Summary
Biz, kemirgenler ve insan olmayan primatlardan farklı yaşlarda beyin dilimleri nöron gibi DII floresan boyalar, tanıtmak için, gen tabancasının kullanımını göstermektedir. Bu özel durumda, yetişkin farelerin (3-6 ay) ve yetişkin cynomologus maymunlar (9-15 yaşında) kullanın. Dr Lichtman laboratuvar tarafından açıklanan bu teknik, (Gan
Abstract
DiOLISTIC boyama, beyin dilimleri (O'Brien ve Lummis, 2007; Gan ve ark, 2000. Gan ve ark, 2009) nöron içine DII olarak floresan boyalar, tanıtmak için, gen tabancasının kullanır. Burada tekniği kurarken yardımcı olacak iyi ve kötü sonuçları örnek görüntüleri ile birlikte gerekli her adımı ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Deneyimlerimize göre, bir kaç adım DiOLISTICS başarılı bir uygulama için önemli rol oynadı. Bu değerlendirmeler DII kaplı mermi kalitesi, fiksatif maruz kalma ölçüde ve inkübasyon çözümlerinde kullanılan deterjan konsantrasyonu içerir. Sık karşılaşılan sorunlar için ipuçları ve çözümler verilmektedir.
Bu çok yönlü bir etiketleme tekniği yaştan geniş bir yelpazede çok sayıda hayvan türleri için uygulanabilir. Floresan transgen ifadesi güveniyor çünkü genç hayvanlarda hazırlıklarına sınırlı veya farelere sınırlıdır diğer floresan etiketleme teknikleri aksine, DiOLISTIC etiketleme, her yaştan, her tür ve genotipler hayvanlar uygulanan ve birlikte kullanılabilir belirli bir hücre ICSI'nin tanımlamak için immün. Burada beyin dilimleri etiket nöronların dendrit dallanma ve dendritik omurga morfolojisi miktarının belirlenmesi amacı ile yetişkin farelerin ve yetişkin insan olmayan primatlardan DiOLISTICS kullanımı göstermektedir.
Protocol
1. Hazırlanması DII / Tungsten Boncuk Bullets: DII (1 1'-Dioctadecyl-3, 3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat) mermi beyin dilimleri kesme önceden hazırlanmış olmalıdır. Bu prosedür, çok sayıda mermi, bir kerede nasıl hazırlanır bağlı olarak yaklaşık 2-4 saat sürer.
- Eğer yeni bir parti tungsten boncuklar başlayarak, her biri 300 mg hacimde hazırlar. Alikot 2 ml metilen klorür 6 gram tungsten askıya tarafından hazırlanmıştır. Daha sonra, pipetle 100 ul mikrofuge'de tüpler içine boncuk çözüm oda sıcaklığında saklayın alikotları 300 mg tungsten boncuk hacimde üretmek (Not: metilen klorid son derece hızlı bir şekilde buharlaşır Alkol de buharlaşmasını en aza indirmek kullanılabilir .).
- Boncuk hacimde başlarken, metilen klorür 300 ul her kısım tekrar süspansiyon (300 mg tungsten boncuklar) ve buharlaşmasını önlemek için hızlı kapsayacak. Bu miktar, 3 mermi partiler için yeterli olacaktır.
- Lipofilik boya DII 13.5 mg ağırlığında ve metilen klorid (son konsantrasyon = 3mg/100μl) 450 ul ekleyerek boya çözüm hazırlayın.
- Kat boya ile boncuk. Bir parça cam slayt yerleştirin balmumu kaplı slayt üzerine boncuk, kağıt ve pipet 100 ul tartın. 100 ul DII çözüm boncuk hafif gri renge kadar pipet ve kuru hava ile iyice karıştırın.
- Cam slayt kapalı boncuk kazıyın ve ince bir toz haline boncuk zar bir jilet kullanın (Not: birden fazla renk boyalar kontamine etmeyecek şekilde mermi yapıyor varsa, yeni bir bıçak kullanın) .
- 15 ml konik bir tüp içine kağıt ve huni üzerine Pençe boncuk boncuk tartın. 3 ml su ekleyin ve oda sıcaklığında 10-30 dakika süreyle su banyosunda sonikasyon (Not: toz ve sonication dicing, bireysel nöronların seyrek etiketleme bozacak kaplı boncuklar kümeleri oluşumunu en aza indirmek için uygulanır) .
2. Kurşun boru (TEZFEL tüp), Polyvinylpyrrolidone (PVP) çözümü ile kaplayın boncuk eki artırmak için: Polyvinylpyrrolidone (PVP) çözümü ve tüp hazırlanması.
- 10 mg PVP / ml konsantrasyonda 10 ml su PVP çözüm hazırlayın.
- Kurşun borular aracılığıyla PVP çözüm geçmek için, boru adaptörü ile 12 ml şırınga (biraz daha büyük bir çapa sahip esnek borular) kullanın ve daha sonra diğer ucunu dışarı kovmak. Yeniden, aynı anda birkaç toplu hazırlanan kat daha fazla kurşun boru çözüm. PVP çözümü kullandıktan sonra atın.
- Kurşun boru boncuk eklemek için, girdap, homojen bir çözüm üretmek, boncuk eşit boru boyunca dağıtılan bu nedenle tüp aracılığıyla boncuk çözüm çekmek için şırınga kullanmak için boncuk. ((Not:) tüpün içinde hava kabarcıklarının sayısını en aza indirmek için deneyin).
- Hazırlık istasyonu üzerinden boru Yem ve boncuk yerleşmek için izin. Sadece boncuk kalır, böylece suyu hafifçe kaldırmak için şırınga kullanın.
- Spin hazırlık istasyonu ve kuru azot gazı boru su damlacıkları artık görünür olana kadar. Bu adım, yaklaşık 10-20 dakika sürer.
- 13 mm uzunlukta ve Drierite veya susuz kalsiyum sülfat çeşit içeren sintilasyon şişeleri yer içine mermi tüp kesici ile kesin. Şişeleri ışıktan korumak için folyo ile sarın.
3. DII Boyama: Bu etiketleme tekniği, farklı türlerin beyin dokusunda nöronlar leke kullanılabilir; bu özel durumda, fare (3-6 ay) ve insan olmayan primatlardan (9-15 yaşında) .
Dokusunun korunması, bu koşulda en iyi olması bekleniyor, çünkü dilim fiksatif çözüm transcardiac perfüzyon ile elde edilen sabit beyin dokusu hazır olduklarını tercih edilir. Ancak, perfüzyon fiksasyon her zaman mümkün değildir (maymun dokusu ile olduğu gibi) ve DiOLISTIC etiketleme hala başarılı bir doku hazırlanması için farklı prosedürler altında uygulanabilir. Burada doku hazırlanması için üç farklı prosedürler açıklanmaktadır:
- Transcardiac perfüzyon beyin Fix → 10 dakika → kesilmiş dilim beyin → postfix kaldırmak → leke
- Beyin → doku kesme blok → düzeltme blok → PBS → kesilmiş dilim yıkayın → leke çıkarın
- Beyni Kaldır → kesilmiş dilim → düzeltme → → leke yıkayın
Bu çalışmada, maymun beyinleri transcardially buz gibi yapay beyin omurilik beyin hasat öncesi sıvı (ACSF) kaudat içeren bir doku bloğu (4 mm kalınlığında) ile perfüze deneklerin elde edildind putamen oda sıcaklığında 60 dakika süreyle tespit edildi. Tüm prosedürler için, fiksatif çözüm,% 4 paraformaldehid ve% 4 PBS (taze olarak hazırlanır ya da 15 gün içinde kullanılmalıdır) sakaroz içerir. Fiksasyon kez başarılı boyama için kritik olduğunu not etmek önemlidir. Overfixation plazma membran bütünlüğünü bozan ve sonuçlarının altında daha fazla bilgi edinmek hücre dışına sızıntı boya neden boyama etkileyebilir.
- Prosedür için a ve b sabit beyin veya doku blok ve PBS ile 24 plaka yerleştirilir dilim, dilim (200μm) kesilir. C prosedürü için, taze akut beyin dilimleri (200 mm), soğuk kesme çözümü içeren bir vibratome (mM) 110 Kolin-Cl, 25 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 2.5 KCl, 0.5 CaCl 2, 7 MgCl kesilir 2, 24-kuyucuğu 25 glikoz, 11.6 askorbik asit, 3.1 pirüvik asit (ozmolarite = 310 mOsmols) ve hemen dilimleri sonra yerleştirilir ve 30 dakika oda sıcaklığında fiksatif solüsyonu ile sabit.
- PBS ile dilimleri, 3 kere yıkayın.
- Çekim dilimleri önce PBS, kuyulardan kaldırmak ve bir fırça kullanarak, dilim iyi merkezine yerleştirmek.
- DII mermi silah örnek ve varil sonunda 1,5 cm arasında bir mesafe koyarak 120-180 psi helyum gaz basıncı kullanarak bir Helios Gen Tabancası sistemi 3.0 mikron filtre kağıdı ile vur.
(Önemli not: yıkar ve montaj sırasında yukarı bakacak şekilde dilim aynı tarafında tutmak için önemlidir bu yüzden bu şekilde, emin olun, bu yöntemle Sadece dilim yüzeyi 50 mm içinde nöronlar etiketli olacak bu konfokal bir mikroskop ile görüntüleme) etiketli nöronlar odak mesafesi içinde olacak. - PBS 3 kez dilim yıkayın ve DII dendritler yayılabilir izin vermek için birkaç saat için PBS içinde saklayın.
- Altın Antifade uzatmak ile cam slayt üzerine dilim Dağı ve 18x18 mm No.1 lamel ile kaplayın. (Not: prosedürü c dilimleri bütünlüğünü de gecede korunmaz olarak aynı gün dilimleri monte etmek en iyisidir).
- Seal yarığına sonra şeffaf tırnak cilası ile kuruduktan.
- Alternatif olarak, dilim montaj aşağıda açıklandığı gibi önce antikorlar ile lekeli olabilir.
(Not: 4 karanlık saklandığı takdirde, Slaytlar, bir yıl için en az 6 ay kullanılmalıdır ° C DII leke solmaya sebep olur, ışık, ışığa duyarlı ve uzun süreli maruz kalma).
4. Antikor Boyama: immün sonra adım 3.4 ve montaj önce yapılmalıdır.
- Permeabilization: 0.01% inkübe dilim oda sıcaklığında 15 dakika (ortalama 300-500 ul) PBS çözüm Triton X-100.
NOT: Bu DII çözülür ve floresan boyama önemli ölçüde azaltacaktır yüksek konsantrasyonda deterjan kullanmayın . Geniş inkubasyon DII etiketleme azaltmak olarak deterjan süresini en aza indirmek için deneyin. Eğer uzun inkubasyon gerekli çözümü engelleme PBS dilimleri tutmak yerine. - Engelleme: inkübe dilimleri% 10 keçi serumu içeren çözüm engelleme,% 0.01 oda sıcaklığında 30 dakika süreyle PBS içinde Triton X-100.
- Primer antikor: engelleme çözümü (örneğin 1:1000 dilüsyon tavşan anti-GFP antikor) istenilen seyreltme antikor ekleyin. Ortalama 300-500 ul ekleyin ve 1-2 saat boyunca inkübe edin. (Not: bir gecede inkubasyon gerekli olup olmadığını, çözüm engelleme deterjan kaldırın).
- 5 için PBS ile dilimleri Yıkama - 15 dakika, 3 kez.
- İkincil antikor: sekonder antikoru ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Engelleme çözümü istenilen seyreltme (örneğin 1:1000 dilüsyon Alexa Fluor 488 konjuge antikor) ikincil antikor çözüm hazırlayın.
- 5-15 dakika, 4 kez dilim PBS ile yıkayın.
- Mount slaytlara dilimleri Altın Antifade uzatmak ve 18x18 mm No.1 lamel ile kaplayın. Montaj medya sonra oje ile Seal kuruduktan.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
- Doğru etiketleme denetleniyor: Bölüm cıva lambası ve başarılı DiOLISTIC etiketleme onaylamak için kırmızı floresan filtre küp ile donatılmış bir floresan diseksiyon kapsamında görüntülenebilmekte. Şekil 1 örnek düşük büyütmede elde edilen güzel etiketli beyin bölümlerinin görüntüleri gösterir. Aramak için iki önemli özellikleri seyrek bir etiketleme deseni (Şekil 1A) ve bireysel hücresel bileşenleri (Şekil 1B-C) tanımlamak için yeteneği. Sorun Giderme DiOLISTIC etiketleme: Şekil 2 DiOLISTIC etiketleme yanlış çalıştığı bölümleri örnekleri gösterir. Deneyimlerimize göre, verimsiz etiketlenmesi için üç ana nedeni vardır:
- Etiketleme çok seyrek veya yoğun: Çok az hücreleri bir durumda bölüm başına etiketli ya da çok fazla hücre, tek hücre elemanlarının izolasyonu ve çalışma önlenmesi etiketlenir . Çözüm: Tefzel kurşun borular (bölüm 1.6) için kullanılan kaplama nihai çözüm kaplı boncuklar konsantrasyon ayarlayın. Azaltın veya sırasıyla, çok seyrek ya da çok yoğun etiketleme düzeltmek için boncuk çözmek için kullanılan su (3 ml başlangıç değeri) hacmini artırmak. Buna ek olarak, düşük verimlilik, etiketleme bölümleri üzerine kaplı boncuklar çekim yaparken optimum gaz basıncı daha az neden olabilir. Bu olasılık Tefzel kurşun boru kaplı boncuklar en yayımladı ve bu çekimden sonra açık göründüğünü emin yaparak ekarte edilebilir. Aksi takdirde, çekim için gaz basıncı artmış olmalıdır.
- Kötü mermi mermi hazırlanması sırasında büyük öbekler veya boya kaplı tungsten boncuklar kümeleri oluşur. Bölüm Şekil 2A-B örnekler benziyor. Çözüm: bölüm 1.5 ve / veya özel dikkat yeni mermi yapmak veya bölüm 1.6 'da sonication süresini uzatmak.
- Aşırı fiksasyon: doku paraformaldehid çözüm sabitleme (200-300 mikron bölümler için 30 dakika, 4 mm bölümler için 1 saat) için optimal gerekli süreden daha uzun süre tutulur. Bu plazma membran bütünlüğünü tehlikeye atmakta ve etiketleme odak hücrelerinin boya dağılımı nedeniyle göründüğü Şekil 2C-D gösterilenlerden benzeyen etiketli bölümleri üretir. Çözüm: fiksasyon süresini azaltmak.
- Konfokal görüntüleme: Resim yığınları dendrit segmentleri için tüm hücre ve 63x suya daldırma hedefi için 20x objektif ile bir konfokal mikroskobu (Zeiss LSM 510 META) kullanılarak elde edilir. DII ikincil antikor DPS 561 nm lazer hattı ve yeşil floresan kullanarak 488 nm lazer hattı kullanarak heyecanlı heyecanlı oldu. Etiketli örnek konfokal mikroskobi kullanılarak elde edilen optik kesit daha örnek tek işaretli hücrelerin izolasyonu sağlar. Şekil 3A, farenin beyin ve karmaşık dendrit şube desen bir striatal orta dikenli bir nöron gösterir. Kemirgen (Şekil 3B) ve insan dışı primat (Şekil 3C) bu nöronların dendrit dalları Yüksek büyütme görüntüleri, her iki türde de bu tekniği kullanarak dendritler ve dendritik dikenler boyanma derecesi göstermektedir. Uzun, ince bir omurga orta dikenli bir nöron bu kadar bol kafaları dikkate bile Dendritler ve çıkıntılar (dikenleri), tanımlanmış görünür.
DiOLISTICS immün ile birleştirirken, aynı odak düzlemi ve aynı hücrede su götürmez bir leke lokalize konfokal görüntüleme de yardımcı olur. Şekil 4 DII etiketleme ve tek kişilik bir hücrede GFP için immün ko bir örnek gösterir. Görüntü D1 dopamin reseptör organizatörü altında floresan protein, GFP ifade eden bir transgenik fare bir striatal dilim elde edilen bir yığın (0.7 mikron z-bölüm).
Şekil 1. Insan olmayan primatlardan beyin dilimleri nöron DII etiketleme. (A) Düşük büyütme görüntü DII ile nöronların seyrek etiketleme gösteren bir Sinomolgus maymun kaudat nükleus içeren bir lekeli beyin dilim (BC) İzole orta dikenli bir nöron bir floresan diseksiyon kapsamı kullanarak kolayca tespit edilebilir.
Şekil 2 Sorun Giderme DiOLISTIC etiketleme. (AB), dorsal maymun striatum (A) ve fare Vitray dilimleri (B), boya kaplı boncuklar büyük öbekler gösteren ve bunun sonucu olarak, hiçbir bireysel olarak hücresel elementler ayırt edilebilir (CD) Görüntüler DiOLISTIC uygulanması sonucu örneklemek zaman ya da nerede dokusunun korunması, uzun süreler için sabitleştirici çözüm tutuldu bölümlerine etiketleme maymun (C) ve fare (D) doku başarısız oldu.
Şekil 3 DII ile boyandı striatal orta dikenli bir nöron Konfokal görüntü. (A), tüm hücre Resim yığını (BC) Dendrite segmentleri fareden. Dendritik dalların morfolojik analizi için (B) ve maymun (C) orta dikenli bir nöron dendrit ve dikenler net etiketleme göstermektedir.
Şekil 4. Immün DiOLISTIC etiketleme birleştiren. (A) DII etiketli
Discussion
Yaştan geniş bir yelpazede, farklı türlerin doku kesitlerinde uygulanan ve doku taze veya fiksatif-perfüze hayvanlar elde edilebilir, çünkü DiOLISTIC etiketleme (aynı zamanda Gan ve ark floresan etiketleme hücreler için kullanılabilir çok yönlü teknikleri biridir , 2009). Bu süreç 1-2 gün alır gibi nispeten hızlı ve immün (Lee ve ark, 2006) gibi diğer klasik etiketleme yaklaşımları ile kombine edilebilir. Bu lipofilik membran bütünlüğünü oluşturan ve boya hücreleri dışarı sızmasına neden çünkü sabitleme ve yüksek deterjan konsantrasyonlarının inkübasyon çözümler kullanımı üzerinde özel bir dikkat önlemek için dikkat edilmelidir. Antikor penetrasyonu düşük konsantrasyonlarda kolaylaştırılabilir Triton X-100 inkübasyon çözüm (Lee ve ark, 2006) yanı sıra digitonin veya saponin (Matsubayashi ve ark, 2008). Bu teknikte uygulanan bazı değişiklikler Gan ve ark (2000) veya değişen uzunluğu ve tipi antikor maruz kalma (Neely ve ark, 2009) tarafından açıklandığı gibi birden fazla boya ile mermi kullanımını içerir .
Geleneksel olarak, DII beyindeki nöronal projeksiyonları takip etmek için kullanılır olmuştur. DiOLISTIC etiketleme hücre morfolojisi incelemek için yararlı bir yöntem açıklayan uygulama genişletir. Nöronal morfolojisi, büyük ilgi nedeniyle, beyin ve hücre şekli, sinir sisteminde nöronal popülasyonlarının fonksiyonu çokluğu yansıtıyor olabilir spekülasyon içinde bulunan büyük bir çeşitlilik. Bunun bir örneği, birçok memeli sinir sistemi ekran küçük çıkıntı nöronların dendritik dikenler glutamaterjik sinaps site adını verdiği bir gerçektir. Bu şekilde, bir hücre üzerine glutamaterjik sinaps yoğunluğu dendritik dikenler yoğunluğu, burada açıklanan etiketleme tekniği kullanılarak ölçülebilir korelasyon olabilir. Ayrıca, dendrit toplam uzunluğu, dallanma deseni, dendritik omurga şekli ve yoğunluğu gibi diğer morfolojik parametreler sayısal ve incelenmelidir.
Nöronal morfoloji eğitim için floresan etiketleme kullanımı, daha yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme için izin verdiğinden, parlak bir alan mikroskobu (örneğin Golgi boyama) güveniyor daha geleneksel tekniklerle karşılaştırıldığında pek çok avantajı vardır. Morfolojisi DII dendritik omurga yoğunluk ölçüm yönelik deneylerde fluorofor olarak kullanarak ve bir başka avantajı lipofilik özellikleri. DII plazma zarı içine bölümleri ve nöronal süreçleri ve dendritik çıkıntılar iyi tanımlanmış bir anahat sağlar. Dendritik dikenler (1 femtoliter az) küçük hacim göz önüne alındığında, membran boyanması daha verimli ve daha küçük, ince çıkıntılar sitoplazmik boyanma daha iyi bir görünüm için izin verir.
Disclosures
Bütün hayvan prosedürleri NIAAA ve Oregon Ulusal primat Araştırma Merkezi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi rehberlik takip yapıldı. Yazarlar ifşa etmek için bir şey var.
Acknowledgments
Biz konfokal mikroskop erişim için teknik ve Dr. Fumi Ono s laboratuar ilk kurulum sırasında Michael Feyder ve Terrell Holloway, yardım için kabul etmek istiyorum. Bu araştırma, NIAAA ve NINDS intramural programı aracılığıyla Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI) | Invitrogen | D-282 | |
| Methylene chloride | Mallinckrodt Baker Inc. | H485-06 | |
| Tungsten beads | Bio-Rad | 165-2269 | 1.7 μm diameter |
| Polyvinylpyrrolidone | Calbiochem | 529504 | |
| Tefzel bullet tubing | Bio-Rad | 165-2441 | |
| Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | |
| Helios Gene Gun | Bio-Rad | 165-2431 | |
| Isopore membrane filter paper | EMD Millipore | TSTP02500 | 3.0 μm pore size |
| ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | (16% w/v) |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOLISTIC" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harb Protoc. , pdb.prot5202-pdb.prot5202 (2009).
- Grutzendler, J., Tsai, J., Gan, W. B. Rapid labeling of neuronal populations by ballistic delivery of fluorescent dyes. Methods. 30, 79-85 (2003).
- Lee, K. W., Kim, Y., Kim, A. M., Helmin, K., Nairn, A. C., Greengard, P. Cocaine-induced dendritic spine formation in D1 and D2 dopamine receptor-containing medium spiny neurons in nucleus accumbens. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 3399-3404 (2006).
- Matsubayashi, Y., Iwai, L., Kawasaki, H. Fluorescent double-labeling with carbocyanine neuronal tracing and immunohistochemistry using a cholesterol-specific detergent digitonin. J Neurosci Methods. 174, 71-81 (2008).
- Neely, S. tanwood, Deutch, G. D., Y, A. Combination of diOlistic labeling with retrograde tract tracing and immunohistochemistry. J Neurosci Methods. 184, 332-336 (2009).
- O'Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun. Trends Biotechnol. 25, 530-534 (2007).
- Shen, H. W., Toda, S., Moussawi, K., Bouknight, A., Zahm, D. S., Kalivas, P. W. Altered dendritic spine plasticity in cocaine- withdrawn rats. J. Neurosci. 29, 2876-2884 (2009).
