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Neuroscience

ड्रग्स, वायरल वैक्टर, या सेल प्रत्यारोपण की डिलिवरी के लिए Microinjections के साथ डीप ब्रेन संरचनाओं के लक्ष्य निर्धारण

Published: December 1, 2010 doi: 10.3791/2082

Summary

इस अनुच्छेद में, हम 50-सुक्ष्ममापी लुमेन के साथ गिलास केशिका सुइयों बनाने की विधि दिखा. इस तकनीक को काफी मस्तिष्क क्षति को कम कर देता है, दवाओं के निष्क्रिय प्रसार कम से कम और कृंतक मस्तिष्क में एक सटीक लक्ष्यीकरण की अनुमति देता है.

Abstract

मस्तिष्क parenchyma में Microinjections दवाओं, वायरल वैक्टर या कोशिका प्रत्यारोपण देने के लिए महत्वपूर्ण प्रक्रियाएं हैं. मस्तिष्क घाव है कि एक इंजेक्शन सुई अपनी प्रक्षेपवक्र के दौरान पैदा न केवल मस्तिष्क लेकिन यह भी कभी कभी एकाधिक इंजेक्शन की जरूरत है छोटे के लिए एक विशेष रूप से माउस मस्तिष्क में एक प्रमुख चिंता का विषय है. हम यहाँ एक 50 सुक्ष्ममापी लुमेन है जो काफी मस्तिष्क क्षति कम कर देता है और कृंतक मस्तिष्क में एक सटीक लक्ष्यीकरण की अनुमति देता है के साथ गिलास केशिका सुइयों उत्पादन विधि दिखा. इस विधि की अनुमति देता है छोटे संस्करणों की एक प्रसव (20 से 100 nl से), खून बह रहा जोखिम को कम कर देता है, और मस्तिष्क parenchyma में दवाओं की निष्क्रिय प्रसार minimizes. केशिका ग्लास ट्यूब के विभिन्न आकार का उपयोग, या सुई लुमेन बदल करके, पदार्थों और कोशिकाओं के कई प्रकार के इंजेक्शन जा सकता है. एक गिलास केशिका ट्यूब के साथ Microinjections इंजेक्शन तकनीक और छोटे rodents में न्यूनतम संपार्श्विक क्षति के साथ गहरी मस्तिष्क लक्ष्यीकरण में एक महत्वपूर्ण सुधार का प्रतिनिधित्व करते हैं.

Protocol

  1. माउस सर्जरी से पहले कांच सुइयों:
    1. एक micropipette खींचने में केशिका ग्लास ट्यूब रखो.
    2. कांच के ग्लास ट्यूब स्थानीयकृत क्षेत्र में नरम ट्यूब के बीच हीट.
    3. अपनी अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ एक प्रारंभिक स्थानीयकृत क्षेत्र में शीशे की नली का व्यास में एक कमी के कारण पर्याप्त दूरी के अनुसार ग्लास ट्यूब खींचो.
    4. ग्लास ट्यूब खींच रखें जब तक यह टूट जाता है. इस तरह, दो समान एकल बैरल सुइयों प्राप्त कर रहे हैं.
  2. Microforge में कांच सुई रखो. एक 30 ° के कोण टिप बेवेल के लिए पर्याप्त है.
  3. माइक्रोस्कोप है कि प्रत्येक सुई सही भीतरी व्यास के तहत की जाँच करें. हाइड्रोफिलिक दवाओं के अधिकांश के लिए एक 30-50 सुक्ष्ममापी भीतरी व्यास आदर्श (1 आंकड़ा) है.
  4. गिलास सुई की व्यापक अंत से सुई भरें खनिज तेल के साथ. दो खनिज तेल (MSDS, बिल्ली M7700.) कपिलैरिटि से प्रवेश करती है जब तक यह ~ केशिका ट्यूब की लंबाई के 50% तक पहुँच है. रखो उच्च निर्वात सुई के व्यापक अंत सील सवार चारों ओर तेल (डॉव Corning, बिल्ली 05,054 अटल बिहारी).
  5. सुई की व्यापक अंत तक सवार डालें और धीरे से खनिज तेल में जब तक तेल की एक छोटी सी बूंद कांच सुई की नोक से बाहर जा रहा है देखा है धक्का.
  6. Microinjector के धारक में कांच सुई सुरक्षित.
  7. 2.5% AVERTIN (+ 2,2,2 tribromoethanol शराब tert-amyl, 01:01 w v /) के साथ माउस anesthetize. ग्राम intraperitoneal प्रति 25 30μL Dosis.
  8. Stereotactic डिवाइस जानवर के शरीर का तापमान 37 पर रखने डिग्री सेल्सियस पर एक हीटर पैड रखो
  9. प्लेस और stereotactic कान सलाखों के और एक दांत धारक का उपयोग कर डिवाइस में माउस सिर सुरक्षित.
  10. 0.1% chlorhexidine gluconate समाधान, 70% इथेनॉल और एक दूसरी बार के लिए 0.1% chlorhexidine gluconate द्वारा पीछा के साथ माउस सिर साफ.
  11. माउस कान से एक शल्य # 15 लांबा खोपड़ी लाइन के लिए ब्लेड के साथ त्वचा को काटकर अलग कर देना.
  12. एक कपास स्वैप के साथ इसे बाहर शुष्क त्वचा और शल्य चिकित्सा क्षेत्र के बाहर खींच खोपड़ी पोलिश.
  13. गिलास सुई की नोक का उपयोग करने के लिए Bregma सीवन के शिखर पर बात. वहाँ आप के लिए सुई लगानेवाला (समन्वय "शून्य") की प्रारंभिक स्थिति निर्धारित किया है.
  14. "एक्स" और "Y" खोपड़ी से अधिक stereotactic डिवाइस के अक्ष चलती द्वारा drilled किया जा बिंदु निर्धारित करें.
  15. चयनित समन्वय पर बहुत ध्यान से छेद ड्रिल. Microdrills और अन्य धातु उपकरण पहले 250 में निष्फल गया ° एक सूखी ग्लास मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ के साथ 60 सेकंड के लिए सी (कोल पामर, बिल्ली सं EW-१०,७७९-00.)
  16. ठीक संदंश के साथ ध्यान से हड्डी की गहरी परत को हटाने और duramatter झिल्ली (आप कुछ मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी में तरल पदार्थ बाहर लीक देखेंगे) को तोड़ने.
  17. पुष्टि सुई drilled छेद के माध्यम से जा सकते हैं.
  18. पिपेट आप दवा इंजेक्षन और यह parafilm के एक छोटे से टुकड़े पर डाल करना चाहते हैं की एक μl.
  19. खोपड़ी पर parafilm रखो.
  20. Microinjector पहिया कताई द्वारा दवा चूसो, जबकि आप खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें कि तरल पदार्थ गिलास सुई में जा रहा है.
  21. Parafilm निकालें और शून्य समन्वय कर रहे हैं सेट.
  22. चयनित निर्देशांक सुई ले जाएँ, धारक नीचे जब तक गिलास सुई की नोक धीरे मस्तिष्क की सतह को छूने के लिए और "Z" समन्वय शून्य पर सेट.
  23. चयनित गहराई में मस्तिष्क parenchyma में कांच सुई का परिचय.
  24. ~ 1 nl / सेक की दर में धीरे धीरे दवा इंजेक्षन.
  25. जब इच्छा मात्रा इंजेक्शन है, 2 मिनट के लिए parenchyma में दवा फैलाना चलो. तब सुई को हटाने के आसानी से और धीरे धीरे आगे बढ़ना.
  26. गोंद शल्य घाव और stereotactic डिवाइस से पशु निकालने और एक पूर्व गर्म संज्ञाहरण वसूली के लिए एक साफ बिस्तर युक्त पिंजरे में डाल जानवर.
  27. पोस्ट ऑपरेटिव analgesia प्रदान करने के लिए सभी जानवरों की 24 एच. के लिए 5 मिलीग्राम / किग्रा चमड़े के नीचे हर 12 घंटे Ketorolac प्राप्त

प्रतिनिधि परिणाम:

जब इस प्रोटोकॉल के बाद, एक बहुत ही सटीक इंजेक्शन प्राप्त है और एक बहुत ही संकीर्ण सुई ट्रैक मस्तिष्क की चोट minimizes. इस पद्धति का एक प्रतिनिधि परिणाम के रूप में, हम महासंयोजिका है कि सफेद बात 1-4 इलाकों के demyelination उत्पादन में lysophosphatidyl choline (lysolecithin) इंजेक्शन. गिलास सुई द्वारा उत्पादित मस्तिष्क चोट कम से कम करने के लिए, हम महासंयोजिका में केवल 20 lysolecithin के nl इंजेक्शन, लेकिन अगर 200 nl रूप में ज्यादा के रूप में अपेक्षित अधिक मात्रा उसी विधि के साथ इंजेक्शन जा सकता है. Demyelination myelin (चित्रा 2) सफेद बात इलाकों में बुनियादी प्रोटीन अभिव्यक्ति की अनुपस्थित के द्वारा पता लगाया है.

चित्रा 1
चित्रा 1 50-सुक्ष्ममापी व्यास के साथ एक गिलास सुई . दो छोटे ticks के बीच दूरीपैमाने में एक 50-सुक्ष्ममापी लंबाई का प्रतिनिधित्व करता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. महासंयोजिका में Lysolecithin इंजेक्शन. Demyelination एक नहीं माइलिन बुनियादी प्रोटीन अभिव्यक्ति (डॉटेड क्षेत्र) के रूप में दिखाया गया है. छोटे आकार का गिलास सुई पथ (तीर) का नोट. बार = 100 सुक्ष्ममापी

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Discussion

विधि इस वीडियो में दिखाया बहुत मस्तिष्क में बहुत ही सटीक स्थानों में दवाओं या वायरल vectors के सबसे देने के लिए उपयोगी है. इस तकनीक का मुख्य लाभ के कुछ लक्ष्यीकरण इंगित करें, इंजेक्शन और मस्तिष्क के घाव और पथ नुकसान 1, 2, 5, 6 के छोटे आकार की सटीकता की विश्वसनीयता हैं . एक बार तकनीक मानकीकृत mistargeting की सीमा है 50 सुक्ष्ममापी या कम 1, 2 चाहिए. सेल प्रत्यारोपण भी व्यापक, 100-150 7-9 सुक्ष्ममापी, सुइयों का उपयोग करके किया जा सकता है. इसलिए कुशल सेल बहुत विशिष्ट घाव को न्यूनतम संपार्श्विक क्षति कोशिका प्रत्यारोपण से प्रेरित वितरण में जमा किया जा सकता है है. इस तकनीक में तीन महत्वपूर्ण कदम हैं:

  1. हम हमेशा एक इंसुलिन सुई के साथ ड्रिलिंग से पहले चयनित निर्देशांक लेबल धीरे खोपड़ी scratching की सिफारिश.
  2. एक त्वरित आंदोलन के साथ तेजी से मस्तिष्क की सतह घुसना कांच सुई का परिचय.
  3. एक बार इष्टतम गहराई तक पहुँच जाता है आप सुई 0.1 मिमी परिचय parenchyma मस्तिष्क में गहरी करने के लिए एक "नहर" कि दवा मस्तिष्क में स्वतंत्र रूप से फैलाना चाहिए.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

ओग पी CONACyT (सीबी-2008-+१,०१,४७६) अनुदान और FRABA (686/10) द्वारा समर्थित किया गया था. वायु - एच स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट, रॉबर्ट लकड़ी जॉनसन फाउंडेशन और मैरीलैंड स्टेम सेल फाउंडेशन द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Capillary glass tube Wiretrol I 5-000-1001
Micropipette puller Kopf Instruments Model 730
Microforge World Precision Instruments, Inc. Model 48000
Mineral oil MSDS M7700
High-vacuum grease Dow Corning 05054-AB
Anesthesia: 2.5% Avertin 2,2,2-tribrom–thanol + tert-amyl alcohol, 1:1 w/v
Heater pad Mastex Model 900
Stereotactic device Kopf Instruments Model Kopf-900
Surgical scalpel blade # 15 Medi-Cut
Micro driller Ideal Micro Drill 67-1000
Fine forceps Fine Science Tools
1-μL Micropipette Rainin
Parafilm M.
Surgical microscope Carl Zeiss, Inc. Vasiorkop with Contraves system
Microinjector Narishige International Model MO-10

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References

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तंत्रिका विज्ञान 46 अंक Microinjections दवा वितरण प्रणाली Micromanipulation Demyelination
ड्रग्स, वायरल वैक्टर, या सेल प्रत्यारोपण की डिलिवरी के लिए Microinjections के साथ डीप ब्रेन संरचनाओं के लक्ष्य निर्धारण
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Gonzalez-Perez, O.,More

Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants. J. Vis. Exp. (46), e2082, doi:10.3791/2082 (2010).

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