薬の配達のためのMicroinjections、ウイルスベクター、または細胞移植で脳深部構造のターゲティング

Summary

この記事では、50μmのルーメンでガラスキャピラリー針を作成する方法を示しています。この手法は、大幅に、脳の損傷を軽減薬の受動拡散を最小限に抑え、齧歯類の脳に正確なターゲティングが可能になります。

Abstract

脳実質へMicroinjectionsは薬物、ウイルスベクターまたは細胞移植を実現する重要な手続きです。注射針は、その軌道の間に生成される脳の病変だけでなく、脳が小さいだけでなく、時には複数の注射が必要な場合には特に、マウスの脳内の主要な関心事である。ここでは、大幅に脳の損傷を軽減し、齧歯類の脳に正確なターゲティングが可能な50μmの内腔を持つガラスキャピラリー針を製造する方法を示しています。このメソッドは、少量の配信が可能になります（20〜100 NLから）、出血のリスクを軽減し、脳実質への薬剤の受動拡散を最小限に抑えます。キャピラリーガラス管の異なるサイズを使用して、または針の内腔を変更することにより、物質や細胞のいくつかのタイプを注入することができます。ガラス毛細管とMicroinjectionsはインジェクション技術と小型げっ歯類での最小限の巻き添え被害をターゲティング脳深部に有意な改善を表しています。

Protocol

1. マウスの手術の前にガラスの針を作る：
   1. マイクロピペットプラーでキャピラリーガラス管を置く。
   2. ローカライズされた領域でガラス管を柔らかくするためにガラス管の中央を加熱する。
   3. ローカライズされた領域内のガラス管の直径の減少を引き起こすのに十分な初期の距離によってその長手軸に沿ってガラス管を引き伸ばす。
   4. それが壊れるまで、ガラス管を伸ばしてください。この方法では、2つの同一のシングルバレルの針が得られる。
2. マイクロフォージのガラス針を刺します。 30 °の角度では、ベベルの先端をするのに十分です。
3. 各針が正しい内径を持っていることを顕微​​鏡下で確認してください。親水性薬物のほとんどは30〜50μmの内径は、（図1）に最適です。
4. ガラス針の広い端から鉱物油を使用してニードルをいっぱいに。それは、キャピラリーチューブの長さの約50％に達するまで、その鉱物油（MSDS、猫。M7700）は、毛細管現象によって入るしましょう​​。針の広い端を密封するためにプランジャーの周り高真空グリースを（ダウコーニング、猫。05054 - AB）を入れます。
5. 針の広い年末までにプランジャーを挿入し、油の小滴をガラス針の先端から出て見えるまでやさしくミネラルオイルを押してください。
6. インジェクターのホルダーにガラスの針を固定します。
7. 2.5パーセントAVERTIN（2,2,2 - トリブロムエタノール+ tert -アミルアルコール、1:1 w / v）を持つマウスを麻酔。 Dosisグラム腹腔内あたり25 -30μlの。
8. 37動物の体温を保つために定位装置℃までのヒーターパッドを入れて
9. 耳のバーや歯のホルダーを使用して定位装置で、マウスの頭部を置き、固定します。
10. 二度目の70％エタノール、0.1％グルコン酸クロルヘキシジンに続く0.1％グルコン酸クロルヘキシジン溶液でマウスのヘッドのクリーニングを行ってください。
11. ランバの頭蓋骨の線にマウスの耳から外科ブレード第15位で皮膚を切開する。
12. それを乾燥し、手術野の皮膚を引き出すために綿のスワップで頭蓋骨を磨く。
13. ブレグマの縫合糸の頂点を指すようにガラス針の先端を使用してください。そこでは、インジェクター（座標"ゼロ"）の初期位置を設定する必要があります。
14. 頭蓋骨上の定位装置の"X"と"Y"軸を移動して掘削するポイントを設定します。
15. 選択した座標系で非常に慎重に穴をあけます。 Microdrillsと他の金属のツールは、以前は250滅菌処理を行った·ドライガラス玉滅菌器で60秒C（コールパーマー、カタログ番号EW - 10779〜00）。
16. 微細な鉗子で慎重に骨の最も深い層を除去し、duramatter膜を（もし漏れある脳脊髄液を参照される）ブレーク。
17. その針が開けた穴を通過できることを確認します。
18. あなたがパラフィルムの小片にそれを注入して配置する薬剤のピペット1μL。
19. 頭蓋骨の上にパラフィルムを置く。
20. もし流体がガラス針に上昇していることが顕微鏡下で確認しながら、インジェクターのホイールを回転することによって薬剤を吸い上げる。
21. パラフィルムを外し、ゼロの座標を再設定します。
22. ガラス針の先端が軽く、脳の表面に触れると、ゼロで"Z"の座標を設定するまでホルダー下に、選択された座標に針を移動します。
23. 選択された深さで脳実質内にガラスの針を導入する。
24. 〜1 NL /秒の速度で徐々に薬剤を注入する。
25. 欲望のボリュームが注入されると、2分間実質への薬物拡散をしましょう​​。その後スムーズにゆっくりと針を取り除くに進んでください。
26. 接着剤は、手術創および定位装置から動物を削除し、麻酔の回復のために清潔なベッドを含む予め温めておいたケージに動物を置く。
27. 術後鎮痛を提供するために、すべての動物は24時間5 mg / kgを皮下ケトロラクごとに12時間を受け

代表的な結果：

このプロトコルに従うとき、非常に精密な注入が得られ、非常に狭い針のトラックは、脳損傷を最小限に抑えています。この方式の代表的な結果として、我々は白質の広大1-4の脱髄を生成する脳梁にlysophosphatidylコリン（リゾレシチン）を注入した。ガラス針で生成脳損傷を最小限に抑えるために、我々は、脳梁にリゾレシチンのわずか20 NLを注入したが、同じくらい200以上のボリュームを必要に応じて、NLは、同じ方法で注入することができる。脱髄は、白質の腸管（図2）におけるミエリン塩基性蛋白質の発現の不在によって検出される。

図1。50μmの直径を有するガラス針。二つの短い目盛り間の距離規模で50μmの長さを表します。

脳梁に図2。リゾレシチン注入。脱髄は、ミエリン塩基性タンパク質の発現（点線部分）がないと表示されます。ガラスの針管（矢印）の小さなサイズに注意してください。バー= 100μmの

Discussion

方法は、脳に非常に正確な場所に薬物やウイルスベクターのほとんどを提供するために非常に便利ですこのビデオで示した。この技術の主な利点のいくつかは、ターゲットポイント、注射の正確さと脳の病変や消化管の損傷^{1、2、5、6}の小さいサイズの信頼性です。かつて技術はmistargetingの範囲が^50μm2、1以下をすべき標準化されています。細胞移植は、より広い、100から150μmの^7-9、針を使用して行うことができます。したがって、効率的な細胞送達は、細胞の移植により誘導される巻き添え被害を最小限に抑え、非常に特定の病変に堆積することができます。このテクニックの3つの重要なステップがあります：

1. 我々は常にインシュリンの針と頭蓋骨は掘削前に選択した座標にラベルを付けるためにそっと傷をお勧めします。
2. 急速に脳の表面を貫通して迅速な動きとガラス針を導入する。
3. 最適な深さに達すると、あなたは薬が自由に脳内に拡散するためにできる"運河"を作るために、脳実質に深く針0.1mmを導入すべきである。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capillary glass tube	Wiretrol I	5-000-1001
Micropipette puller	Kopf Instruments	Model 730
Microforge	World Precision Instruments, Inc.	Model 48000
Mineral oil	MSDS	M7700
High-vacuum grease	Dow Corning	05054-AB
Anesthesia: 2.5% Avertin			2,2,2-tribrom–thanol + tert-amyl alcohol, 1:1 w/v
Heater pad	Mastex	Model 900
Stereotactic device	Kopf Instruments	Model Kopf-900
Surgical scalpel blade # 15	Medi-Cut
Micro driller	Ideal Micro Drill	67-1000
Fine forceps	Fine Science Tools
1-μL Micropipette	Rainin
Parafilm M.
Surgical microscope	Carl Zeiss, Inc.	Vasiorkop with Contraves system
Microinjector	Narishige International	Model MO-10