Summary
Detta protokoll använder sig av en pull down analys för att bestämma nivåerna av aktiva RhoC GTPase i celler.
Abstract
RhoC GTPase har 91% homologi till RhoA GTPase. På grund av dess förekomst i celler, har många reagenser och tekniker för RhoA GTPase utvecklats. Det är dock RhoC GTPase uttrycks i metastaserande cancer celler på relativt låga nivåer. Därför har få RhoC-specifika reagenser utvecklats. Vi har anpassat en Rho aktivering test för att upptäcka RhoC GTPase. Denna teknik utnyttjar en GST-Rho bindande protein domän fusion att dra ut aktiva RhoC GTPase. Dessutom kan vi skörda totalprotein i början av analysen för att bestämma nivåerna av total (GTP och BNP bundna) RhoC GTPase. Detta möjliggör för bestämning av aktivt kontra totala RhoC GTPase i cellen. Flera kommersiella versioner av detta förfarande har utvecklats är dock den kommersiella kit optimerad för RhoA GTPase och normalt inte fungerar bra för RhoC GTPase. Delar av analysen har modifierats, liksom utveckling av en RhoC-specifik antikropp.
Protocol
1. Förbered GST-fusionsprotein
- Glycerol lager av JM109 behöriga bakterier som innehåller den första N-terminal 90 aminosyror med rhotekin Rho bindande domän (RBD) subcloned i BamH1/EcoR1 pGEX3x vektor görs.
Att säkerställa hög effektivitet följande steg måste genomföras för varje experiment. Vår erfarenhet är nygjord GST-RBD är nyckeln till ett robust och exakt GTPase aktivering analys. - Tillsätt 50 mikroliter (ungefärliga, inte tina) av glycerol lager till 50 ml LB amp och växa 37 ° C över natten med skakning.
- Späd 1:10 i 500 ml LB-förstärkare och växa, 1 h.
- Framkalla GST-protein produktion med 0,1 mM IPTG i 2 timmar.
- Fördela jämnt i centrifugen flaskor och centrifugera, Sorval GSA3 rotorn vid 5000 rpm 4 ° C i 20 minuter.
- Resuspendera pelleten i centrifug flaskor, 10 ml lyseringsbuffert *.
* Bakteriell lyseringsbuffert: 20% sackaros, 10% glycerol, 50 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM Na 2 S 2 O 5, 2 mm MgCl 2, 2 mm DTT, Lägg färska PMSF, benzamid, aprotinin och leupeptin. - Sonikera 2-3 min (detta beror på vilken typ av sonicator. Vi använder en Fischer Sonic Dismembranator Modell 500 inställd på märket 6, 50% cykel).
- Centrifug, Sorvall SS34, 20 min 10.000 rpm vid 4 ° C. Vid denna punkt ett litet delprov kan tas ut och drivs av SDS-PAGE. Gelen kan coomassie färgas och ett band som borde vara uppenbart vid 46 kDa.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 1 ml 50% glutatione-Sepharose 4B flytgödsel.
- Inkubera i 30 minuter vid 4 ° C med rotation. Tvätta tre gånger med lyseringsbuffert.
- Återsuspendera GST-RBD/glutatione-Sepharose pärlor till en 50% uppslamning (ca 1 ml) med GST fisk buffert **. ** GST-Fish buffert: 10% glycerol, 50 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-4, 2 mm MgCl 2, Lägg färska PMSF, benzamid, aprotinin och leupeptin
2. GST-fusion dra ner analysen
- Använd 5-10 x 10 6 celler / analys
- Tvätta cellerna en gång i iskallt PBS, hålla tallrikar på is (vi använder en platt glasskål fylld med is) och Lyse med 0,5 ml GST-fisk buffert.
- Inkubera 5 minuter på is, skörd celler med hjälp av en gummi-polis eller platt Scrapper, transfer till mikrofugrör och centrifugera 20.000 rpm 5 min vid 4 ° C.
- Överför supernatanten till ett nytt mikrofugrör. Ta 50 mikroliter för att bestämma totala Rho (dvs. BNP + GTP bundet).
- Tillsätt 0,5 pärlor ml GST-RBD/glutatione-Sepharose och inkubera vid 4 ° C, över natten med rotation.
- Tvätta 6x med GST-fisk buffert.
- Återsuspendera pärlor i 40 mikroliter 2x-Laemelli prov buffert
Vid denna punkt koncentrationen av den totala Rho proteinet alikvot som tagits i 2,4 bör bestämmas och 30 mikrogram beredd att köras på gelen med motsvarande aktivering provet. - Koka prover vid 90 ° C i 5 min, centrifug kort och ta supernatanten (dvs undvika pärlor) ladda och köra på en 12-väl 4-20% lutning SDS-PAGE gel.
- Kör gelen vid högst 150 volt, överföring till membranet med hjälp av Towbin buffert och konstant ström på 100 W.
- Blockera membran med 5% mjölk / TBST lösning och sond med RhoC-specfic antikropp.
3. Representativa resultat
Goda resultat bör leda till ett enda band på cirka 22 kDa. Dåliga resultat producera flera band eller hög bakgrund. Detta tyder på proteinnedbrytning, ofullständig tvätt av prover eller användning av gamla GST-RBD.
Figur 1. Tre separata cellinjer som uttrycker olika RhoC GTPase Här visar låga halter av aktiva och total RhoC, höga nivåer av aktiva och total RhoC eller ingen RhoC. Den blot var då stripad och reprobed med en antikropp till huset håller genen aktin att fungera som en Lastkontroll för den totala RhoC protein.
Figur 2. Flera band eller höga resultat bakgrund från proteinnedbrytning, ofullständig tvätt av prover eller användning av gamla GST-RBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiska steget i förfarandet är den generation av färska GST-RBD. Underlåtenhet att ägna stor uppmärksamhet åt detta steg är främsta orsaken till misslyckande. Alla steg, från generation av GST-RBD (1,2) till natten inkubation med cellen lysat (2,5), bör göras i en enda dag. En annan avgörande steg är att se till att det finns tillräckligt med celler att producera cellen lysates. Detta är särskilt viktigt när man tittar på RhoC GTPase, som tenderar att vara närvarande i låga halter i cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Institutionen för Defense W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 och W81XWH-08-1-0356
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gluthione-sepharose 4B beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
| Criterion 4-20% Tris-HCl gels | Bio-Rad | 345-0032 |
References
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype. Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells. Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).
- Golen, K. L. van Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor. Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).
- Golen, K. L. van Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer. Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).
- Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility. Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).
- Hall, C. L. Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase. Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).
- Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis. Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).
- van Golen, K. L. CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac. J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).
- Chatterjee, M., van Golen, K. L. Int J Cancer. , Forthcoming (2010).
- Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior. J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).
