Summary
Se demuestra el uso de la pistola de genes para introducir tintes fluorescentes, como DII, en las neuronas en secciones de cerebro de los roedores y primates no humanos de diferentes edades. En este caso particular, utilizamos ratones adultos (3-6 meses de edad) y adultos de los monos cynomologus (9-15 años). Esta técnica, descrita originalmente por el laboratorio del Dr. Lichtman (Gan
Abstract
Tinción DiOLISTIC utiliza la pistola de genes para introducir tintes fluorescentes, como DII, en las neuronas de las secciones de cerebro (Gan et al, 2009;. O'Brien y Lummis, 2007; Gan et al, 2000).. A continuación presentamos una descripción detallada de cada paso necesario, junto con imágenes de ejemplares de los resultados de bueno y lo malo que le ayudará a la hora de establecer la técnica. En nuestra experiencia, a pocos pasos resultó fundamental para la aplicación exitosa de DiOLISTICS. Estos aspectos incluyen la calidad de las balas DII-revestidos, el grado de exposición de fijación, y la concentración de detergente que se usa en las soluciones de incubación. Consejos y soluciones para los problemas comunes se proporcionan.
Esta es una técnica de etiquetado versátil que se puede aplicar a múltiples especies de animales en un amplio rango de edades. A diferencia de otras técnicas de marcaje fluorescente que se limitan a la preparación de los animales jóvenes o se limita a los ratones porque se basan en la expresión de un transgén fluorescentes, etiquetado DiOLISTIC se puede aplicar a los animales de todas las edades, especies y genotipos, y puede ser utilizado en combinación con tinción para identificar una subpoblación de células específicas. Aquí se demuestra el uso de DiOLISTICS marcar las neuronas en secciones de cerebro de ratones adultos y adultos primates no humanos con el fin de cuantificar las dendritas de ramificación y la morfología de la espina dendrítica.
Protocol
1. Preparación DII / tungsteno Balas bolas: DII (1-1'-dioctadecil-3, 3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato) balas deben estar preparados antes de cortar rodajas de cerebro. El procedimiento tarda aproximadamente 2-4 horas, dependiendo de cuántas balas se preparan a la vez.
- Si a partir de un nuevo lote de bolas de tungsteno, preparar alícuotas de 300 mg cada uno. Las alícuotas son preparados por la suspensión de 6 gramos de tungsteno en 2 ml de cloruro de metileno. Luego, pipeta de 100 l de solución de cordón en tubos de microcentrífuga para producir alícuotas de 300 mg de tungsteno cuentas alícuotas Conservar a temperatura ambiente (Nota: cloruro de metileno se evapora muy rápidamente el alcohol también se puede utilizar para minimizar la evaporación.)...
- Cuando a partir de alícuotas de cuentas, resuspender cada alícuota (300 bolas de tungsteno mg) en 300 l de cloruro de metileno y cubrir rápidamente para evitar la evaporación. Esta cantidad es suficiente para 3 lotes de balas.
- Prepare una solución de tinte pesando 13,5 mg de DII tinte lipofílica y la adición de 450 l de cloruro de metileno (concentración final = 3mg/100μl).
- Escudo de la cuentas con el tinte. Coloque una placa de vidrio sobre un pedazo de cera recubierta de papel y un peso Pipetear 100 L de cuentas en la diapositiva. Añadir 100 ml de la solución de DII, mezclar bien con punta de la pipeta, y secar al aire hasta que gotas a su vez de color gris claro.
- Use una hoja de afeitar para raspar cuentas de la lámina de vidrio y los dados de las cuentas en un polvo fino (Nota: utilice un disco nuevo, si hace más de un color de balas a fin de no contaminar los colorantes)..
- Cuentas de raspar en el pesaje cuentas de papel y el embudo en un tubo cónico de 15 ml. Añadir 3 ml de agua y de ultrasonidos en baño de agua durante 10-30 minutos a temperatura ambiente (Nota: dados de polvo y ultrasonidos se aplican para reducir al mínimo la formación de grupos de bolas recubiertas que interrumpir el etiquetado escaso de neuronas individuales)..
2. Preparación de polivinilpirrolidona (PVP) y el tubo de la solución: Para mejorar el agarre del talón a la tubería de bala (tubos TEZFEL), cubrir con polivinilpirrolidona (PVP) solución.
- Prepare 10 ml de solución de PVP en agua a una concentración de 10 mg de PVP / ml.
- Use una jeringa de 12 ml con adaptador de tubos (tubo flexible con un diámetro ligeramente más grande) para pasar la solución de PVP a través del tubo de bala y luego lo expulsan por el otro extremo. Reutilización de la solución a un tubo de más abrigo bala si varios lotes se preparan de forma simultánea. Desechar la solución PVP después de su uso.
- Para agregar las cuentas de la tubería de bala, vórtice de las cuentas para producir una solución homogénea y el uso de la jeringa para extraer la solución de cuentas a través de la tubería para que las cuentas se distribuyen uniformemente a lo largo de la tubería. ((Nota:) tratar de minimizar el número de burbujas de aire en la tubería).
- Colocando la manguera a través de la estación de la preparación y permitir que las cuentas que saldar. Use la jeringa para extraer con cuidado el agua de manera que sólo las cuentas siguen siendo.
- Girar el tubo en la estación de la preparación y seco con gas de nitrógeno hasta que las gotas de agua ya no son visibles. Este paso dura aproximadamente 10-20 minutos.
- Cortar las balas con cortador de tubo en 13 mm de longitud y el lugar en viales de centelleo que contienen Drierite o algún tipo de sulfato de calcio anhidro. Envuelva en papel de viales para protegerlo de la luz.
3. La tinción DII: Esta técnica se puede utilizar el etiquetado para teñir las neuronas en el tejido cerebral de diversas especies, en este caso particular, de ratón (3-6 meses de edad) y los primates no humanos (9-15 años).
Es preferible que los cortes son preparados a partir de tejido cerebral de perfusión fijo obtenido por transcardiaca de solución fijadora por la preservación del tejido que se espera ser el mejor en esta situación. Sin embargo, la fijación por perfusión no siempre es posible (como fue el caso de los tejidos de mono) y el etiquetado DiOLISTIC todavía puede ser aplicado con éxito en diferentes procedimientos para la preparación del tejido. Aquí se describen tres procedimientos diferentes para la preparación del tejido:
- Fix cerebral de perfusión cerebral transcardiaca → → eliminar postfix durante 10 minutos → → rebanada cortada mancha
- Quitar el cerebro → bloque de corte de tejido → → bloque fijar en el segmento de lavado PBS corte → → mancha
- Quitar el cerebro → → rebanadas cortadas fijar → → lavar la mancha
En el presente estudio, los cerebros de los monos se obtuvieron de los sujetos que fueron perfundidos con helada transcardially artificial líquido cefalorraquídeo (ACSF) antes de la cosecha del cerebro y un bloque (4 mm de espesor) de tejido que contiene el núcleo caudado unaª putamen se fijó durante 60 minutos a temperatura ambiente. Para todos los procedimientos, solución fijadora contiene paraformaldehído al 4% y 4% de sacarosa en PBS (preparados frescos o utilizarse dentro de 15 días). Es importante tener en cuenta que los tiempos de fijación son críticas para la tinción de éxito. Overfixation puede afectar a la tinción mediante la interrupción de la integridad de la membrana plasmática y causando tinte se salga de la celda (ver más información en los resultados).
- Para el procedimiento A y B, rebanadas (200μm) se cortan de cerebro fijo o bloque de tejido y las rodajas de colocar en 24 y la placa con PBS. Para el procedimiento de c, frescas rebanadas cerebral agudo (200 m) se cortan con un vibratome en una solución de corte en frío que contiene (en mM) 110 de colina-Cl, 25 de NaHCO3, 1,25 NaH 2 PO 4, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 7 de MgCl 2, 25 glucosa, ácido ascórbico, 11,6, 3,1 ácido pirúvico (osmolaridad = 310 mOsmols) e inmediatamente después de las rebanadas se colocan en placas de 24 pocillos y se fija durante 30 minutos con solución fijadora a temperatura ambiente.
- Lavar las rodajas con PBS, 3 veces.
- Antes de rebanadas de rodaje, retire la PBS a partir de los pozos y, con un pincel, coloque la rebanada en el centro del pozo.
- Dispara balas de DII a través de 3,0 micras de papel de filtro utilizando un sistema de Gene Helios pistola a 120-180 psi de presión de gas de helio, colocando la pistola a una distancia de 1,5 cm entre la muestra y el extremo del cañón.
(Nota importante:. Neuronas sólo dentro de los 50 mm de la superficie de corte será etiquetado por este método, por lo que es importante mantener el mismo lado de la corte hacia arriba durante el lavado y para el montaje De esta manera, usted se asegurará de que el neuronas marcadas estará dentro de la distancia focal cuando se generan imágenes con un microscopio confocal). - Lávese las rebanadas con PBS 3 veces y almacenarlos en PBS durante varias horas para permitir que el DII para difundir a lo largo de las dendritas.
- Monte rodajas sobre un portaobjetos de vidrio con prolongar Antifade oro y cubrir con un 18x18 mm N º 1 cubreobjetos. (Nota: Para el Procedimiento C, lo mejor es montar las rebanadas en el mismo día de la integridad de los cortes no se mantiene bien durante la noche).
- Sellar con esmalte de uñas transparente después de que medios de montaje se ha secado.
- Por otra parte, los cortes se pueden teñir con anticuerpos antes de montar como se describe a continuación.
(Nota: Las diapositivas se pueden utilizar por lo menos 6 meses a un año si se almacena en la oscuridad a 4 ° C. DII es sensible a la luz la exposición a largo plazo a la luz hará que la mancha se descolora).
4. La tinción de anticuerpos: La inmunotinción se debe realizar después del paso 3.4 y antes de montar.
- Permeabilización: rodajas de incubación en 0,01% Triton X-100 en solución de PBS por 15 min a temperatura ambiente (300-500 l por pocillo).
NOTA: No utilizar concentraciones más altas de detergente, ya que se disuelven DII y reducir significativamente la tinción fluorescente. Trate de minimizar el tiempo de detergente incubaciones amplia también reducirá el etiquetado DII. Si incubación prolongado es necesario, mantener cortes en PBS en lugar de en solución de bloqueo. - Bloqueo: Incubar las rebanadas en la solución de bloqueo con 10% suero de cabra, el 0,01% de Triton X-100 en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Anticuerpo primario: Añadir anticuerpo a la dilución deseada en solución de bloqueo (por ejemplo, de conejo anti-GFP de anticuerpos en la dilución 1:1000). Añadir 300-500 l por pocillo e incubar durante 1-2 horas. (Nota: si incubaciones durante la noche es necesario, eliminar el detergente de la solución de bloqueo).
- Lávese las rebanadas con PBS durante 5 a 15 minutos, 3 veces.
- Anticuerpo secundario: Se incuba con el anticuerpo secundario durante 30 minutos a temperatura ambiente. Prepare una solución de anticuerpo secundario a la dilución deseada en solución de bloqueo (por ejemplo, Alexa-Fluor 488 anticuerpo conjugado en la dilución 1:1000).
- Lávese las rebanadas con PBS durante 5-15 minutos, 4 veces.
- Monte rebanadas de diapositivas con prolongar Antifade oro y cubrir con un 18x18 mm N º 1 cubreobjetos. Sellado con laca de uñas después de que medios de montaje se ha secado.
5. Los resultados representativos:
- Comprobación de la adecuación del etiquetado: la sección se puede visualizar en un ámbito fluorescentes disección equipado con una lámpara de mercurio y rojo cubo fluorescente filtro para confirmar el etiquetado DiOLISTIC éxito. La figura 1 muestra las imágenes ejemplares de las secciones del cerebro bien etiquetados obtenido a bajo aumento. Dos características importantes a tener en cuenta son un modelo de etiquetado escasa (fig. 1A) y la capacidad de identificar los distintos componentes celulares (Figura 1B-C). Solución de problemas de etiquetado DiOLISTIC: La figura 2 muestra ejemplos de las secciones en las que el etiquetado DiOLISTIC trabajado de forma incorrecta. En nuestra experiencia, hay tres causas principales para el etiquetado ineficiente:
- El etiquetado es demasiado escasa o densa: muy pocas células son etiquetados por sección, en un caso o muchas células se denominan prevenir el aislamiento y estudio de los elementos celulares individuales. Solución: ajustar la concentración de bolas recubiertas en la solución final que se utiliza para el recubrimiento de la tubería de bala TEFZEL (sección 1.6). Aumentar o disminuir el volumen de agua (3 ml valor inicial) se utiliza para disolver las cuentas a fin de corregir el etiquetado demasiado escasa o demasiado densa, respectivamente. Además, la baja eficiencia de etiquetado puede ser causada por menos de presión de gas óptima al disparar las bolas recubiertas en las secciones. Esta posibilidad se puede descartar, asegurándose de que el tubo de bala TEFZEL ha publicado la mayoría de las perlas recubiertas y parece claro después del disparo. De lo contrario, la presión del gas de tiro debe ser mayor.
- Balas mal: los grupos grandes o grupos de bolas de tungsteno recubiertas de tinte se forman durante la preparación de bala. Secciones se asemejan a los ejemplos en la Figura 2-B. Solución: hacer nuevas balas prestando especial atención a la sección 1.5 y / o extender el tiempo de tratamiento con ultrasonidos en la sección 1.6.
- Más de fijación: el tejido se mantiene en solución de paraformaldehído durante más tiempo que el tiempo óptimo necesario para la fijación (30 minutos de 200-300 micras secciones, 1 hora por 4 secciones mm). Esto compromete la integridad de la membrana plasmática y produce secciones etiquetadas que se parecen a los que se muestran en la Figura 2C-D en el que el etiquetado parece fuera de foco debido a la dispersión de colorante de las células. Solución: reducir el tiempo de fijación.
- Imagen confocal: pilas de imágenes son adquiridas mediante un microscopio confocal (Zeiss LSM 510 META), con un objetivo 20x para toda la celda y el objetivo 63x de inmersión en agua para los segmentos de las dendritas. DII se emocionó con una línea de DPS 561 nm láser y la fluorescencia verde de la secundaria de anticuerpos se emocionó con una línea de 488 nm láser. El seccionamiento óptico de la muestra de la etiqueta logra cuando mediante microscopía confocal permite, además, para el aislamiento de una sola células marcadas en la muestra. La figura 3A muestra una neurona espinosa mediana estriado del cerebro de ratón y su patrón complejo dendrita rama. Imágenes de gran aumento de dendritas de las neuronas de los roedores (Figura 3B) y primates no humanos (Figura 3C) demuestran el grado de tinción de dendritas y espinas dendríticas uso de esta técnica en ambas especies. Dendritas y sus protuberancias (espinas) aparecen bien definidos, incluso cuando se consideran la columna vertebral larga y delgada cabezas tan abundante en neuronas espinosas.
Cuando se combinan con DiOLISTICS inmunotinción, imagen confocal también es útil para localizar de manera inequívoca que la mancha en el mismo plano focal y la misma celda. La Figura 4 muestra un ejemplo de la colocalización de DII etiquetado y la inmunotinción de las buenas prácticas agrarias en una sola célula. La imagen es una pila (0,7 m z-sección) obtenidos a partir de una porción del estriado de un ratón transgénico que expresa la proteína fluorescente GFP bajo el promotor del receptor de dopamina D1.
Figura 1. DII etiquetado de las neuronas en secciones de cerebro de los primates no humanos. (A) Imagen bajo aumento de una porción del cerebro manchado que contiene el núcleo caudado de un mono cynomolgus etiquetado que muestra escasa de neuronas con DII. (BC) Alejado neuronas espinosas pueden ser fácilmente identificados con un alcance fluorescentes de disección.
Figura 2. Etiquetado DiOLISTIC solución de problemas. (AB) rebanadas manchado de cuerpo estriado dorsal de monos (A) y el ratón (B) muestra los grupos grandes de colorante revestida de piedras y, en consecuencia, no hay elementos celulares individuales se pueden distinguir. (CD) Las imágenes que ilustran el resultado de aplicar DiOLISTIC etiquetado de las secciones que se mantuvieron en solución fijadora durante períodos prolongados de tiempo, o cuando la conservación de tejidos no en mono (C) y tejidos de ratón (D).
Figura 3. Imagen confocal de neuronas espinosas del estriado medio manchadas de DII. (A), la pila de la imagen de una célula completa permite el análisis morfológico de las ramas dendríticas. (BC) Dendrite segmentos de ratón (B) y el mono (C) neuronas espinosas mostrar un etiquetado claro de las dendritas y espinas.
Figura 4. La combinación de etiquetado DiOLISTIC con inmunotinción. (A) DII etiquetado
Discussion
Etiquetado DiOLISTIC es una de las técnicas más versátiles disponibles para las células con fluorescencia de etiquetado, ya que se pueden aplicar a las secciones de tejidos de diversas especies, a un amplio rango de edades, y en el tejido obtenido fresco o de fijador-perfusión animales (véase también Gan et al ., 2009). El proceso es relativamente rápido, ya que toma de 1-2 días y puede ser combinado con otros métodos de etiquetado más clásicos, como la inmunotinción (Lee et al., 2006). Se debe prestar especial atención a evitar el exceso de fijación y el uso de las concentraciones de detergente de alta en soluciones de incubación ya que estos se componen de la integridad de la membrana lipofílica y hacer que el tinte se salga de las células. La penetración de anticuerpos puede ser facilitado por las bajas concentraciones de Triton X-100 (Lee et al., 2006), así como digitonina o saponina en la solución de incubación (Matsubayashi et al., 2008). Algunas de las modificaciones que se pueden aplicar a esta técnica incluyen el uso de balas con tintes múltiples según lo descrito por Gan et al. (2000) o el cambio de la longitud y el tipo de exposición de anticuerpos (Neely et al., 2009).
Tradicionalmente, el DII ha sido utilizado para trazar proyecciones neuronales en el cerebro. Etiquetado DiOLISTIC amplía su aplicación mediante la descripción de un método útil para examinar la morfología celular. Morfología neuronal es de gran interés debido a la gran diversidad encontrada en el cerebro y la especulación de que la forma celular sea incompatible con la función de la multiplicidad de las poblaciones neuronales en el sistema nervioso. Un ejemplo de ello es el hecho de que muchas neuronas en los mamíferos protrusión pantalla del sistema nervioso pequeñas llamadas espinas dendríticas que son el sitio de las sinapsis glutamatérgicas. De esta forma, la densidad de las sinapsis glutamatérgicas en una célula puede ser correlacionada con la densidad de las espinas dendríticas, que puede ser medido con la técnica de etiquetado descritos en este documento. Además, otros parámetros morfológicos como la longitud dendrítica total, patrón de ramificación, forma la espina dendrítica y la densidad se puede cuantificar y estudiar.
El uso de marcaje fluorescente para el estudio de la morfología neuronal tiene muchas ventajas en comparación con las técnicas más tradicionales que se basan en microscopía de campo claro (por ejemplo, la tinción de Golgi), ya que permite obtener imágenes de mayor resolución confocal. Otra ventaja de usar DII como un fluoróforo en experimentos destinados a medir la densidad y la morfología de la espina dendrítica es sus propiedades lipofílicas. Particiones DII en la membrana plasmática y proporciona un esquema bien definido de los procesos neuronales y protuberancias dendríticas. Dado el pequeño volumen de la mayoría de las espinas dendríticas (menos de 1 femtoliter), la tinción de la membrana es más eficiente y permite una mejor visualización de protuberancias pequeñas y delgadas que la tinción citoplasmática.
Disclosures
Todos los procedimientos con animales se realizaron siguiendo las orientaciones de la Protección de los Animales y el empleo en el NIAAA y el Centro Nacional de Oregon Primate Research. Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Michael Feyder y Terrell Holloway por su ayuda durante la configuración inicial de la técnica y el laboratorio del doctor Fumi Ono s para el acceso a su microscopio confocal. Esta investigación fue financiada por el Instituto Nacional de Salud a través del programa intramuros del NIAAA y NINDS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI) | Invitrogen | D-282 | |
| Methylene chloride | Mallinckrodt Baker Inc. | H485-06 | |
| Tungsten beads | Bio-Rad | 165-2269 | 1.7 μm diameter |
| Polyvinylpyrrolidone | Calbiochem | 529504 | |
| Tefzel bullet tubing | Bio-Rad | 165-2441 | |
| Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | |
| Helios Gene Gun | Bio-Rad | 165-2431 | |
| Isopore membrane filter paper | EMD Millipore | TSTP02500 | 3.0 μm pore size |
| ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | (16% w/v) |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOLISTIC" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harb Protoc. , pdb.prot5202-pdb.prot5202 (2009).
- Grutzendler, J., Tsai, J., Gan, W. B. Rapid labeling of neuronal populations by ballistic delivery of fluorescent dyes. Methods. 30, 79-85 (2003).
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- Matsubayashi, Y., Iwai, L., Kawasaki, H. Fluorescent double-labeling with carbocyanine neuronal tracing and immunohistochemistry using a cholesterol-specific detergent digitonin. J Neurosci Methods. 174, 71-81 (2008).
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- O'Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun. Trends Biotechnol. 25, 530-534 (2007).
- Shen, H. W., Toda, S., Moussawi, K., Bouknight, A., Zahm, D. S., Kalivas, P. W. Altered dendritic spine plasticity in cocaine- withdrawn rats. J. Neurosci. 29, 2876-2884 (2009).
