Inriktning av Deep Brain Strukturer med Microinjections för leverans av läkemedel, virala vektorer eller Transplantation Cell

Summary

I denna artikel visar vi en metod för att göra glas kapillär nålar med ett 50-ìm lumen. Denna teknik minskar betydligt hjärnskador, minimerar passiv diffusion av droger och tillåter en exakt inriktning i gnagare hjärnan.

Abstract

Microinjections i hjärnparenkymet är viktiga rutiner för att leverera läkemedel, virala vektorer eller transplantationer cell. Hjärnan lesion som en injektion nål producerar under sin bana är ett stort problem, särskilt i musen hjärnan för inte bara hjärnan är liten, men ibland också flera injektioner behövs. Vi visar här en metod att tillverka glas kapillär nålar med en 50-ìm lumen som avsevärt minskar hjärnskador och tillåter en exakt inriktning i gnagare hjärnan. Denna metod ger en leverans av små volymer (från 20 till 100 Nl), minskar blödningar risker och minimerar passiv diffusion av narkotika till hjärnparenkymet. Genom att använda olika storlek kapillärrör glasrör eller ändra nålen lumen kan flera typer av ämnen och celler injiceras. Microinjections med ett glas kapillärrör utgör en betydande förbättring i injektionen tekniker och deep brain inriktning med minimala skador i smågnagare.

Protocol

1. Gör glas nålar innan musen kirurgi:
   1. Sätt kapillär glasrör i en mikropipett avdragare.
   2. Hetta upp mitt i glasrör för att mjuka upp glasrör i lokala området.
   3. Sträck glasröret längs dess längsgående axel med en inledande sträcka tillräcklig för att orsaka en minskning av diametern på glasröret i lokala området.
   4. Håll sträcker glasröret tills det går sönder. På detta sätt är två identiska enda fat nålar erhållits.
2. Sätt glaset nål i en microforge. En 30 ° vinkel är tillräckligt för att fasa spetsen.
3. Kontrollera i mikroskop att varje nål har rätt innerdiameter. För de flesta hydrofila läkemedel en 30-50 ìm innerdiameter är perfekt (figur 1).
4. Fyll nålen med mineralolja från den bredaste änden av glas nål. Låt det mineralolja (MSDS, kat. M7700) träder av kapillärkraften tills den når ~ 50% av längden på kapillärröret. Sätt hög vakuum fett (Dow Corning, Kat. 05.054-AB) runt kolven för att täta den bredaste änden av nålen.
5. Sätt kolven i den bredaste änden av nålen och tryck försiktigt mineralolja tills en liten droppe olja syns går i spetsen av glas nålen.
6. Fäst glaset nålen i innehavaren av microinjector.
7. Bedöva musen med 2,5% Avertin (2,2,2-tribromoethanol + tert-amylalkohol, 1:01 v / v). Dosis 25-30μL per gram intraperitoneal.
8. Sätt en värmare pad på stereotaktisk enhet att hålla djurets kroppstemperatur vid 37 ° C.
9. Placera och säkra musen huvudet i stereotaktisk enheten med örat barer och tänder hållare.
10. Rengör musen huvudet med 0,1% klorhexidinglukonat lösning, följt av 70% etanol och 0,1% klorhexidinglukonat för andra gången.
11. Incise huden med en kirurgisk kniv # 15 från mus öron till Lamba skallen linjen.
12. Polska skallen med en bomullstuss swap för att torka ut och dra huden av det kirurgiska fältet.
13. Använd spetsen på glaset nålen peka på vertex av Bregma sutur. Där har du ange utgångsläget för spridare (de samordna "noll").
14. Ställ den punkt som skall borras genom att flytta "X" och "Y" axeln på stereotaktisk enhet över skallen.
15. Borra försiktigt hål på den valda koordinaten. Microdrills och andra metallverktyg tidigare steriliseras vid 250 ° C i 60 sekunder med en torr glaspärla autoklav (Cole Palmer, Kat. Nej EW-10.779-00).
16. Med fina tång bort försiktigt det djupaste skiktet av ben och bryta duramatter membranet (du kommer se några cerebrospinalvätska läcker ut).
17. Kontrollera att nålen kan gå igenom hålen.
18. Pipettera 1 l av drogen du vill injicera och lägga den på en liten bit av parafilm.
19. Sätt parafilm på skallen.
20. Suga upp drogen genom att snurra på microinjector hjulet medan du kontrollera i mikroskop att vätskan går upp i glaset nålen.
21. Ta bort parafilm och åter ställa in noll koordinaten.
22. Flytta nålen till den valda koordinater, ner innehavaren tills spetsen av glas nål försiktigt vidröra hjärnan ytan och ställ in "Z" koordinat till noll.
23. Introducera glaset nålen i hjärnparenkymet på utvalda djup.
24. Injicerar drogen långsamt hastighet av ~ 1 NL / sek.
25. När önskan volym injiceras, låt drogen diffusa i parenkymet i 2 min. Fortsätt sedan att ta bort nålen smidigt och långsamt.
26. Limma operationssåret och ta bort djuret från stereotaktisk enheten och sätta djuret i en förvärmda bur som innehåller en ren säng för anestesi återhämtning.
27. För att ge postoperativ smärtlindring alla djur fick 5 mg / kg subkutan ketorolak varje 12-timmars i 24 h.

Representativa resultat:

Vid tillämpningen av detta protokoll, är en mycket exakt insprutning erhållits och en mycket smal nål koll minimerar hjärnskada. Som ett representativt resultat av denna metod, injiceras vi lysophosphatidyl kolin (lysolecithin) i corpus callosum som ger demyelinisering av vit substans skrifter 1-4. För att minimera hjärnskada som produceras av glas nål, sprutas vi bara 20 nl i lysolecithin i corpus callosum, men om det krävs högre volymer så mycket som 200 nl kan injiceras med samma metod. Demyelinisering detekteras av den frånvarande av myelin grundläggande protein uttryck i den vita substansen traktater (Figur 2).

Figur 1. Ett glas nål med en 50-ìm diameter. Avstånd mellan två korta fästingari skalan representerar en 50-ìm längd.

Figur 2. Lysolecithin injektion i corpus callosum. Demyelinisering visas som en något myelin grundläggande proteinuttryck (prickad yta). Notera små glas nål-tarmkanalen (pilar). Bar = 100 ìm

Discussion

Metoden visade i denna video är mycket användbar för att leverera de flesta av de läkemedel eller virala vektorer i mycket exakta platser i hjärnan. Några av de viktigaste fördelarna med denna teknik är tillförlitlighet mäter, riktigheten av injektioner och den lilla storleken på hjärnan lesion och tarmkanalen skador ^{1, 2, 5, 6.} När tekniken är standardiserad intervallet mistargeting bör 50 ìm eller mindre ^{1, 2.} Cell transplantationer kan också göras genom att använda bredare, 100-150 ìm ^7-9, nålar. Därför effektiv cell leverans kan sättas in på mycket specifika lesionen minimera skador orsakade av cell transplantation. Det finns tre viktiga steg i denna teknik:

1. Vi rekommenderar alltid att skrapa försiktigt skallen med en insulinpenna nål för att märka den valda koordinater före sådd.
2. Introducera glaset nålen med en snabb rörelse för att snabbt tränga in i hjärnan ytan.
3. När den optimala djup nås man bör införa nålen 0,1 mm djupare in i hjärnparenkymet att göra en "kanal" som låter drogen fritt diffundera in i hjärnan.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capillary glass tube	Wiretrol I	5-000-1001
Micropipette puller	Kopf Instruments	Model 730
Microforge	World Precision Instruments, Inc.	Model 48000
Mineral oil	MSDS	M7700
High-vacuum grease	Dow Corning	05054-AB
Anesthesia: 2.5% Avertin			2,2,2-tribrom–thanol + tert-amyl alcohol, 1:1 w/v
Heater pad	Mastex	Model 900
Stereotactic device	Kopf Instruments	Model Kopf-900
Surgical scalpel blade # 15	Medi-Cut
Micro driller	Ideal Micro Drill	67-1000
Fine forceps	Fine Science Tools
1-μL Micropipette	Rainin
Parafilm M.
Surgical microscope	Carl Zeiss, Inc.	Vasiorkop with Contraves system
Microinjector	Narishige International	Model MO-10