DiOLISTIC Märkning av nervceller från gnagare och icke-mänskliga primater Slices Brain

Summary

Vi demonstrera användningen av genen pistol för att införa fluorescerande färger, såsom DII, i nervceller i hjärnan skivor från gnagare och icke-mänskliga primater i olika åldrar. I det här fallet använder vi vuxna möss (3-6 månader) och vuxna cynomologus apor (9-15 år). Denna teknik, ursprungligen beskrevs av laboratoriet av Dr Lichtman (Gan

Abstract

DiOLISTIC färgning använder genen pistolen att införa fluorescerande färger, såsom DII, till nervceller i hjärnan skivor (Gan et al, 2009;. O'Brien och Lummis, 2007; Gan et al, 2000.). Här ger vi en detaljerad beskrivning av varje steg krävs tillsammans med exemplariska bilder av bra och dåliga resultat som kommer att hjälpa när du ställer in tekniken. Enligt vår erfarenhet visat några steg kritiska för en framgångsrik tillämpning av DiOLISTICS. Dessa aspekter är bl.a. kvaliteten på DII-belagda kulor, omfattningen av fixativ exponering, och koncentrationen av rengöringsmedel som används i inkuberingen lösningar. Tips och lösningar på vanliga problem finns.

Detta är en mångsidig märkning teknik som kan användas till flera djurarter på en mängd olika åldrar. Till skillnad från andra fluorescerande märkning tekniker som är begränsade till beredningar från unga djur eller begränsas till möss, eftersom de förlitar sig på uttryck för en fluorescerande transgen kan DiOLISTIC märkning tillämpas på djur i alla åldrar, arter och genotyper och det kan användas i kombination med immunfärgning att identifiera en specifik subpopulation av celler. Här har vi demonstrera användningen av DiOLISTICS att märka nervceller i hjärnan skivor från vuxna möss och vuxna icke-mänskliga primater i syfte att kvantifiera Dendrite förgrening och dendritiska ryggraden morfologi.

Protocol

1. Förbereda DII / Tungsten Bead Bullets: DII (1-1'-Dioctadecyl-3, 3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat) kulor bör utarbetas i förväg skära hjärnan skivor. Proceduren tar cirka 2-4 timmar beroende på hur många kulor är beredda på en gång.

1. Om utgår från en ny omgång av volfram pärlor, förbereda alikvoter av 300 mg vardera. Alikvoter förbereds av avbryta 6 gram av volfram i 2 ml metylenklorid. Sedan, för att pipettera 100 ìl av bead lösningen i mikrofugrör rör producera alikvoter av 300 pärlor mg volfram Store alikvoter vid rumstemperatur (OBS: metylenklorid avdunstar mycket snabbt Alkohol kan också användas minimera avdunstning.)...
2. Vid start från alikvoter av pärlor, resuspendera varje alikvot (300 mg volfram pärlor) i 300 l av metylenklorid och täcker snabbt för att förhindra avdunstning. Denna mängd räcker till tre partier av kulor.
3. Förbered färglösningen genom att väga 13,5 mg av lipofila färg DII och lägga 450 ìl metylenklorid (slutlig koncentration = 3mg/100μl).
4. Täck pärlor med färg. Placera en glasskiva på en bit vax-belagda väger papper och pipettera 100 l av pärlor på bilden. Tillsätt 100 ìl av DII lösning, blanda väl med pipettspetsen och lufttorka tills pärlor tur ljusgrå.
5. Använd ett rakblad för att skrapa pärlor i glaset bilden och tärna pärlor till ett fint pulver (Obs: använd ett nytt blad om att göra mer än en färg av kulor för att inte förorena färgämnen)..
6. Skrapa pärlor på väger papper och tratt pärlor i en 15 ml koniska rör. Tillsätt 3 ml vatten och låt ligga i vattenbad i 10-30 minuter i rumstemperatur (OBS: tärning av pulver och ultraljudsbehandling tillämpas för att minimera bildning av klumpar av belagda kulor som kommer att störa den glesa märkning av enskilda nervceller)..

2. Förbereda polyvinylpyrrolidon (PVP) lösning och slangar: Att förbättra pärla bilaga till bullet slang (TEZFEL slangar), päls den med polyvinylpyrrolidon (PVP) lösning.

1. Förbered 10 ml av PVP lösning i vatten till en koncentration på 10 mg PVP / ml.
2. Använd en 12 ml spruta med slang-adapter (slangar med något större diameter) att passera PVP lösning genom kulan slangen och sedan driva ut det ur den andra änden. Återanvändning lösning på pälsen mer bullet rör om flera partier är beredda samtidigt. Kassera PVP lösning efter användning.
3. För att lägga till pärlor till kulan slang, vortex pärlorna för att producera en homogen lösning och använder sprutan för att dra pärlan lösning genom slangen så att kulorna är jämnt fördelade över hela slangen. ((Obs:) försöker att minimera antalet luftbubblor i slangen).
4. Mata slangen genom prep stationen och låt kulorna att bosätta sig. Använd sprutan försiktigt bort vattnet så att bara pärlorna kvar.
5. Snurra slangen i prep stationen och torka med kvävgas tills vattendropparna är inte längre synliga. Detta steg kommer att ta ca 10-20 min.
6. Skär kulor med slang skär in i 13 mm längder och plats i skintillationsflaskor innehåller Drierite eller någon form av vattenfritt kalciumsulfat. Wrap flaskor i folie för att skydda mot ljus.

3. DII Färgning: Denna märkning teknik kan användas för att färga nervcellerna i hjärnvävnad från olika arter, i detta fall, från mus (3-6 månader gamla) och icke-mänskliga primater (9-15 år).

Det är bättre att skivor är beredda från fasta hjärnvävnad erhålls genom transcardiac perfusion av Fixeringslösning eftersom vävnaden bevarandet bedöms vara bäst under detta förhållande. Men det är fixeringen av perfusion inte alltid är möjligt (vilket var fallet med apan vävnaden) och DiOLISTIC märkning kan fortfarande framgångsrikt tillämpas enligt olika förfaranden för mjukpapper beredning. Här beskriver vi tre olika förfaranden för mjukpapper förberedelser:

1. Fix hjärnan genom transcardiac perfusion → bort hjärnan → postfix i 10 min → skära skiva → fläcken
2. Ta bort hjärnan → skära block av vävnad → fixa blockera → tvätta i PBS → skära skiva → fläcken
3. Ta bort hjärnan → skära skivor → fixa → tvätta → fläcken

I föreliggande studie var apan hjärnor från personer som transcardially var perfusion med iskallt konstgjorda cerebrospinalvätska (ACSF) före hjärnan skörd och ett block (4 mm tjock) av vävnad som innehåller caudatus ennd putamen fastställdes i 60 min i rumstemperatur. För alla förfaranden, innehåller fixativ lösning 4% paraformaldehyd och 4% sackaros i PBS (beredd färska eller användas inom 15 dagar). Det är viktigt att notera att fixering tider är kritiska för en lyckad färgning. Overfixation kan påverka färgning genom att störa integriteten i plasmamembranet och orsakar färgen att läcka ut ur cellen (se mer information under resultat).

1. För förfarande A och B, skivor (200μm) klipp från fasta hjärnan eller vävnad block och skivor placerad i 24-brunnar med PBS. För förfarande C, färska akut hjärnan skivor (200 mikrometer) skära med en vibratome i kallt lösning för kapning som innehåller (i mm) 110 Kolin-Cl, 25 NaHCO _3, 1,25 NaH ₂ PO _4, 2,5 KCl, 0,5 CaCl _2, 7 MgCl _2, 25 glukos, 11,6 askorbinsyra, 3,1 pyrodruvsyra (osmolaritet = 310 mOsmols) och direkt efter skivor placerad i 24-brunnars plattor och fast i 30 min med fixativ lösning vid rumstemperatur.
2. Tvätta skivor med PBS, 3 gånger.
3. Innan fotograferingen skivor, ta bort PBS från brunnarna och, med hjälp av en pensel, placera skiva i mitten av brunnen.
4. Skjut DII kulor genom 3,0 ìm filterpapper med en Helios systemet Gene Gun vid 120-180 psi heliumgas trycket genom att placera vapnet på ett avstånd av 1,5 cm mellan provet och i slutet av fat.
   (Viktigt:. Endast nervceller inom 50 mm för den del ytan märkas med denna metod så det är viktigt att hålla samma sida av skiva uppåt under de tvättar och för montering På detta sätt kommer du att se till att märkta nervceller kommer att vara inom brännvidd när avbildning med en konfokalmikroskop).
5. Tvätta skivor med PBS 3 gånger och lagra dem i PBS under flera timmar så att DII att sprida längs dendriter.
6. Montera skivorna på en glasskiva med Förläng Guld Antifade och täck med en 18X18 mm No.1 täckglas. (Obs: för förfarande C, är det bäst att montera skivor på samma dag som integritet skivor inte är väl underhållna över natten).
7. Täta med tydliga nagellack efter montering media har torkat.
8. Alternativt kan skivor färgas med antikroppar före montering som beskrivs nedan.
   (OBS: Bilder kan användas i minst 6 månader till ett år om den förvaras i mörker vid 4 ° C. DII är ljuskänsligt och långvarig exponering för ljus gör att fläcken att blekna).

4. Antibody Färgning: immunfärgning bör utföras efter steg 3,4 och före montering.

1. Permeabilization: Inkubera skivor på 0,01% Triton X-100 i PBS-lösning i 15 min i rumstemperatur (300-500 l per brunn).
   OBS: Använd inte högre koncentrationer av rengöringsmedel eftersom detta kommer att lösa upp DII och avsevärt minska den fluorescerande färgning. Försök att minimera tiden i tvättmedel så omfattande inkubationer kommer också att minska DII märkning. Om förlängd inkubationer behövs, hålla skivor i PBS snarare än i blockerande lösningen.
2. Blockering: Inkubera skivor i blockerande lösningen innehåller 10% get serum, 0,01% Triton X-100 i PBS i 30 minuter vid rumstemperatur.
3. Primär antikropp: Lägg antikroppar vid önskad spädning i blockerande lösningen (t.ex. kanin anti-GFP antikroppar vid 1:1000 utspädning). Tillsätt 300-500 l per brunn och inkubera under 1-2 timmar. (Obs: om natten inkubationer behövs, ta bort tvättmedel från blockerande lösningen).
4. Tvätta skivor med PBS för 5 - 15 min, 3 gånger.
5. Sekundär antikropp: Odla med sekundär antikropp i 30 minuter vid rumstemperatur. Förbered sekundär antikropp lösning vid önskad spädning i blockerande lösningen (t.ex. Alexa-Fluor 488 konjugerade antikroppen på 1:1000 utspädning).
6. Tvätta skivor med PBS i 5-15 min, 4 gånger.
7. Montera skivor på diabilder med Förläng Guld Antifade och täck med en 18x18 mm No.1 täckglas. Tätning med nagellack efter montering media har torkat.

5. Representativa resultat:

1. Kontroll för korrekt märkning: Avsnitt kan visualiseras i ett fluorescerande dissekera omfattning utrustad med en kvicksilverlampa och röda fluorescerande filter kub för att bekräfta lyckad DiOLISTIC märkning. Figur 1 visar exemplariskt bilder av fint heter hjärnans delar som erhålls vid låg förstoring. Två viktiga egenskaper för att leta efter är en gles märkning mönster (Figur 1A) och förmågan att identifiera enskilda cellulära komponenter (Figur 1B-C). Felsökning DiOLISTIC märkning: Figur 2 visar exempel på sektioner där DiOLISTIC märkningen fungerade felaktigt. Enligt vår erfarenhet finns det tre huvudsakliga orsaker till ineffektiva märkning:
   • Märkning är för glest eller tätt: Mycket få celler är märkta per avsnitt i det ena fallet eller för många celler är märkta förhindra isolering och studiet av enskilda cellulära element. Lösning: Justera koncentrationen av belagda pärlor i den slutliga lösning som används för beläggning av TEFZEL kula slangen (avsnitt 1,6). Minska eller öka mängden vatten (3 ml initiala värdet) används för att lösa kulorna för att korrigera för alltför glesa eller för tät märkning, respektive. Dessutom kan låga effektivitet märkning orsakas av mindre än optimal gastrycket när du fotograferar den belagda pärlor på sektionerna. Denna möjlighet kan uteslutas genom att se till att TEFZEL kulan slangen har släppt de flesta av de belagda pärlor och det verkar klart efter fotografering. Annars bör gastryck för fotografering ökas.
   • Bad kulor: stora klumpar eller kluster av färg-belagda wolfram pärlor bildas under kulan beredning. Avsnitten kommer att likna exempel i Figur 2A-B. Lösning: göra nya kulor med särskild hänsyn till punkt 1.5 och / eller utöka ultraljudsbehandling tid i avsnitt 1.6.
   • Över-fixering: vävnad hålls i paraformaldehyd lösning längre än optimalt krävs tid för att fastställa (30 minuter för 200-300 ìm sektioner, 1 timme för 4 mm sektioner). Detta äventyrar integriteten i plasmamembranet och producerar märkt sektioner som ser ut som de som visas i figur 2C-D, där märkningen verkar ofokuserad på grund av spridning av färg ur cellerna. Lösning: Minska fixering tid.
2. Konfokala imaging: Bild stackar förvärvas med hjälp av ett konfokalmikroskop (Zeiss LSM 510 META) med 20x objektiv för hela cellen och 63x nedsänkning i vatten mål för Dendrite segment. DII var upphetsad med hjälp av en DPS 561 linje nm laser och grön fluorescens från den sekundära antikroppen var glada med hjälp av en 488 line nm laser. Den optiska sektionering av den märkta provet uppnås när man använder konfokalmikroskopi möjliggör för isolering av enskilda märkta celler i provet. Figur 3a visar en striatala neuron medelstora taggiga från mus hjärnan och dess komplexa Dendrite gren mönster. Hög förstoring bilder av Dendrite grenar av dessa nervceller från gnagare (Figur 3B) och icke-mänskliga primater (Figur 3C) visar graden av färgning i dendriter och Dendritutskotten att använda denna teknik i båda arterna. Dendriter och deras utskjutande delar (taggar) visas väldefinierad, även om man ser den långa, tunna ryggrad huvuden så rikligt i medium taggiga nervceller.
   
   Vid kombination DiOLISTICS med immunfärgning är konfokal avbildning också användbar för att entydigt lokalisera fläcken till samma fokalplanet och samma cell. Figur 4 visar ett exempel på colocalization av DII märkning och immunfärgning för GFP i en enda cell. Bilden är en stack (0,7 ìm z-avsnitt) från en striatala skiva från en transgen mus som uttrycker fluorescerande proteinet GFP under D1 dopamin-receptorn promotor.

Figur 1. DII märkning av nervceller i hjärnan skivor från icke-mänskliga primater. (A) låg förstoring bild av en färgad hjärna skiva som innehåller caudatus kärnan från en cynomolgusapa som visar glesa märkning av nervceller med DII. (BC) Isolerade medelstora taggiga nervceller kan lätt identifieras med hjälp av en fluorescerande dissekera omfattning.

Figur 2. Felsökning DiOLISTIC märkning. (AB) Betsad skivor från dorsala striatum hos apa (A) och mus (B) visar stora klumpar av färg-belagda kulor och som en konsekvens kan inga enskilda cellulära element urskiljas. (CD) bilder som exemplifierar resultatet av att tillämpa DiOLISTIC märkning för att sektioner som hölls i fixativ lösning för längre perioder eller där vävnad Säkerhetskopiering misslyckades i Monkey (C) och mus (D) vävnad.

Figur 3. Confocal bild av striatala medelstora taggiga neuron fläckad med DII. (A), gör bildstapel av en hel cell för morfologisk analys av dendritiska grenar. (BC) Dendrite segment från mus (B) och apa (C) medium taggiga nervceller visar tydlig märkning av Dendrite och ryggar.

Figur 4. Kombinera DiOLISTIC märkning med immunfärgning. (A) DII märkt (B) immunfärgning med anti-GFP antikropp som beskrivs av metoder som är anpassade från Lee et al. (2006). Samma område som A. (C) Sammansatt bild av röd och grön fluorescens identifierar DII-märkta neuron som en GFP-positiv neuron.

Discussion

DiOLISTIC märkningen är en av de mest mångsidiga tekniker för fluorescerande märkning celler eftersom det kan appliceras på vävnadssnitt från olika arter, till ett brett spektrum av åldrar och att vävnad som erhållits färska eller från fixativ-perfusion djur (se även Gan et al ., 2009). Processen är relativt snabb som det tar 1-2 dagar och det kan kombineras med andra mer klassiska märkning metoder såsom immunfärgning (Lee et al., 2006). Särskild uppmärksamhet bör ägnas att undvika över fastställande och användning av höga tvättmedel koncentrationer i inkubationstiden lösningar eftersom dessa kommer att bestå av integriteten i lipofila membranet och orsaka färgen läcker ut ur cellerna. Antikropp penetration kan underlättas genom låga koncentrationer av Triton X-100 (Lee et al., 2006), liksom digitonin eller saponin i inkubationen lösningen (Matsubayashi et al., 2008). Vissa modifieringar som kan tillämpas på denna teknik inkluderar användning av kulor med flera färger som beskrivs av Gan et al. (2000) eller ändra längd och typ av antikropp exponering (Neely et al., 2009).

Traditionellt har DII använts för att spåra neuronala prognoser i hjärnan. DiOLISTIC märkning utökar sin ansökan genom att beskriva en metod värdefullt att undersöka cellmorfologin. Neuronala morfologi är av stort intresse på grund av den stora mångfald som finns i hjärnan och spekulationer om att cellen formen kan fundera på vilken funktion mångfald av neuronala populationer i nervsystemet. Ett exempel på detta är det faktum att många nervceller i däggdjur nervsystemet visa små utstick kallas Dendritutskotten som är platsen för glutamaterg synapser. På detta sätt kan tätheten av glutamaterg synapser på en cell vara korrelerad till tätheten av Dendritutskotten, som kan mätas med den märkning teknik som beskrivs häri. Dessutom kan andra morfologiska parametrar såsom Dendrite total längd, förgreningar mönster, dendritiska ryggraden form och täthet kvantifieras och studeras.

Användningen av fluorescerande märkning för att studera neuronal morfologi har många fördelar jämfört med mer traditionella metoder som bygger på ljusa fält mikroskopi (t.ex. Golgi färgning) eftersom den möjliggör högre upplösning konfokala avbildning. En annan fördel med att använda DII som fluoroforen i experiment som syftar till att mäta dendritiska ryggraden densitet och morfologi är dess lipofila egenskaper. DII partitioner i plasmamembranet och ger en väl definierad beskrivning av neuronala processer och dendritiska utstickande delar. Med tanke på den lilla volymen flesta Dendritutskotten (mindre än 1 femtoliter) är membranfärgning effektivare och ger bättre visualisering av små, tunna utskjutande än cytoplasmisk färgning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI)	Invitrogen	D-282
Methylene chloride	Mallinckrodt Baker Inc.	H485-06
Tungsten beads	Bio-Rad	165-2269	1.7 μm diameter
Polyvinylpyrrolidone	Calbiochem	529504
Tefzel bullet tubing	Bio-Rad	165-2441
Tubing cutter	Bio-Rad	165-2422
Helios Gene Gun	Bio-Rad	165-2431
Isopore membrane filter paper	EMD Millipore	TSTP02500	3.0 μm pore size
ProLong Gold Antifade	Invitrogen	P36930
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	30525-89-4	(16% w/v)