Summary
Het doel van deze studie was om de inheemse drie gelaagde architectuur van de vaatwand na te bootsen. Om dit te bereiken, was electrospinning in dienst met het gebruik van een 3-1 (input-output) nozzle en mengsels van polycaprolacton, elastine en collageen.
Abstract
Gedurende inheemse slagader, collageen en elastine spelen een belangrijke rol, die een mechanische ruggengraat, het voorkomen van schip breuk, en het bevorderen van het herstel onder pulsatiele vervormingen. Het doel van deze studie was om de structuur van de inheemse slagader na te bootsen door het vervaardigen van een multi-layered electrospun conduit samengesteld uit poly (caprolacton) (PCL) met de toevoeging van elastine en collageen aan de mengsels van 45-45-10, 55-35 - 10 en 65-25-10 PCL-ELAS-COL de mechanische eigenschappen indicatie van de inheemse arterieel weefsel aan te tonen, terwijl de resterende bevorderlijk voor weefselregeneratie. Hele enten en individuele lagen werden geanalyseerd met behulp van eenassige trekproeven, dynamisch compliance, hechtingen retentie en barststerkte. Naleving resultaten bleek dat wijzigingen in de midden / laag mediale algemene graft gedrag met hele graft compliance waarden variërend van 0,8 veranderd - 2,8% / 100 mmHg, terwijl de uniaxiale resultaten toonden een gemiddelde modulus bereik van 2,0 tot 11,8 MPa. Zowel de modulus en de naleving van gegevens die worden weergegeven waarden binnen het bereik van inheemse slagader. Wiskundige modellering werd uitgevoerd om te laten zien hoe veranderingen in laag stijfheid van de algemene omtrekswand spanning van invloed zijn, en als een ontwerp van steun voor de beste mechanische combinatie van materialen te bereiken. Algemeen zijn de resultaten erop dat een transplantaat kan worden ontworpen om een tri-gelaagde structuur na te bootsen door het veranderen van laageigenschappen.
Protocol
- Voorafgaand aan electrospinning, collageen, vanaf 6 maanden runderen corium, moet uitgepakt worden met een azijnzuur gebaseerd proces. Dit gewonnen collageen wordt dan gezuiverd door middel van een volgende serie van ontbindingen, neerslag, en dialyses. Zodra collageen is gevriesdroogd, kan het elektrospinproces beginnen.
- Drie materialen zijn opeengehoopt: polycaprolacton (PCL), elastine (ELAS) en collageen (COL). Deze materialen worden afzonderlijk opgelost in 1,1,1,3,3,3 hexafluor-2-propanol (HFP, TCI-Amerika) in concentraties van 100 mg / ml, 200 mg / ml en 70 mg / ml, respectievelijk.
- De materialen worden gemengd in vijf verschillende scintillatieflesjes op volumetrische verhoudingen van 98-2-0 PCL-ELAS-COL (intima), 45-45-10, 55-35-10, 65-25-10 en PCL-ELAS-COL (media), en 70-0-30 PCL-ELAS-COL (adventitia).
- Voor eenassige trekproeven en individuele laag compliance testing, elk van de materialen werd individueel electrospun, terwijl de multi-layered vaattransplantaten voor barsten, hechtingen retentie en compliance testen werden electrospun van een 3 naar 1-configuratie. Eenassige trekproeven steigers waren plat en rechthoekig (2,5 cm breed x 10,2 cm lang x 0,3 cm dik), aangezien de 2 mm diameter spillen gebruikt om de afzonderlijke lagen en multi-layered transplantaat electrospin waren te klein voor pons-test monsters.
- Voor zowel de individuele en multi-layer electrospinning, werden de polymeeroplossingen geladen in een plastic 3 ml Becton Dickinson spuit met een 18 gage stompe naald-tip, en geplaatst op een injectiepomp op een vaste apotheek tarief. Individuele electrospinning tarieven werden ingesteld op 4 ml / uur, terwijl de multi-layered electrospinning cijfers waren gevarieerd afhankelijk van de overgang en laag. Debieten en volumes waren als zodanig: de intima was electrospun met een snelheid van 4 ml / uur en een volume van 0,5 ml, gevolgd door een combinatie van beide overgang intima en mediale spuiten voor 0,2 ml bij 2 ml / uur elk. De intima spuit werd vervolgens afgesloten en de mediale laag werd toegestaan om voor 0,6 ml draaien op 4 ml / uur, gevolgd door een overgang tussen de media en adventitia voor 0,2 ml van de polymeer-oplossing bij 2 ml / uur elk. Ten slotte werd de media gestopt en de adventitia mocht voor 0,4 ml draaien op 4 ml / uur.
- Alle monsters werden cross-linked in 50 mM EDC gedurende 18 uur voorafgaand aan elke test 1.
- Eenassige trekproeven werd uitgevoerd op zes monsters van de ene electrospun vel gehydrateerd in PBS gedurende 24 uur. "Dog-bone" gevormde monsters werden geponst uit electrospun matten en getest op een MTS Bionix 200 test-systeem met een 100 N load cell en een uitbreiding snelheid van 10,0 mm / min. Peak stress, modulus, en de stam bij breuk werden berekend op basis van TestWorks versie 4.
- Suture retentie tests werden uitgevoerd op zes 2 mm binnendiameter buisvormige exemplaren uit zes verschillende electrospun grafts, gedrenkt in PBS gedurende 24 uur bij 37 ° C, op een MTS Bionix 200 testsysteem met een belasting van 50 N cel (MTS Systems Corp) en een uitbreiding snelheid van 150,0 mm / min in overeenstemming met de dwars door de procedure beschreven in het American National Standards Institute 2. 5-0 commerciële PDS II violette monofilament hechtmateriaal werd geplaatst 2 mm van het uiteinde van het monster en verlengd tot de hechting had getrokken door het transplantaat. Piekbelasting werd opgenomen in gram-kracht met behulp van TestWorks versie 4.
- Barststerkte tests werden uitgevoerd op zes monsters uit zes verschillende electrospun enten. Burst buizen, 2-3 cm in lengte, werden gehydrateerd in PBS, voorzien van meer dan 1,5 mm diameter tepels bevestigd aan het apparaat en beveiligd met 2-0 zijden hechtdraad. Lucht werd geïntroduceerd in het systeem, waardoor de druk bij een snelheid van 5 mmHg / s tot de buizen barsten 2. Resultaten worden gerapporteerd als de druk in mmHg bij welke buizen gescheurd.
- Dynamische compliance werd bepaald voor zes 2 mm binnendiameter buisvormige enten uit zes verschillende electrospun ent op een lengte van 3 cm onder gesimuleerde fysiologische omstandigheden. Zowel de afzonderlijke lagen en multi-layered buisvormige constructies werden electrospun en getest onder dezelfde voorwaarden. De monsters werden getest in een intelligente Tissue Engineering via mechanische stimulatie (items) Bioreactor ontwikkeld door Weefselgroei Technologies gevuld met PBS bij 37 ° C. De bioreactor die een 1Hz cyclische drukverandering aan de binnenkant van het transplantaat, waar drie verschillende drukniveaus van 90/50, 120/80 en 150/110 mmHg systolisch / diastolische werden onderzocht 2, 3.
Representatieve resultaten
Wanneer de electrospinning protocollen correct worden uitgevoerd, moet het eindproduct worden een zachte, naadloze buis met geen eerste tekenen van delaminatie tussen de lagen. Wanneer de eenassige trekproeven, barststerkte tests, hechtdraad retentie tests, en compliance tests worden uitgevoerd, moeten de resultaten geven aan dat als de mediale laag stijfheid wordt verhoogd, met verminderde hoeveelheden van elastine, de bijbehorende mechanische eigenschappen moet een stijvere buis te tonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest kritieke deel van deze studie is het elektrospinproces. Bij gebruik van een 3-1 input-output mondstuk, gewelfde en op te laden verlies kan optreden. Als dit zich voordoet, zal de spanning in verband met het polymeer dat is spinning daling veroorzaakt gelast, "nat" vezels en het creëren van delaminatie tussen elk van de drie lagen. Daarom in overeenstemming zijn elektrische potentialen zijn essentieel voor een ideaal multi-layered buis te verkrijgen.
Naleving mismatch is een van de belangrijkste oorzaken van graft occlusie van de kleine diameter niveau. Ontwikkeling van een multi-layered vasculaire graft biedt de mogelijkheid om op maat enten eigenschappen naar iets dat zou kunnen nabootsen van de natuurlijke biomechanica en de architectuur van de inheemse slagader. Als stappen in de verwerking van een multi-layered vasculaire graft vooruitgang in de toekomst zal ons lab onderzoek instellen naar eventuele beperkingen zoals delaminatie van de lagen, terwijl het schavot ondergaat degradatie in aanvulling op een adequate poriegrootte voor cellulaire infiltratie. Om dit te testen, zal zowel de acellulaire en cellulaire in vitro degradatie onderzoek wordt uitgevoerd onder statische en dynamische cultuur. Deze testen zullen bepalen zowel de migratie mogelijkheden van de steigers en hoe ze effectief degraderen onder fysiologische omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Verschillende auteurs hebben de Verenigde Staten en internationale patenten aangevraagd met betrekking tot technologie die in dit handschrift, en deze technologie is in licentie gegeven aan organogenese, Inc
Acknowledgments
We willen graag de American Heart Association Mid-Atlantische Partner (0555407U, GLB) bedanken voor de financiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | ||
| Elastin | Elastin Products Company | ||
| Collagen | |||
| Acetic Acid | Fisher Scientific | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | ||
| TRIS | Fisher Scientific | ||
| 6 L Avanti J-HC Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| 1,1,1,3,3,3 hexafluoro-2-propanol | TCI America | ||
| 3 ml Becton Dickinson Syringe | |||
| CZE1000R Rack Mount Power Supply | Spellman | ||
| High-Pressure Syringe Pump | Cole-Parmer | ||
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide | Pierce, Thermo Scientific | ||
| 70 % ethanol | Sigma-Aldrich | ||
| ImageTool 3.0 software | Shareware provided by UTHSCSA | ||
| Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| MTS Bionix 200 testing system | MTS Systems Corp. | ||
| TestWorks version 4 | |||
| Intelligent Tissue Engineering via Mechanical Stimulation (ITEMS) Bioreactor | Tissue Growth Technologies |
References
- McClure, M. J., Sell, S. A., Barnes, C. P., Bowen, W. C., Bowlin, G. L. Cross-linking Electrospun Polydioxanone-Soluble Elastin Blends: Material Characterization. Journal of Engineered Fibers and Fabrics. 3, 1-10 (2008).
- Cardiovascular implants - Vascular graft protheses. VP20, AAMI Press. Bethesda, MD. (1994).
- McClure, M. J., Sell, S. A., Simpson, D. G., Walpoth, B. H., Bowlin, G. L. A three-layered electrospun matrix to mimic native arterial architecture using polycaprolactone, elastin, and collagen: A preliminary study. Acta Biomater. , (2010).
