתאדה מהר מאוד אלכוהול יכול לשמש גם למזער את התאדות)....
- כאשר החל aliquots של חרוזים, resuspend כל aliquot (300 טונגסטן חרוזים מ"ג) ב 300 μl של מתילן כלוריד ולכסות במהירות על מנת למנוע אידוי. כמות זו מספיקה 3 קבוצות של כדורים.
- הכן פתרון לצבוע ידי במשקל 13.5 מ"ג DiI לצבוע lipophilic והוספת 450 μl של מתילן כלוריד (הריכוז הסופי = 3mg/100μl).
- מעיל החרוזים עם צבע. המקום שקופיות הזכוכית על פיסת שעווה מצופה לשקול נייר פיפטה 100 μl של חרוזים לשקופית. הוסף 100 μl של פתרון DiI, ומערבבים היטב בעזרת קצה פיפטה, והאוויר יבש עד חרוזים להפוך אפור בהיר.
- השתמש סכין גילוח לגרד את החרוזים שקופיות הזכוכית הקוביות חרוזים לאבקה דקה (הערה: השימוש להב חדש אם עושים יותר מצבע אחד של כדורים כדי לא לזהם צבעים)..
- חרוזים לגרד אל לשקול חרוזי נייר משפך לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. הוסף 3 מ"ל מים sonicate באמבט מים במשך 10-30 דקות בטמפרטורת החדר (הערה: חיתוך של אבקת ואת sonication מוחלים כדי לצמצם את היווצרות גושים של חרוזים מצופים כי ישבש את תיוג דלילה של נוירונים בודדים)..
2. הכנת polyvinylpyrrolidone (PVP) פתרון צינורות: כדי לשפר מצורף חרוז אל צינורות הכדור (צינורות TEZFEL), מעיל עם פתרון (PVP) polyvinylpyrrolidone.
- הכן 10 מ"ל של תמיסת PVP במים בריכוז של 10 מ"ג PVP / מ"ל.
- השתמש מזרק 12 מ"ל עם מתאם צינור (צינור גמיש בקוטר מעט גדול יותר) כדי להעביר את פתרון PVP דרך צינורות את הכדור ואז לגרש אותו החוצה את הקצה השני. שימוש חוזר פתרון צינורות מעיל כדור יותר אם כמה קבוצות מוכנים בו זמנית. בטל פתרון PVP לאחר השימוש.
- כדי להוסיף את החרוזים על צינורות הכדור, המערבולת חרוזים לייצר פתרון אחיד להשתמש במזרק למשוך את הפתרון חרוז דרך צינורות כך חרוזים מפוזרים באופן שווה על פני הצינור. ((הערה:) מנסה לצמצם את מספר בועות אוויר בצינור).
- להאכיל את צינורות דרך תחנת הכנה ולאפשר החרוזים להתיישב. השתמש במזרק כדי להסיר בעדינות את המים כך שרק החרוזים להישאר.
- ספין בצינור בתחנת הכנה ויבש עם גז חנקן עד טיפות מים הם כבר לא נראים לעין. צעד זה ייקח כ 10-20 דקות.
- חותכים כדורים עם חותך צינורות באורכים לתוך 13 מ"מ ומניחים צלוחיות scintillation המכיל Drierite או סוג כלשהו של סידן גופרתי נטול מים. עוטפים בנייר כסף צלוחיות כדי להגן מפני אור.
3. מכתים DiI: טכניקה זו תיוג יכול לשמש כתם נוירונים ברקמת המוח ממינים שונים, במקרה המסוים הזה, של העכבר (06/03 בן חודש) ולא אנושי פרימטים (9-15 שנים).
עדיף פרוסות מוכנים מרקמת המוח קבועים מתקבל על ידי זלוף transcardiac הפתרון קובע כי שימור רקמת צפוי להיות הטוב ביותר בתנאי זה. עם זאת, קיבעון על ידי זלוף לא תמיד אפשרי (כמו במקרה עם רקמת הקוף) וסימון DiOLISTIC עדיין יכול להיות מיושם בהצלחה תחת הליכים שונים להכנת רקמה. כאן אנו מתארים שלושה הליכים שונים להכנת רקמה:
- תקן המוח על ידי זלוף transcardiac → להסיר המוח → Postfix עבור 10 דקות → פרוסה לחתוך → כתם
- הסר המוח → לחסום לחתוך רקמות → לחסום לתקן → להתרחץ פרוסה → לחתוך PBS → כתם
- הסר המוח → לחתוך פרוסות לתקן → → → לשטוף כתם
במחקר הנוכחי, מוח הקוף התקבלו נושאים שהיו perfused transcardially עם נוזל קר קרח מלאכותי השדרה מוחין (ACSF) לפני הקציר המוח בלוק (4 מ"מ עובי) של רקמה המכילה את caudatend putamen היה קבוע עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר. במשך כל ההליכים, כולל פתרון מקבע paraformaldehyde 4% ו 4% סוכרוז PBS (מוכן טרי או בשימוש בתוך 15 ימים). חשוב לציין כי פעמים קיבעון הם קריטיים עבור מכתים מוצלח. Overfixation יכול להשפיע מכתים ידי לשבש את שלמותו של קרום התא וגורמים לצבוע לדלוף אל מחוץ לתא (ראו מידע נוסף תחת תוצאות).
- במשך הליך a ו-b, פרוסות (200μm) נחתכים מהמוח קבוע או לחסום רקמות פרוסות להציב צלחת 24 היטב עם PBS. במשך הליך ג, טרי פרוסות המוח חריפה (200 מיקרומטר) נחתכים עם vibratome בתמיסה המכילה חיתוך קר (מ"מ) 110 כולין-Cl, 25 NaHCO 3, 1.25 לאא 2 PO 4, 2.5 KCl, 0.5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 25 גלוקוז, 11.6 חומצה אסקורבית, חומצה 3.1 pyruvic (osmolarity = 310 mOsmols) ומיד לאחר פרוסות ממוקמים 24 גם צלחות קבוע למשך 30 דקות עם פתרון מקבע בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את פרוסות עם PBS, 3 פעמים.
- לפני פרוסות ירי, להסיר את PBS מן הבארות, באמצעות מכחול, במקום פרוסה במרכז הבאר.
- לירות כדורים DiI דרך נייר הסינון 3.0 מיקרומטר באמצעות הליוס Gun מערכת ג'ין בלחץ psi 120-180 גז הליום על ידי הצבת את האקדח במרחק של 1.5 ס"מ בין המדגם לבין סוף החבית.
(הערה חשובה:. נוירונים רק בתוך 50 מ"מ משטח פרוסה יהיה מסומן בשיטה זו ולכן חשוב לשמור על אותו צד של הפרוסה כלפי מעלה במהלך שוטף ועל הרכבה בדרך זו, תוכלו לוודא כי נוירונים שכותרתו תהיה במרחק המוקד כאשר הדמיה במיקרוסקופ confocal). - לשטוף עם פרוסות PBS 3 פעמים לאחסן אותם PBS למשך מספר שעות כדי לאפשר DiI להתפשט לאורך הדנדריטים.
- הר פרוסות לשקופית זכוכית עם להאריך Antifade זהב ומכסים מ"מ 18X18 מס '1 coverslip. (הערה: עבור c ההליך, עדיף לעלות פרוסות ביום זהה את תקינות של פרוסות אינו מטופח לילה).
- חותם עם לק ברור אחרי התקשורת הרכבה התייבש.
- לחלופין, פרוסות ניתן מוכתם נוגדנים לפני הרכבה כמתואר להלן.
(הערה: שקופיות יכול לשמש לפחות 6 חודשים עד שנה, אם מאוחסנים בחושך ב 4 ° C. DiI הוא רגיש חשיפה ארוכת טווח לאור לאור תגרום כתם לדהות).
4. מכתים נוגדן: Immunostaining צריכה להתבצע אחרי צעד 3.4 ולפני הרכבה.
- Permeabilization: פרוסות דגירה של 0.01% Triton X-100 בפתרון PBS במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (300-500 μl לכל היטב).
הערה: אין להשתמש בריכוזים גבוהים של חומר ניקוי כמו זה יהיה לפזר DiI ו להפחית באופן משמעותי את מכתים ניאון. נסו לצמצם את זמן ניקוי כמו incubations נרחב גם תקטין את תיוג DiI. אם incubations המורחבת יש צורך לשמור על פרוסות PBS ולא חוסמים פתרון. - חסימה: פרוסות מדגירים את חסימת תמיסה המכילה סרום עיזים 10%, 0.01% Triton X-100 ב PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- הנוגדן העיקרי: הוסף נוגדן בדילול הרצוי הפתרון חוסם (למשל אנטי GFP ארנבת הנוגדן בדילול 1:1000). הוסף μl 300-500 דולר היטב דגירה של 1-2 שעות. (הערה: אם incubations לילה נחוצים, להסיר חומר ניקוי מחסימת פתרון).
- לשטוף עם פרוסות PBS עבור 5-15 דקות, 3 פעמים.
- נוגדנים משני: דגירה עם נוגדנים משני למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הכן פתרון נוגדנים משני בדילול הרצוי פתרון חסימה (למשל Alexa-פלואוריד 488 נוגדן מצומדות בדילול 1:1000).
- לשטוף עם פרוסות PBS עבור 5-15 דקות, 4 פעמים.
- הר פרוסות בשקופיות עם להאריך Antifade זהב ומכסים 18x18 מ"מ מס '1 coverslip. חותם עם לק אחרי התקשורת הרכבה התייבש.
5. נציג תוצאות:
- בדיקת תיוג נכון: סעיף ניתן דמיינו תחת בהיקף לנתח פלורסנט מצויד מנורת כספית אדום קוביה המסנן ניאון כדי לאשר תיוג DiOLISTIC מוצלח. איור 1 מציג תמונות למופת של חלקים במוח הנקרא יפה שהושגו בהגדלה נמוכה. שני המאפיינים החשובים לחפש הם דפוס תיוג דלילה (איור 1A) ואת היכולת לזהות מרכיבים תאיים בודדים (איור 1 ב-C). תיוג בעיות DiOLISTIC: איור 2 מציג דוגמאות של חלקים בו תיוג DiOLISTIC עבד כראוי. מניסיוננו, ישנן שלוש סיבות עיקריות תיוג לא יעיל:
- תיוג היא דלילה מדי או צפוף: תאים מעטים מסומנים לכל סעיף במקרה אחד או יותר מדי תאים מסומנים למנוע את הבידוד מחקר של אלמנטים סלולרית אחת. הפתרון: להתאים את הריכוז של חרוזים מצופים הפתרון הסופי משמש לציפוי צינורות כדור TEFZEL (סעיף 1.6). להחליש או להגביר את עוצמת הקול של מים (3 מ"ל ערך ראשוני) משמש כדי לפזר את החרוזים כדי לתקן תיוג דלילה מדי או צפוף מדי, בהתאמה. בנוסף, יעילות נמוכה של תיוג עלול להיגרם על ידי פחות לחץ הגז אופטימלי כאשר הירי חרוזים מצופים על הסעיפים. אפשרות זו ניתן לשלול על ידי לוודא כי צינורות כדור TEFZEL פרסמה את רוב חרוזים מצופים ונראה ברור לאחר הירי. אחרת, לחץ הגז לירי צריכה להיות מוגברת.
- כדורי רע: גושים גדולים או קבוצות של צבע מצופה חרוזים טונגסטן נוצרות במהלך הכנת כדור. מדורים ידמה דוגמאות באיור 2A-B. הפתרון: להפוך את הכדורים החדשים תשומת לב מיוחדת בסעיף 1.5 ו / או להאריך את זמן sonication בסעיף 1.6.
- Over-קיבעון: רקמה נשמר פתרון paraformaldehyde למשך זמן ארוך יותר מאשר הזמן הנדרש בצורה אופטימלית לתיקון (30 דקות עבור סעיפים 200-300 מיקרומטר, 1 שעה 4 חלקים מ"מ). זה פשרות על שלמותה של הממברנה פלזמה ומייצרת חלקים שכותרתו שנראים כמו אלה שמוצג באיור 2C-D בו תיוג נראה מתוך התמקדות עקב פיזור של צבע מתוך התאים. הפתרון: לצמצם את זמן קיבוע.
- הדמיה Confocal: ערימות תמונה נרכשים באמצעות מיקרוסקופ confocal (Zeiss LSM 510 META) במטרה 20x עבור התא כולו ואובייקטיבי 63x טבילה במים עבור מגזרים דנדריט. DiI התרגש באמצעות לייזר DPS 561 ננומטר קו פלואורסצנטי ירוק נוגדן המשני היה נרגש באמצעות לייזר קו 488 ננומטר. חתך אופטי של המדגם שכותרתו כאשר מושגת באמצעות מיקרוסקופיה confocal נוספת מאפשרת בידוד של תאים שכותרתו יחיד במדגם. איור 3A מראה בינוני striatal קוצני הנוירון מהמוח העכבר ענף הדפוס המורכב שלה דנדריט. תמונות בהגדלה גבוהה של ענפים דנדריט של הנוירונים האלה מן מכרסם (איור 3B) והלא אנושי הפרימטים (איור 3 ג) להוכיח את מידת מכתים ב דנדריטים הקוצים הדנדריטים באמצעות טכניקה זו של שני המינים. דנדריטים בליטות שלהם (עמוד השדרה) מופיעים מוגדרים היטב, גם כאשר בוחנים את עמוד השדרה ארוך, דק ראשים בשפע כה בנוירונים קוצני בינוני.
כאשר שילוב DiOLISTICS עם immunostaining, הדמיה confocal גם לסייע באופן חד משמעי localizing הכתם למישור המוקד באותו התא אותו. איור 4 מראה דוגמה של colocalization DiI תיוג immunostaining עבור GFP בתא בודד. התמונה היא ערימה אחת (0.7 מיקרומטר Z-פסקה) המתקבל פרוסת striatal מתוך עכבר מהונדס המבטא את ה-GFP חלבון פלואורסצנטי תחת האמרגן D1 קולטן דופמין.
באיור 1. DiI תיוג של נוירונים פרוסות המוח של פרימטים לא אנושיים. (א) התמונה בהגדלה נמוכה פרוסת המוח מוכתם המכיל את גרעין caudate מהקוף cynomolgus שמראה תיוג דלילה של נוירונים עם DiI. (BC) מבודד קוצני נוירונים בינוני ניתן לזהות בקלות באמצעות היקף הניתוחים ניאון.
איור 2. תיוג DiOLISTIC פתרון בעיות. (AB) פרוסות ויטראז מ בסטריאטום הגבי של קוף (A) ועכבר (B) מראה גושים גדולים של צבע מצופה חרוזים וכתוצאה מכך, אין אלמנטים הסלולר בודדים ניתן להבחין. (CD) תמונות המדגימים את התוצאה של החלת DiOLISTIC תיוג סעיפים אשר הוחזקו פתרון מקבע לתקופות ממושכות של זמן או מקום לשימור רקמות נכשל קוף (C) ועכבר (ד) רקמות.
איור 3. Confocal תמונה של striatal בינוני קוצני נוירון מוכתם DiI. (א), מחסנית מקדימה של תא שלם מאפשרת ניתוח מורפולוגי של הסניפים הדנדריטים. (BC) קטעים דנדריט של העכבר (B) קוף (C) נוירונים קוצני בינוני להראות סימון ברור של דנדריט ואת עמוד השדרה.
איור 4. שילוב תיוג DiOLISTIC עם immunostaining. (א) שכותרתו DiI
Discussion
תיוג DiOLISTIC הוא אחד המגוונים ביותר טכניקות זמין עבור התאים fluorescently תיוג כי זה יכול להיות מיושם על חלקים רקמות ממינים שונים, למגוון רחב של גילאים, וכדי להשיג רקמה טרי או מקבע-perfused בעלי חיים (ראה גם גן ואח' . 2009). התהליך הוא מהיר יחסית כמו זה לוקח 1-2 ימים וזה יכול להיות בשילוב עם גישות אחרות תיוג קלאסיים יותר כגון immunostaining (Lee et al. 2006). תשומת לב מיוחדת צריך להיות משולם להימנע על תיקון ושימוש ריכוזי חומר ניקוי גבוה פתרונות הדגירה כי אלה יהוו את שלמות הממברנה lipophilic ולגרום לצבוע לדלוף של התאים. חדירה נוגדן יכול להיות בהנחייתם של ריכוזים נמוכים של טריטון X-100 (Lee et al., 2006), כמו גם digitonin או saponin בפתרון הדגירה (Matsubayashi et al. 2008). כמה שינויים כי ניתן ליישם טכניקה זו כוללות את השימוש בכדורי עם צבעים מרובים כפי שתואר על ידי גן et al. (2000) או לשנות את אורך וסוג החשיפה נוגדן (Neely et al. 2009).
באופן מסורתי, DiI נעשה שימוש כדי להתחקות אחר תחזיות העצבית במוח. תיוג DiOLISTIC מרחיבה את היישום שלה באמצעות תיאור שיטה שימושית לבדיקת מורפולוגיה התא. מורפולוגיה העצבית מעוררת עניין רב בשל המגוון הגדול נמצא המוח ספקולציות כי צורת התא יכול לחשוב על ריבוי פונקציה של אוכלוסיות נוירונים במערכת העצבים. אחת הדוגמאות לכך היא העובדה כי נוירונים רבים בליטה יונקים מערכת העצבים להציג קטן בשם הקוצים הדנדריטים כי הם באתר של סינפסות glutamatergic. בדרך זו, צפיפות של סינפסות glutamatergic על תא יכול להיות בקורלציה לצפיפות של הקוצים הדנדריטים, אשר ניתן למדוד באמצעות טכניקה תיוג המתוארים כאן. יתר על כן, פרמטרים מורפולוגיים אחרים כגון האורך הכולל דנדריט, דפוס הסתעפות בצורת עמוד השדרה הדנדריטים וצפיפות ניתן לכמת ולמד.
השימוש תיוג פלורסנט לחקר המורפולוגיה העצבית יש יתרונות רבים לעומת טכניקות מסורתיות יותר המסתמכים על מיקרוסקופ שדה בהיר (למשל מכתים Golgi) כי זה מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה confocal. יתרון נוסף של השימוש DiI כמו fluorophore בניסויים שמטרתם מדידת צפיפות עמוד השדרה הדנדריטים ומורפולוגיה הוא lipophilic המאפיינים שלה. מחיצות DiI לתוך הממברנה פלזמה ומספק מתאר מוגדרים היטב של תהליכים עצביים ועל בליטות הדנדריטים. לאור הנפח הקטן של הקוצים הדנדריטים ביותר (פחות מ 1 femtoliter), מכתים קרום הוא יעיל יותר ומאפשר ראיה טובה יותר, דק יותר מאשר בליטות קטנות מכתים cytoplasmic.
Disclosures
הנהלים כל חיה בוצעו בעקבות הדרכה טיפול בבעלי חיים ועדת השתמש ב NIAAA ואת הלאומית אורגון מרכז מחקר הפרימאטים. המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות מיכאל Feyder ו טרל הולוויי על סיועם במהלך ההגדרה הראשונית במעלה של טכניקת מעבדה ד"ר פומי של אונו עבור גישה אל מיקרוסקופ confocal שלהם. מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב באמצעות תוכנית עירונית של NIAAA ו NINDS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI) | Invitrogen | D-282 | |
| Methylene chloride | Mallinckrodt Baker Inc. | H485-06 | |
| Tungsten beads | Bio-Rad | 165-2269 | 1.7 μm diameter |
| Polyvinylpyrrolidone | Calbiochem | 529504 | |
| Tefzel bullet tubing | Bio-Rad | 165-2441 | |
| Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | |
| Helios Gene Gun | Bio-Rad | 165-2431 | |
| Isopore membrane filter paper | EMD Millipore | TSTP02500 | 3.0 μm pore size |
| ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | (16% w/v) |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOLISTIC" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harb Protoc. , pdb.prot5202-pdb.prot5202 (2009).
- Grutzendler, J., Tsai, J., Gan, W. B. Rapid labeling of neuronal populations by ballistic delivery of fluorescent dyes. Methods. 30, 79-85 (2003).
- Lee, K. W., Kim, Y., Kim, A. M., Helmin, K., Nairn, A. C., Greengard, P. Cocaine-induced dendritic spine formation in D1 and D2 dopamine receptor-containing medium spiny neurons in nucleus accumbens. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 3399-3404 (2006).
- Matsubayashi, Y., Iwai, L., Kawasaki, H. Fluorescent double-labeling with carbocyanine neuronal tracing and immunohistochemistry using a cholesterol-specific detergent digitonin. J Neurosci Methods. 174, 71-81 (2008).
- Neely, S. tanwood, Deutch, G. D., Y, A. Combination of diOlistic labeling with retrograde tract tracing and immunohistochemistry. J Neurosci Methods. 184, 332-336 (2009).
- O'Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun. Trends Biotechnol. 25, 530-534 (2007).
- Shen, H. W., Toda, S., Moussawi, K., Bouknight, A., Zahm, D. S., Kalivas, P. W. Altered dendritic spine plasticity in cocaine- withdrawn rats. J. Neurosci. 29, 2876-2884 (2009).
