Summary
इस प्रोटोकॉल परख नीचे एक पुल का इस्तेमाल करने के लिए कोशिकाओं के भीतर सक्रिय RhoC GTPase के स्तर का निर्धारण.
Abstract
RhoC GTPase RhoA GTPase 91% अनुरूपता है. कोशिकाओं में इसकी व्यापकता के कारण, कई RhoA GTPase के लिए अभिकर्मकों और तकनीक को विकसित किया गया है. हालांकि, RhoC GTPase अपेक्षाकृत कम स्तर पर metastatic कैंसर की कोशिकाओं में व्यक्त किया है. इसलिए, कुछ RhoC विशेष अभिकर्मकों विकसित किया गया है. हम एक रो सक्रियण परख RhoC GTPase का पता लगाने के अनुकूल है. इस तकनीक को जीएसटी - रो बाध्यकारी डोमेन संलयन सक्रिय RhoC GTPase खींच प्रोटीन का इस्तेमाल करता. इसके अलावा, हम परख की शुरुआत में कुल प्रोटीन फसल के कुल का स्तर (जीटीपी और सकल घरेलू उत्पाद (जीडीपी) बाउंड) RhoC GTPase निर्धारित कर सकते हैं. यह सेल में सक्रिय बनाम कुल RhoC GTPase के निर्धारण के लिए अनुमति देता है. लेकिन इस प्रक्रिया के कई व्यावसायिक संस्करण विकसित किया गया है, वाणिज्यिक किट RhoA GTPase के लिए अनुकूलित कर रहे हैं और आमतौर पर अच्छी तरह से RhoC GTPase के लिए काम नहीं करते. परख की भाग RhoC विशिष्ट एंटीबॉडी के विकास के रूप में किया गया है के रूप में अच्छी तरह से संशोधित.
Protocol
1. तैयार करें प्रोटीन जीएसटी-संलयन
- JM109 सक्षम पहली एन टर्मिनल rhotekin रो बाध्यकारी डोमेन (आरबीडी) के 90 अमीनो एसिड BamH1/EcoR1 pGEX3x वेक्टर में subcloned वाले जीवाणुओं की ग्लिसरॉल शेयरों बना रहे हैं.
उच्च दक्षता सुनिश्चित करने के निम्न चरणों का एक प्रयोग के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए. हमारे अनुभव में, हौसले से तैयार जीएसटी आरबीडी एक मजबूत और सही GTPase सक्रियण परख करने के लिए कुंजी है. - 50 μL जोड़ें (लगभग गल, नहीं) ग्लिसरॉल शेयर के लेग amp के 50 एमएल और 37 डिग्री सेल्सियस झटकों के साथ रात में हो जाना.
- 500 एमएल लेग-amp में 1:10 पतला और एच. के लिए 1 बढ़ती
- 0.1 2 बजे के लिए IPTG मिमी के साथ जीएसटी प्रोटीन के उत्पादन को प्रेरित.
- 5000 में अपकेंद्रित्र बोतलें और अपकेंद्रित्र, Sorval GSA3 रोटर में समान रूप से वितरित RPM को 4 ° C 20 मिनट के लिए.
- अपकेंद्रित्र बोतलों में Resuspend गोली, lysis बफर के 10 एमएल *.
* बैक्टीरियल lysis बफर: 20% Sucrose, 10% ग्लिसरॉल, 50 मिमी Tris पीएच 8.0, 0.2 मिमी ना 2 2 एस 5 हे, 2 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी डीटीटी, ताजा PMSF benzamide, aprotinin और leupeptin जोड़ें. - 2-3 मिनट (इस sonicator के प्रकार पर निर्भर करता है है हम एक फिशर ध्वनि Dismembranator 500 मॉडल 6 निशान पर सेट, 50% चक्र का उपयोग करें.) Sonicate.
- अपकेंद्रित्र, SS34 Sorvall, 4 बजे 20 मिनट +१०,००० आरपीएम डिग्री सेल्सियस इस बिंदु पर एक छोटे से विभाज्य बाहर ले जाया जा सकता है और एसडीएस PAGE द्वारा चलाए. जेल coomassie सना हुआ हो और एक बैंड 46 केडीए में स्पष्ट होना चाहिए कर सकते हैं.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और 50% glutatione Sepharose 4B घोल की एक एमएल जोड़ें.
- 4 में 30 मिनट के लिए सेते ° रोटेशन के साथ सी. Lysis बफर के साथ 3 बार धोएं.
- जीएसटी - मछली बफर के साथ एक 50% घोल (लगभग 1 एमएल) GST-RBD/glutatione-Sepharose मोती Resuspend **. ** जीएसटी मछली बफर: 10% ग्लिसरॉल, 50 मिमी Tris 7.4 पीएच, 100 मिमी NaCl, 1% एनपी 4, 2 मिमी 2 MgCl, ताजा PMSF benzamide, aprotinin और leupeptin जोड़ें
2. जीएसटी-संलयन नीचे परख पुल
- 5-10 10 x 6 कोशिकाओं / परख का उपयोग करें
- कोशिकाओं को धो एक बार बर्फ का ठंडा पीबीएस में, बर्फ पर प्लेटें रखने (हम एक फ्लैट गिलास बर्फ से भरा पकवान का उपयोग करें) और 0.5 एमएल जीएसटी मछली बफर के साथ lyse.
- बर्फ पर 5 मिनट सेते हैं, फसल कोशिकाओं का उपयोग कर एक रबर पुलिसकर्मी या फ्लैट scrapper, ट्यूब microfuge और 4 पर 20,000 rpm 5 मिनट अपकेंद्रित्र हस्तांतरण डिग्री सेल्सियस
- एक ताजा microfuge ट्यूब को सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण. कुल Rho (यानी सकल घरेलू उत्पाद (जीडीपी) + GTP बाध्य) निर्धारित 50 μL लो.
- 0.5 एमएल GST-RBD/glutatione-Sepharose मोती जोड़ें और 4 बजे सेते डिग्री सेल्सियस, रोटेशन के साथ रात भर.
- जीएसटी - मछली बफर के साथ 6x धो.
- 40 μL नमूना 2x Laemelli बफर में Resuspend मोती
इस बिंदु पर कुल रो प्रोटीन 2.4 में लिया विभाज्य की एकाग्रता और निर्धारित किया जाना चाहिए 30 μg के लिए जेल पर इसी सक्रियण नमूने के साथ चलाया जा तैयार है. - उबाल लें नमूने 90 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए, संक्षिप्त अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला लोड (यानी मोतियों से बचने) लेने के लिए और एक 12 में अच्छी तरह से 4-20% ढाल जेल एसडीएस पृष्ठ पर चला.
- कोई अधिक से अधिक 150 वोल्ट पर जेल भागो, Towbin बफर और निरंतर डब्ल्यू 100 की वर्तमान का उपयोग झिल्ली के लिए स्थानांतरण
- 5% / दूध TBST समाधान और RhoC specfic एंटीबॉडी के साथ जांच के साथ झिल्ली ब्लॉक.
3. प्रतिनिधि परिणाम
अच्छे परिणाम के लगभग 22 केडीए पर एक एकल बैंड का उत्पादन करना चाहिए. बुरा परिणाम कई बैंड या उच्च पृष्ठभूमि का उत्पादन. यह प्रोटीन गिरावट, नमूनों की अधूरी धोने या पुराने जीएसटी - आरबीडी का उपयोग का संकेत है.
चित्रा 1 तीन अलग सेल लाइनों RhoC GTPase के विभिन्न स्तरों को व्यक्त करने के लिए सक्रिय और कुल RhoC, सक्रिय और कुल RhoC के उच्च स्तर या नहीं RhoC निम्न स्तर का प्रदर्शन करने के लिए दिखाए जाते हैं. दाग तो और छीन लिया घर रखने के जीन actin के लिए एक एंटीबॉडी कुल RhoC प्रोटीन के लिए एक नियंत्रण लोड हो रहा है के रूप में सेवा के साथ reprobed.
चित्रा 2 एकाधिक बैंड या प्रोटीन गिरावट, नमूनों की अधूरी धोने या पुराने जीएसटी - आरबीडी के उपयोग से उच्च पृष्ठभूमि परिणाम.
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Discussion
प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण कदम ताजा जीएसटी - आरबीडी की पीढ़ी है. इस कदम के करीब ध्यान देना करने में विफलता विफलता के लिए मुख्य कारण है. जीएसटी आरबीडी (1.2) की पीढ़ी से सेल lysate (2.5) के साथ रात भर ऊष्मायन सभी चरणों,, एक ही दिन में किया जाना चाहिए. एक और महत्वपूर्ण कदम निश्चित है कि वहाँ पर्याप्त सेल lysates का उत्पादन कोशिकाओं रहे हैं बनाना है. यह विशेष महत्व का है जब RhoC GTPase, जो कक्ष में निम्न स्तर में मौजूद हो जाता है पर देख.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
रक्षा विभाग W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 और W81XWH-08-1-0356
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gluthione-sepharose 4B beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
| Criterion 4-20% Tris-HCl gels | Bio-Rad | 345-0032 |
References
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype. Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells. Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).
- Golen, K. L. van Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor. Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).
- Golen, K. L. van Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer. Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).
- Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility. Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).
- Hall, C. L. Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase. Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).
- Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis. Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).
- van Golen, K. L. CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac. J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).
- Chatterjee, M., van Golen, K. L. Int J Cancer. , Forthcoming (2010).
- Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior. J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).
