Labeling DiOLISTIC de Neurônios de roedores e não-humanos fatias do cérebro do primata

Summary

Nós demonstramos o uso da arma para introduzir gene corantes fluorescentes, como DII, em neurônios em fatias de cérebro de roedores e primatas não-humanos de diferentes idades. Neste caso particular, nós usamos camundongos adultos (3-6 meses de idade) e adultos macacos cynomologus (9-15 anos). Esta técnica, descrita originalmente pelo laboratório do Dr. Lichtman (Gan

Abstract

Coloração DiOLISTIC usa a arma gene para introduzir corantes fluorescentes, como o DII, em neurônios de fatias do cérebro (Gan et al, 2009;. O'Brien e Lummis, 2007; Gan et al, 2000).. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada de cada etapa necessária em conjunto com imagens exemplares de resultados bons e ruins que ajudarão ao configurar a técnica. Em nossa experiência, a poucos passos mostrou crítico para o sucesso da aplicação DiOLISTICS. Estas considerações incluem a qualidade das balas revestidas de DII, o grau de exposição fixador, ea concentração de detergente utilizado nas soluções de incubação. Dicas e soluções para problemas comuns são fornecidos.

Esta é uma técnica rotulagem versátil que pode ser aplicado a várias espécies de animais em uma ampla gama de idades. Ao contrário de outras técnicas de rotulagem fluorescentes que são limitados para a preparação de animais jovens ou restrita a camundongos, porque eles contam com a expressão de um transgene fluorescentes, rotulagem DiOLISTIC pode ser aplicado a animais de todas as idades, espécies e genótipos e pode ser usado em combinação com imunocoloração para identificar uma sub-população específica de células. Aqui nós demonstrar o uso de DiOLISTICS aos neurônios etiqueta em fatias de cérebro de camundongos adultos e adultos primatas não-humanos com o objetivo de quantificar dendrite ramificação e morfologia espinha dendrítica.

Protocol

1. Preparando DII / Tungsten Bullets Bead: DII (1-1'-Dioctadecyl-3, 3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato) balas devem ser preparadas com antecedência de cortar fatias de cérebro. O procedimento demora cerca de 2-4 horas, dependendo de quantas balas são preparados de uma só vez.

1. Se a partir de um novo lote de contas de tungstênio, prepare alíquotas de 300 mg cada. Alíquotas são preparados através da suspensão de 6 gramas de tungstênio em 2 ml de cloreto de metileno. Então, pipetar 100 ml de solução em tubos de microcentrífuga talão para produzir alíquotas de 300 esferas de tungstênio mg alíquotas Conservar à temperatura ambiente (Nota: o cloreto de metileno evapora muito rapidamente álcool também pode ser usado minimizar a evaporação)....
2. Quando a partir de alíquotas de contas, ressuspender cada alíquota (300 esferas de tungstênio mg) em 300 ml de cloreto de metileno e cobrir rapidamente para evitar a evaporação. Esta quantidade é suficiente para 3 lotes de balas.
3. Preparar a solução corante, pesando 13,5 mg de DII corante lipofílico e adicionando 450 mL de cloreto de metileno (concentração final = 3mg/100μl).
4. Brasão as contas com corante. Coloque uma lâmina de vidro em um pedaço de cera revestido de papel e pesar Pipetar 100 mL de contas para o slide. Adicione 100 ml de solução DII, misturar bem usando pipeta ponta, e ar seco, até virar cinza contas de luz.
5. Use uma lâmina para raspar contas fora da lâmina de vidro e corte as contas em um pó fino (Nota: use uma lâmina nova, se fazendo mais de uma cor de balas de modo a não contaminar os corantes)..
6. Contas de raspar para o pesar contas de papel e funil para um tubo de 15 ml. Adicionar 3 ml de água e sonicado em banho-maria por 10-30 minutos em temperatura ambiente (Nota: cortar o pó e sonicação são aplicadas para minimizar a formação de aglomerados de grânulos revestidos que pode atrapalhar a rotulagem esparsos de neurônios individuais)..

2. Preparar solução de polivinilpirrolidona (PVP) e tubos: Para melhorar a penhora de contas para a tubulação de bala (tubulação TEZFEL), bata-a com polivinilpirrolidona solução (PVP).

1. Prepare 10 ml de solução de PVP em água a uma concentração de 10 mg PVP / ml.
2. Use uma seringa de 12 ml com adaptador de tubo (tubo flexível com diâmetro ligeiramente maior) para passar a solução PVP através do tubo de bala e, em seguida, expulsá-lo do outro lado. Reutilização solução para tubo de revestimento mais bala se vários lotes são preparados simultaneamente. Descartar PVP solução após o uso.
3. Para adicionar as contas para o tubo vortex bala, as contas para produzir uma solução homogênea e usar a seringa para puxar a solução talão através do tubo de forma que contas são distribuídas uniformemente pela tubulação. ((Nota:) tentam minimizar o número de bolhas de ar na tubulação).
4. Alimentar o tubo através da estação de preparação e permitir que as contas para resolver. Use a seringa para remover suavemente a água de modo que somente as contas permanecem.
5. Girar a tubulação na estação de preparação e seque com gás nitrogênio até as gotas de água não são mais visíveis. Esta etapa irá demorar cerca de 10-20 min.
6. Cortar balas com cortador de tubos em 13 mm e comprimentos lugar em frascos de cintilação contendo Drierite ou algum tipo de sulfato de cálcio anidro. Embrulhe em uma folha de frascos para proteger da luz.

3. Coloração DII: Esta técnica rotulagem pode ser usado para manchar neurônios no tecido cerebral de diversas espécies, neste caso particular, a partir do mouse (3-6 meses de idade) e primatas não-humanos (9-15 anos).

É preferível que as fatias são preparados a partir de tecido cerebral fixa obtidos por perfusão intracardíaca de solução de fixador, pois a preservação de tecido deve ser melhor nessa condição. No entanto, a fixação por perfusão nem sempre é viável (como foi o caso com o tecido macaco) e rotulagem DiOLISTIC ainda pode ser aplicado com sucesso em diferentes procedimentos de preparo de tecidos. Aqui nós descrevemos três procedimentos diferentes para a preparação do tecido:

1. Fix cérebro por perfusão intracardíaca → remover cérebro → postfix por 10 min → fatia cortada mancha →
2. Remover cérebro → bloco de corte de tecido → bloco corrigir → lavar em PBS fatia corte → → mancha
3. Remover cérebro → fatias cortadas → corrigir → lavar → mancha

No presente estudo, os cérebros de macacos foram obtidas de indivíduos que foram transcardially perfundidos com líquido gelado cerebral artificial espinhal (ACSF) antes da colheita do cérebro e um bloco (4 mm de espessura) de tecido que contém o núcleo caudado umnd putâmen foi fixado por 60 min em temperatura ambiente. Para todos os procedimentos, a solução fixadora contém paraformaldeído a 4% de sacarose e 4% em PBS (preparada fresca ou utilizados dentro de 15 dias). É importante notar que os tempos de fixação são cruciais para a coloração bem sucedida. Overfixation pode afetar a coloração por perturbar a integridade da membrana plasmática e causando o vazamento de corante para fora da célula (veja mais informações em resultados).

1. Para o procedimento a e b, fatias (200μm) são cortadas a partir do cérebro fixo ou bloco de tecido e fatias colocado em 24 poços da placa com PBS. Para o procedimento c, fresco fatias cerebral aguda (200 mm) são cortados com uma vibratome em solução corte a frio contendo (em mM) 110 Colina Cl-, 25 de NaHCO _3, 1,25 NaH ₂ PO _4, 2,5 KCl, 0,5 CaCl _2, 7 MgCl _2, 25 de glicose, 11,6 ácido ascórbico, ácido pirúvico 3,1 (osmolaridade = 310 mOsmols) e imediatamente após as fatias são colocadas em placas de 24 poços e fixado em 30 min com solução fixadora à temperatura ambiente.
2. Lave as fatias com PBS, três vezes.
3. Antes de fatias de tiro, retire a PBS dos poços e, usando um pincel, coloque a fatia no centro do poço.
4. Atirar balas DII até 3.0 M de papel de filtro usando um sistema de Helios Gene Gun em 120-180 a pressão do gás hélio psi, colocando a arma a uma distância de 1,5 cm entre a amostra ea ponta do cano.
   (Nota importante:. Neurônios Somente dentro de 50 mm da superfície fatia será marcado por este método por isso é importante para manter o mesmo lado da fatia voltada para cima durante a lavagem e para a montagem Desta forma, você irá certificar-se que o neurônios rotuladas será dentro da distância focal, quando de imagem com um microscópio confocal).
5. Lave as fatias com PBS três vezes e armazená-los em PBS durante várias horas para permitir que a DII a se espalhar ao longo dos dendritos.
6. Monte fatias numa lâmina de vidro com Prolongar Antifade Ouro e cubra com uma lamela 18X18 milímetros No.1. (Nota: para c processo, o melhor é montar fatias no mesmo dia em que a integridade das fatias não é bem conservado durante a noite).
7. Seal com unhas polonês claro depois meios de montagem secou.
8. Alternativamente, as fatias podem ser marcadas com anticorpos antes da montagem, conforme descrito abaixo.
   (Nota: Slides pode ser usado pelo menos 6 meses a um ano se armazenado no escuro a 4 ° C. DII é a exposição sensível e longo prazo luz à luz fará com que a mancha a desvanecer-se).

4. Coloração de anticorpos: A imunocoloração deve ser realizada após o passo 3.4 e antes da montagem.

1. Permeabilização: fatias Incubar em 0,01% Triton X-100 em solução de PBS por 15 min em temperatura ambiente (300-500 mL por poço).
   NOTA: Não use maiores concentrações de detergente, pois isso irá dissolver DII e reduzir significativamente a coloração fluorescente. Tentar minimizar o tempo em detergente como incubações extensiva também irá reduzir a rotulagem DII. Se incubações estendida são necessárias, manter fatias em PBS, e não em solução de bloqueio.
2. Bloqueio: fatias Incubar em solução de bloqueio contendo soro de cabra 10%, 0,01% Triton X-100 em PBS por 30 min em temperatura ambiente.
3. Anticorpo primário: Adicionar anticorpo na diluição desejada em solução de bloqueio (por exemplo, coelho anticorpo anti-GFP em 1:1000 diluição). Adicionar 300-500 mL por poço e incubar por 1-2 hrs. (Nota: se incubações durante a noite são necessárias, retire o detergente do solução de bloqueio).
4. Lave as fatias com PBS por 5 - 15 min, 3 vezes.
5. Anticorpo secundário: Incubar com anticorpo secundário por 30 min em temperatura ambiente. Prepare a solução de anticorpo secundário na diluição desejada em solução de bloqueio (por exemplo, Alexa Fluor 488-anticorpo conjugado na diluição 1:1.000).
6. Lave as fatias com PBS por 5-15 min, 4 vezes.
7. Monte fatias de slides com Prolongar Antifade Ouro e cubra com uma 18x18 milímetros No.1 lamela. Seal com unha polonês após meios de montagem secou.

5. Resultados representativos:

1. Verificação de rotulagem correta: Seção podem ser visualizados em um escopo fluorescentes dissecar equipado com uma lâmpada de mercúrio e fluorescentes cubo vermelho filtro para confirmar rotulagem DiOLISTIC sucesso. A Figura 1 mostra imagens exemplar de secções cerebrais muito bem marcado obtidas com pequeno aumento. Duas características importantes estão a olhar para um padrão de rotulagem esparsos (Figura 1A) e a capacidade de identificar individualmente os componentes celulares (Figura 1B-C). Solução de problemas de rotulagem DiOLISTIC: Figura 2 mostra exemplos de seções em que a rotulagem DiOLISTIC trabalhou de forma incorreta. Em nossa experiência, existem três causas principais para a rotulagem ineficiente:
   • Rotulagem é muito esparsa ou densa: Muito poucas células são rotulados por seção em um caso ou muitas células são rotulados impedindo o isolamento e estudo de elementos celulares única. Solução: ajustar a concentração de grânulos com revestimento na solução final utilizada para o revestimento da tubulação bala TEFZEL (seção 1.6). Diminuir ou aumentar o volume de água (3 ml valor inicial) utilizado para dissolver as contas em ordem para corrigir a rotulagem demasiado escassa ou muito densa, respectivamente. Além disso, baixa eficiência de rotulagem podem ser causados ​​por menos de pressão do gás ideal para fotografar as contas revestido em seções. Esta possibilidade pode ser descartada, certificando-se que a tubulação de bala TEFZEL lançou a maior parte dos grânulos revestidos e parece claro após o disparo. Caso contrário, a pressão do gás para a fotografia deve ser aumentada.
   • Balas ruins: as grandes aglomerações ou clusters de contas corante revestido de tungstênio são formadas durante a preparação de bala. Seções se assemelhará exemplos na Figura 2A-B. Solução: fazer novas balas com especial atenção o ponto 1.5 e / ou prolongar o tempo de sonicação no ponto 1.6.
   • Prazo de fixação: o tecido é mantido em solução de paraformaldeído por mais tempo do que o tempo ideal necessário para a fixação (30 minutos para seções 200-300 mM, 1 hora para 4 seções mm). Isso compromete a integridade da membrana plasmática e produz seções rotuladas que se parecem com aqueles mostrados na Figura 2C-D em que a rotulagem parece fora de foco devido à dispersão de corante para fora das células. Solução: reduzir o tempo de fixação.
2. Imagem confocal: pilhas de imagens são adquiridas através de um microscópio confocal (Zeiss LSM 510 META) com um objetivo de 20x para a célula inteira e objetiva de imersão 63x de água para os segmentos de dendrite. DII estava animado usando uma linha de laser 561 DPS nm e fluorescência verde do anticorpo secundário foi animado usando uma linha de laser 488 nm. A secção óptica da amostra rotulada alcançado quando usando microscopia confocal permite ainda para o isolamento de células marcadas única na amostra. Figura 3A mostra um neurônio estriatal spiny médio do cérebro do rato e seu padrão de ramificação complexa dendrite. Imagens de alta ampliação de ramos dendrite desses neurônios a partir de roedores (Figura 3B) e primatas não-humanos (Figura 3C) demonstram o grau de coloração em dendritos e espinhas dendríticas usando esta técnica em ambas as espécies. Dendritos e suas saliências (espinhas) aparecem bem definidos, mesmo quando se considera a coluna, longo e fino cabeças tão abundante nos neurônios espinhosos médios.
   
   Ao combinar DiOLISTICS com imunomarcação, imagem confocal também é útil para localizar a mancha de forma inequívoca para o mesmo plano focal e mesma célula. A Figura 4 mostra um exemplo de co-localização de DII rotulagem e imunomarcação para GFP em uma única célula. A imagem é uma pilha (0,7 mM z-seção) obtido a partir de uma fatia estriatal de um camundongo transgênico expressando a proteína fluorescente GFP sob o promotor receptor D1 de dopamina.

Figura 1. DII rotulagem de neurônios em fatias de cérebro de primatas não-humanos. (A) imagem de baixa ampliação de uma fatia do cérebro manchada contendo o núcleo caudado de um macaco cynomolgus que mostra escassa rotulagem de neurônios com DII. (BC) neurônios isolados spiny meio pode ser facilmente identificado usando um escopo fluorescentes de dissecação.

Figura 2. Rotulagem DiOLISTIC Resolução de Problemas. (AB) fatias de estriado dorsal Stained de macaco (A) e mouse (B) mostrando grandes aglomerações de corante revestido contas e, como conseqüência, não há elementos individuais de celular podem ser distinguidos. (CD) Imagens que exemplificam o resultado da aplicação DiOLISTIC rotulagem para as seções que foram mantidos em solução fixadora por períodos prolongados de tempo, ou quando a preservação de tecido falhou em macaco (C) e tecido mouse (D).

Figura 3. Confocal imagem de estriatal médio spiny neurônio corados com DII. (A), pilha de Imagem de uma célula inteira permite a análise morfológica dos ramos dendríticas. Segmentos (BC) Dendrite de mouse (B) e macaco (C) neurônios espinhosos médios mostram uma rotulagem clara de dendrite e espinhas.

Figura 4. Combinando rotulagem DiOLISTIC com imunocoloração. (A) Dii rotulados (B) usando anticorpos anti-GFP, como descrito por métodos adaptados de Lee et al. (2006). Mesmo campo como A. imagem (C) composto de vermelho e de fluorescência verde identifica neurônio DII marcado como um neurônio GFP-positivo.

Discussion

Rotulagem DiOLISTIC é uma das técnicas mais versáteis disponíveis para as células fluorescente rotulagem, porque pode ser aplicado a seções de tecido de diversas espécies, para uma ampla gama de idades, e para o tecido obtido frescos ou de fixador-perfundidos animais (ver também Gan et al ., 2009). O processo é relativamente rápido, uma vez que leva 1-2 dias e pode ser combinada com outras abordagens rotulagem mais clássicos, como imunocoloração (Lee et al., 2006). Atenção especial deve ser dada para evitar o excesso de fixação e uso de detergente de alta concentração em soluções de incubação porque estes compreendem a integridade da membrana lipofílica e fazer com que o corante vazar para fora das células. Penetração de anticorpos pode ser facilitado por baixas concentrações de Triton X-100 (Lee et al., 2006), bem como digitonina ou saponina na solução de incubação (Matsubayashi et al., 2008). Algumas modificações que podem ser aplicadas para esta técnica incluem o uso de balas com diversas tinturas e, como descrito por Gan et al. (2000) ou mudar o tamanho e tipo de exposição de anticorpos (Neely et al., 2009).

Tradicionalmente, a DII tem sido usado para traçar projeções neuronais no cérebro. Rotulagem DiOLISTIC amplia sua aplicação, descrevendo um método útil para analisar a morfologia das células. Morfologia neuronal é de grande interesse por causa da grande diversidade encontrada no cérebro e as especulações de que a forma da célula pode refletir sobre a multiplicidade função de populações neuronais no sistema nervoso. Um exemplo disso é o fato de que muitos neurônios do sistema nervoso protrusão mostrar mamíferos pequenos chamadas espinhas dendríticas, que são o local das sinapses glutamatérgicas. Desta forma, a densidade de sinapses glutamatérgicas em uma célula pode ser correlacionada com a densidade de espinhas dendríticas, que pode ser medido utilizando a técnica de rotulagem descritos neste documento. Além disso, outros parâmetros morfológicos, tais como comprimento total dendrite, padrão de ramificação, forma espinha dendrítica e densidade podem ser quantificados e estudados.

O uso de marcação fluorescente para estudar a morfologia neuronal tem muitas vantagens quando comparado com técnicas mais tradicionais que dependem de microscopia de campo claro (por exemplo, a coloração de Golgi), pois permite maior resolução de imagem confocal. Outra vantagem de usar DII como um fluoróforo em experimentos destinados a medir a densidade espinha dendrítica e morfologia é suas propriedades lipofílicas. Partições DII na membrana plasmática e proporciona um contorno bem definido dos processos neuronais e saliências dendríticas. Dado o pequeno volume de mais espinhas dendríticas (menos de 1 femtoliter), coloração da membrana é mais eficiente e permite uma melhor visualização de pequenas saliências finas de coloração citoplasmática.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI)	Invitrogen	D-282
Methylene chloride	Mallinckrodt Baker Inc.	H485-06
Tungsten beads	Bio-Rad	165-2269	1.7 μm diameter
Polyvinylpyrrolidone	Calbiochem	529504
Tefzel bullet tubing	Bio-Rad	165-2441
Tubing cutter	Bio-Rad	165-2422
Helios Gene Gun	Bio-Rad	165-2431
Isopore membrane filter paper	EMD Millipore	TSTP02500	3.0 μm pore size
ProLong Gold Antifade	Invitrogen	P36930
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	30525-89-4	(16% w/v)