Summary
In dit artikel tonen we een methode om glazen capillaire naalden te maken met een 50-um lumen. Deze techniek vermindert de schade aan de hersenen, minimaliseert passieve diffusie van geneesmiddelen en maakt een nauwkeurige targeting naar de knaagdieren hersenen.
Abstract
Micro-injecties in de hersenen parenchym van belang zijn procedures aan drugs, virale vectoren of cel transplantatie te leveren. De hersenen letsel dat een naald injecteren produceert tijdens zijn baan is een groot probleem vooral in de hersenen van muizen niet alleen voor de hersenen is klein, maar soms ook meerdere injecties nodig zijn. We tonen hier een methode om glazen capillaire naalden te produceren met een 50-um lumen die aanzienlijk vermindert de schade aan de hersenen en maakt het mogelijk een nauwkeurige targeting naar de knaagdieren hersenen. Met deze methode kan een levering van kleine hoeveelheden (20 tot 100 nl), vermindert het bloeden risico's, en minimaliseert passieve verspreiding van drugs in de hersenen parenchym. Door het gebruik van verschillende grootte van capillaire glazen buisjes, of het wijzigen van de naald lumen, kunnen verschillende soorten stoffen en cellen worden geïnjecteerd. Micro-injecties met een glazen capillair vertegenwoordigen een aanzienlijke verbetering in injectietechnieken en deep brain richten met minimale collateral damage in de kleine knaagdieren.
Protocol
- Maak glazen naalden voor de muis de operatie:
- Zet de capillaire glazen buis in een micropipet trekker.
- Verwarm het midden van de glazen buis om de glazen buis verzachten in de gelokaliseerde gebied.
- Stretch de glazen buis langs zijn lengteas door een eerste afstand voldoende is om een vermindering van de diameter van de glazen buis in de gelokaliseerd gebied veroorzaken.
- Houd het uitrekken van de glazen buis tot het breekt. Op deze manier worden twee identieke enkele vat naalden verkregen.
- Zet de glazen naald in een microforge. Een hoek van 30 ° is voldoende om afschuining van de tip.
- Controleer onder de microscoop dat elke naald op de juiste inwendige diameter heeft. Voor de meeste van de hydrofiele drugs 30-50 micrometer binnendiameter is ideaal (figuur 1).
- Vul de naald met minerale olie uit de breedste einde van de glazen naald. Laat dat minerale olie (MSDS, Cat. M7700) komt door capillariteit tot aan ~ 50% van de lengte van het capillair. Zet hoogvacuüm vet (Dow Corning, Cat. 05054-AB) rond de zuiger aan het breedste uiteinde van de naald afdichting.
- Plaats de zuiger door het breedste uiteinde van de naald en druk zachtjes minerale olie totdat er een klein druppeltje olie wordt gezien uit te gaan van het uiteinde van de glazen naald.
- Zet de glazen naald in de houder van de microinjector.
- Verdoven van de muis met 2,5% Avertin (2,2,2-tribroomethanol + tert-amyl alcohol, 1:01 w / v). Dosis 25-30μL per gram intraperitoneale.
- Doe een verwarming pad op de stereotactische apparaat dier lichaamstemperatuur te houden op 37 ° C.
- Plaats en zet de muis hoofd in de stereotactische apparaat met behulp van oor bars en een gebit houder.
- Reinig de muis hoofd met 0,1% chloorhexidine gluconaat oplossing, gevolgd door 70% ethanol en 0,1% chloorhexidinegluconaat voor een tweede keer.
- Incise de huid met een chirurgisch mes # 15 van muis oren naar de Lamba schedel lijn.
- Poolse de schedel met een katoenen swap om het te drogen uit en trek de huid uit het chirurgische veld.
- Gebruik het uiteinde van de glazen naald te wijzen op de top van de Bregma hechtdraad. Daar heb je de eerste positie van de injector (de coördinatie van "nul") in te stellen.
- Stel het punt in worden geboord door het bewegen van de "X" en "Y"-as van stereotactische apparaat via de schedel.
- Boor zeer zorgvuldig gaten op het gewenste coördinatensysteem. Microdrills en andere metalen gereedschappen werden eerder gesteriliseerd bij 250 ° C gedurende 60 seconden met een droog glas kraal sterilisator (Cole Palmer, Cat. No EW-10779-00).
- Met fijne pincet verwijder voorzichtig de diepste laag van het bot en breek de duramatter membraan (je zal wat cerebrale spinale vloeistof lekt uit te zien).
- Controleer of de naald kan gaan door de geboorde gaten.
- Pipetteer een ui van het geneesmiddel dat u wilt injecteren en zet het op een klein stukje van Parafilm.
- Zet de parafilm op de schedel.
- Zuigen het geneesmiddel door het draaien van de microinjector wiel, terwijl u controleren onder de microscoop dat de vloeistof gaat omhoog in de glazen naald.
- Verwijder de parafilm en opnieuw instellen van de nul te coördineren.
- Verplaats de naald naar de geselecteerde coördinaten, de houder naar beneden tot aan het uiteinde van glazen naald zachtjes aanraken van de hersenen oppervlak en zet de "Z" te coördineren op nul.
- Introduceer het glas naald in de hersenen parenchym bij geselecteerde diepte.
- Injecteer het geneesmiddel langzaam tempo van ~ 1 nl / sec.
- Wanneer het verlangen volume wordt geïnjecteerd, laat het medicijn diffunderen in het parenchym gedurende 2 minuten. Ga dan naar de naald te verwijderen soepel en langzaam.
- Lijm de chirurgische wond en verwijder het dier uit de stereotactische apparaat en zet het dier in een voorverwarmde kooi met een schoon bed voor anesthesie herstel.
- Om post-operatieve analgesie alle dieren kregen 5 mg / kg subcutaan ketorolac elke 12-uur gedurende 24 uur
Representatieve resultaten:
Wanneer na dit protocol, is een zeer nauwkeurige injectie verkregen en een zeer smalle naald spoor minimaliseert hersenletsel. Als vertegenwoordiger gevolg van deze methode, we geïnjecteerd lysophosphatidyl choline (lysolecithin) in het corpus callosum, dat demyelinisatie van de witte stof traktaten 1-4 produceert. Om het hersenletsel geproduceerd door de glazen naald, we geïnjecteerd slechts 20 nl van lysolecithin in het corpus callosum, maar indien nodig hogere volumes zoveel als 200 nl kan worden geïnjecteerd met dezelfde methode. Demyelinisatie wordt gedetecteerd door de afwezige van myeline basis eiwitexpressie in de witte stof traktaten (figuur 2).
Figuur 1. Een glazen naald met een 50-um diameter. Afstand tussen twee korte tikkenin de schaal staat voor een 50-um lengte.
Figuur 2. Lysolecithin injectie in het corpus callosum. Demyelinisatie wordt weergegeven als een no myeline basis proteïne-expressie (gestippelde gebied). Let op de geringe omvang van glazen naald-darmkanaal (pijlen). Bar = 100 micrometer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methode bleek in deze video is zeer nuttig voor de meeste van de drugs of virale vectoren te leveren in een zeer precieze plaatsen in de hersenen. Enkele van de belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de betrouwbaarheid van de targeting punt, de nauwkeurigheid van injecties en het kleine formaat van de hersenen letsel en schade-darmkanaal 1, 2, 5, 6. Zodra de techniek is gestandaardiseerd het bereik van de mistargeting moet 50 micrometer of kleiner 1, 2. Cel transplantaties kan ook gedaan worden door gebruik te maken breder, 100-150 um 7-9, naalden. Daarom is een efficiënte cel levering kan worden gestort op zeer specifieke laesie het minimaliseren van collateral damage veroorzaakt door celtransplantatie. Er zijn drie cruciale stappen in deze techniek:
- We raden altijd aan krassen zachtjes de schedel met een insuline naald om de geselecteerde coördinaten label voor boren.
- Introduceer het glas naald met een snelle beweging om snel doordringen in de hersenen oppervlak.
- Zodra de optimale diepte is bereikt moet u introduceren de naald 0,1 mm dieper in de hersenen parenchym om een 'kanaal' waarmee drug vrij diffunderen in de hersenen te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
OG-P werd ondersteund door CONACyT s-subsidie (CB-2008 tot 101.476) en Fraba (686/10). AQ-H ondersteund door de National Institute of Health, de Howard Hughes Medical Institute, de Robert Wood Johnson Foundation en de Maryland Stem Cell Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary glass tube | Wiretrol I | 5-000-1001 | |
| Micropipette puller | Kopf Instruments | Model 730 | |
| Microforge | World Precision Instruments, Inc. | Model 48000 | |
| Mineral oil | MSDS | M7700 | |
| High-vacuum grease | Dow Corning | 05054-AB | |
| Anesthesia: 2.5% Avertin | 2,2,2-tribrom–thanol + tert-amyl alcohol, 1:1 w/v | ||
| Heater pad | Mastex | Model 900 | |
| Stereotactic device | Kopf Instruments | Model Kopf-900 | |
| Surgical scalpel blade # 15 | Medi-Cut | ||
| Micro driller | Ideal Micro Drill | 67-1000 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | ||
| 1-μL Micropipette | Rainin | ||
| Parafilm M. | |||
| Surgical microscope | Carl Zeiss, Inc. | Vasiorkop with Contraves system | |
| Microinjector | Narishige International | Model MO-10 |
References
- Menn, B. Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain. J Neurosci. 26, 7907-7918 (2006).
- Gonzalez-Perez, O., Romero-Rodriguez, R., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Epidermal Growth Factor Induces the Progeny of Subventricular Zone Type B Cells to Migrate and Differentiate into Oligodendrocytes. Stem Cells. 27, 2032-2043 (2009).
- Hall, S. M. Some aspects of remyelination after demyelination produced by the intraneural injection of lysophosphatidyl choline. J Cell Sci. 13, 461-477 (1973).
- Webster, G. R., Thompson, R. H. Observations on the presence of lysolecithin in nervous tissues. Biochim Biophys Acta. 63, 38-45 (1962).
- Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Subventricular Zone Astrocytes Are Neural Stem Cells in the Adult mammalian Brain. Cell. 97, 1-20 (1999).
- Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells. Neuron. 36, 1021-1034 (2002).
- Baraban, S. C. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 15472-15477 (2009).
- Richardson, R. M., Barbaro, N. M., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. Developing cell transplantation for temporal lobe epilepsy. Neurosurg Focus. 24, E17-E17 (2008).
- Alvarez-Dolado, M. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J Neurosci. 26, 7380-7389 (2006).
