Summary
본 연구의 목적은 동맥 벽 원래 세 계층 아키텍처를 모방하는 것이었다. 이것을 달성하기 위해, electrospinning은 3-1 (입출력) 노즐의 사용과 고용 및 polycaprolactone, 엘라스틴, 콜라겐의 결합되었다.
Abstract
기본 동맥 통해 콜라겐과 엘라스틴은 기계 백본을 제공하는 선박의 파열을 방지하고, 타악기 deformations에 따라 복구를 추진, 중요한 역할을한다. 본 연구의 목표는 엘라스틴의 추가와 45-45-10의 결합, 55-35로 콜라겐과 폴리 (caprolactone) (PCL)으로 구성된 다층 electrospun 도관을 fabricating하여 기본 동맥의 구조를 모방하는 것이었다 - 조직 재생에 도움이되는 유지하면서 10, 65-25-10는 PCL - ELAS - 콜, 기본 동맥 조직을 나타내는 기계적 성질을 설명합니다. 전체 이식 및 개별 레이어는 uniaxial 인장 시험, 동적 준수, 봉합 보존 및 버스트 강도를 사용하여 분석했다. 11.8 MPA - uniaxial 결과는 2.0의 평균 계수 범위를 시연하는 동안 2.8 % / 100 mmHg, - 준수 결과는 중간 / 중간 계층에 대한 변경 사항이 0.8에 이르기까지 전체 그래프트 준수 값 전체 그래프트 동작을 변경하는 것으로 나타났습니다. 계수 및 규정 준수 데이터를 모두 원래 동맥의 범위 내에서 값을 표시합니다. 수학 모델링은 레이어 강성의 변화는 전체 원주 벽 스트레스에 미치는 영향 및 디자인 지원은 재료의 최고의 기계적 조합을 달성할 수있을만큼 보여주 구현되었습니다. 전반적으로, 결과는 그래프트는 레이어 속성을 변경하여 트라이 - 계층 구조를 모방하기위한 수 지적했다.
Protocol
- 이전 electrospinning로 콜라겐은 육개월 소 진피에서 초산 기반의 프로세스를 사용하여 추출해야합니다. 이 추출된 콜라겐은 다음 dissolutions, precipitations 및 dialyses의 후속 시리즈를 통해 정화됩니다. 일단 콜라겐이 동결 건조된이며, electrospinning 과정을 시작할 수 있습니다.
- polycaprolactone (PCL), 엘라스틴 (ELAS) 및 콜라겐 (콜) : 세 가지 자료 massed 있습니다. 이 자료는 별도로 용해됩니다 1,1,1,3,3,3 MG / ML, 각각 100 MG / ML, 200 MG / ML, 그리고 70 농도에 hexafluoro - 2 - 프로파놀 (HFP, TCI 미국).
- 자료 98-2-0의 체적 비율에 다섯 가지의 섬광 튜브에 혼합 아르 PCL - ELAS - 콜 (intima), 45-45-10, 55-35-10 및 65-25-10 PCL - ELAS - 콜 (미디어), 그리고 70-0-30 PCL - ELAS - 콜 (adventitia).
- 버스트, 봉합 보존 및 컴플 라 이언스 테스트를 위해 다층 혈관 이식은 3-1 구성에서 electrospun 동안 uniaxial 인장 시험 및 개별 레이어 컴플 라 이언스 테스트를 위해 자료의 각 개별적으로 electrospun되었습니다. Uniaxial 인장 시험 공사장 공중 발판이 평평하고 직사각형했다 (2.5 cm x 세로 10.2 cm 두께 X 0.3 cm 길이) 개별 레이어와 다층 이식을 electrospin하는 데 사용되는 2mm 직경의 mandrels 이후 테스트 샘플을 펀칭 너무 작은되었습니다.
- 모두 개인 및 다층 electrospinning 들어, 폴리머 솔루션은 18 게이지 야기한 팁 바늘로 비닐 3 ML 백톤 디킨슨 주사기에 로드된되었고, 세트 디스 펜 서리 속도 주사기 펌프에 위치. 다층 electrospinning 속도가 전환과 계층에 따라 다양한 동안 개인 electrospinning 요금, ML / HR 4로 설정되었습니다. 흐름 속도와 볼륨과 같은되었습니다 : intima 4 ML / 시간의 속도로 electrospun했고 0.5 ML의 볼륨 2 ML / 시간 각각 0.2 ML에 대한 내막과 중간 주사기를 모두 결합 변화가옵니다. 내막 주사기는 다음 차단되었으며 중간 계층은 ML / HR 2 ML / 시간 각 고분자 용액의 0.2 ML에 대한 언론과 adventitia 사이의 전이에 의해 다음 4 0.6 ML에 대한 회전을 허용했다. 마지막으로, 미디어가 중지되었으며 adventitia 4 ML / 시간에서 0.4 ML에 대한 회전을 허용했다.
- 모든 샘플은 이전에 모든 시험 1-18시간 50 MM EDC의 상호 연결되었습니다.
- Uniaxial 인장 시험은 24 시간 동안 PBS에 수산화 한 electrospun 시트 6 샘플에서 수행되었다. "개 - 뼈"모양의 샘플 electrospun 매트에서 펀치와 100 N 부하 셀 및 10.0 mm / 분 확장 속도 MTS Bionix 200 테스트 시스템에서 테스트되었습니다. 피크 응력, 계수, 그리고 휴식의 변형은 TestWorks 버전 4를 사용하여 계산되었다.
- 봉합사 보존 시험은 37 24 시간 동안 PBS에 담가 여섯 가지 electrospun의 이식 6 2mm 내경 관형 표본, ° C, MTS Bionix 200 테스트 시스템에서 50 N로드 셀 (MTS 시스템 주식 회사)와 함께에서 수행되었습니다 미국 국립 표준 연구소 2에서 설명한 절차에 걸쳐 직선에 따라 150.0 mm / 분의 확장 속도. 5-0 상용 PDS II 보라색 monofilament의 봉합은 샘플의 끝에서 2mm를 배치하고 봉합이 이식을 통해 뽑아했다 때까지 연장되었습니다. 피크 부하는 TestWorks 버전 4를 사용하여 g - 무력에 기록되었다.
- 버스트 강도 테스트는 여섯 가지 electrospun의 이식 6 샘플에서 수행되었다. 버스트 튜브, 길이 2~3cm은 장치에 연결된, 그리고 2-0 실크 봉합사와 보안 1.5 mm 직경의 유두를 통해 장착되어, PBS에 수산화되었습니다. 공기 튜브가 2 버스트 때까지 5 mmHg / s의 속도로 압력을 증가, 시스템에 도입되었다. 결과는 튜브가 파열되는 mmHg의 압력으로보고됩니다.
- 동적 준수는 가상의 생리 조건에서 3cm의 길이에서 여섯 가지 electrospun의 이식에서 가져온 여섯 2mm 내경 관형 이식에 대한 결정했습니다. 개별 레이어와 다층 구조 관형 모두 동일한 조건에서 electrospun 및 테스트되었습니다. 표본은 37 PBS로 가득 조직 성장 기술에 의해 개발된 기계 자극 (항목) 생물 반응기 ° C. 통해 지능형 조직 공학 테스트되었습니다 생물 반응기는 50분의 90 세 가지 압력 수준 80분의 120, 그리고 110분의 150 mmHg 수축기 / diastolic가 2 조사 있던 이식의 내부에 1Hz 순환 압력 변화, 3을 제공했습니다.
대표 결과
electrospinning 프로토콜이 올바르게 수행하는 경우, 최종 제품은 부드러운 원활한 튜브 레이어 사이의 박리없이 초기 징후와 함께해야합니다. uniaxial 인장 시험, 파열 강도 시험, 봉합 보존 테스트 및 컴플 라 이언스 테스트가 수행되는 경우, 결과는 중간 계층 강성이 증가로, 엘라스틴의 감소 금액과 관련된 기계적 성질이 stiffer 튜브를 입증해야한다는 의미합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
본 연구의 가장 중요한 부분은 electrospinning 과정입니다. 3-1 입력 출력 노즐을 사용하는 경우, arching 및 충전 손실이 발생할 수 있습니다. 이 발생하면, 회전하는 폴리머와 관련된 전압 용접, "젖은"섬유가 발생하고 세 가지 레이어의 각 사이의 박리를 만들 줄어 듭니다. 따라서, 지속적인 전기 잠재력은 이상적인 다층 튜브를 얻기 위해 필수적입니다.
준수 불일치는 작은 직경 수준에서 이식편 폐색의 주요 원인 중 하나입니다. 다층 혈관 이식편을 개발하는 것은 기본 동맥의 자연 biomechanics 건축을 모방 할 것으로 맞게 이식 속성에 기능을 제공합니다. 비계가 세포 침투에 대한 적절한 기공 크기 이외에 저하를 겪습하면서 미래의 다층 혈관 그래프트 진행 상황을 처리 단계로서, 우리 연구실에는 레이어의 박리 가능한 한계를 조사합니다. 이것을 테스트하려면, 체외 저하 연구에 acellular과 휴대 모두 정적 및 동적 문화에 따라 수행됩니다. 이 테스트는 철새 공사장 공중 발판의 기능과 어떻게 효과적으로 생리적 조건 하에서 저하될 것입니다 모두를 결정합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
몇몇 저자는 미국이 논문에서 제시에 관한 기술을 출원 국제 특허를 가지고 있고,이 기술은 Organogenesis 주식 허가되었습니다
Acknowledgments
우리는 자금에 대한 미국 심장 협회 미드 - 애틀랜틱 제휴를 (0555407U, GLB) 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | ||
| Elastin | Elastin Products Company | ||
| Collagen | |||
| Acetic Acid | Fisher Scientific | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | ||
| TRIS | Fisher Scientific | ||
| 6 L Avanti J-HC Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| 1,1,1,3,3,3 hexafluoro-2-propanol | TCI America | ||
| 3 ml Becton Dickinson Syringe | |||
| CZE1000R Rack Mount Power Supply | Spellman | ||
| High-Pressure Syringe Pump | Cole-Parmer | ||
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide | Pierce, Thermo Scientific | ||
| 70 % ethanol | Sigma-Aldrich | ||
| ImageTool 3.0 software | Shareware provided by UTHSCSA | ||
| Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| MTS Bionix 200 testing system | MTS Systems Corp. | ||
| TestWorks version 4 | |||
| Intelligent Tissue Engineering via Mechanical Stimulation (ITEMS) Bioreactor | Tissue Growth Technologies |
References
- McClure, M. J., Sell, S. A., Barnes, C. P., Bowen, W. C., Bowlin, G. L. Cross-linking Electrospun Polydioxanone-Soluble Elastin Blends: Material Characterization. Journal of Engineered Fibers and Fabrics. 3, 1-10 (2008).
- Cardiovascular implants - Vascular graft protheses. VP20, AAMI Press. Bethesda, MD. (1994).
- McClure, M. J., Sell, S. A., Simpson, D. G., Walpoth, B. H., Bowlin, G. L. A three-layered electrospun matrix to mimic native arterial architecture using polycaprolactone, elastin, and collagen: A preliminary study. Acta Biomater. , (2010).
