Summary
3つのシングル波長短パルスレーザの組み合わせは、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（CARS）と二重共鳴CARSを（DR - CARS）を生成するために使用されます。これらの信号の差は弱いラマン散乱体のイメージングを可能にする、コヒーレントラマン信号を検出することが難しいために強化された感度を提供します。
Abstract
コヒーレントラマンイメージング技術は、起因する高分子特異性1とラベルフリー光イメージングを可能にするという約束に過去10年間の活動の劇的な増加を見てきました。これらの技術の感度は、しかし、ミリモルの分子の濃度の1,2を必要とする、蛍光より弱い数桁です。ここで、我々は、強いまたは豊富なラマン散乱から得られたものと、その信号を増幅することでラマン活性分子の弱いまたは低濃度の検出を有効にすることができます技法を説明します。生体試料中の短パルスレーザの相互作用は、サンプル約ユニークな化学物質の情報を運ぶそれぞれのコヒーレントラマン散乱信号、様々な生成。通常は、これらの信号、例えば、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（CARS）、その中から1つだけを、他は破棄されている間画像を生成するために使用されます。ただし、これらの他の信号は、を含む3色のCARSと四光波混合（FWM）は、収集され、CARS信号と比較して、情報を検出することが難しい3を抽出することができます。例えば、二重共鳴CARSは（DR - CARS）2つの共振信号4との間の建設的干渉の結果である。我々は示す方法で脂質の2845センチメートル-1 CHの伸縮振動と重水素分子（例えば重水素化糖、脂肪酸、など）の2120センチメートル-1 CD伸縮振動にDR - CARS信号を生成するために必要な3つのレーザーのチューニング同時に両方のラマン共鳴をプローブするために利用することができます。これらの条件下で、それぞれの共鳴からのCARS信号に加えて、両方のプローブを組み合わせたDR - CARS信号も生成されます。 DR - CARS信号と弱い信号に対する感度を高めるために使用できる豊富な分子の振動から増幅信号との差を検出する方法私達は示しています。我々はさらに、このアプローチはさらに溶剤の強いラマンシグナルを使用して例えば、希薄な溶質の弱いラマン信号を高めることができるように、両方の信号が別の分子から生成されるアプリケーションに拡張することを示している。
Protocol
1。 CARSとDR - CARS信号の生成
同時にCARSとDR - CARS信号を生成するためには、三波長可変と同期短パルスレーザー光源が必要です。
- three同期させたパルスを得るために、我々は、単一の10 Wレーザー（PicoTrain、HighQレーザー、（株））で始まります。このレーザーは、1064nmの波長固定、7 psの固定パルスの長さ、および76 MHzの固定反復率を持っています。
- 半波長板のシリーズを使用し、ビームスプリッタの偏光は、ビームは3つのパートに分割されるキューブ。偏光ビームスプリッタキューブを組み合わせた半波長板は、私たちはその方向を変えることなく、ビームの各コンポーネントに電力量を調整することができます。通常、2つのビームは約4.5 W、それぞれに調整、およびサードビームは、残りの1 W.が含まれている
- 2つの高電力ビームは、2つの独立した光パラメトリック発振器（OPOの、アバンテ、APE GmbHは、ベルリン、ドイツ）に向けられている。異なる波長を持つ2つのより低いエネルギーの光子に高いエネルギーの光子に変換するOPOの使用の差周波発生。この効果を達成するために使用される水晶の温度を制御することにより、結果として得られる光子の波長は、0.1nmの範囲内に制御することができます。これらの信号を周波数逓倍することにより、1064nmの固定波長のレーザは、現在、780 nmから910 nmの間のどこにでもチューニングが可能なレーザービームに変換することができます。同じ1064nmの光源を持つ2つの別々のOPOのをポンピングすることにより、我々は自動的に当社独自のポンプレーザに同期されている2つの独立した波長可変レーザ光源を得る。
- 1064nmの励起レーザから三番目（最小電力）ビームは、すべての3つのビーム（ポンプレーザーからOPOS、1から2）後で再結合できるように、ダイクロイックミラーの組み合わせにより、OPOの周りに向けられている。効率的にコヒーレントなラマン信号の光子を生成するために、組換えのパルスが時間的空間的にオーバーラップする必要があります。 OPOのは、各レーザパルスが結晶を複数回通過できるように、リングの空洞が含まれているため、ビームはOPOの旅行を介して元のポンプ光に対する相対的なかなりの遅延をもたらす余分な距離を送った。この距離は、それらがダイクロイックミラーを使用して再結合される前に、このビームは、他の二つと同じ距離を移動するために強制的に余分なミラーを導入することにより、第三線で補正する必要があります。
- 各ビームは、プリズムの反射体を使用して、調整可能な遅延段を移動する経路の長さの微調整を提供するために、各光路に導入されています。
- 半波長板と偏光ビームスプリッタキューブの別のセットは、私たちはOPOのの入力に影響を与えることなく独立して各ビームのパワーを調節できるように、各ビームに追加されます。
- ダイクロイックミラーは、最初の二つのOPOのからして、1064 nmのビームでビームを組み合わせるために使用されます。ケアは、ビームが正確に（それらが一直線上にある、すなわち、同様の発散を持って）オーバーラップするように注意する必要があります。これは、（〜1 m）のダイクロイックミラーから近いビームのオーバーラップ（数センチ以内）と遠くを比較することによって確認することができます。
- パルスレーザを使用する利点はまだ低い平均強度を維持しながら、コヒーレントラマン信号を効率的に生成を可能にする、各パルスがサンプルに大きなピークエネルギーを持つことができるということです。高い平均強度は、サンプルを損傷する可能性があります。さらにピークエネルギーを損なうことなく平均強度を制御するために、したがって、3つの結合されたビームは、私たちは、パルスの反復率をことを調整するためのパルスピッカーとして、電気光学変調器（ポッケルスのセル、ConOptics）機能を介して送信されます我々のサンプルに到着し、そのため平均強度。
- 複合レーザービームは、高NAの対物と倒立顕微鏡に連結されている。目的は、通常、私たちのOPOのと1064 nmのビームのチューナビリティの範囲で色収差を補正している1.2の開口数（NA）60 Xの水の対物レンズです。高NAの対物レンズによって生成された焦点タイトは、ミクロンスケールのコヒーレントラマン信号の最も効率的に生成することができます。
- 複合ビームは、顕微鏡対物レンズのバックポートを詰め込み過ぎないようにするために展開されます。顕微鏡対物の背面があふれてしまうことによって我々は最高の焦点条件で、我々の顕微鏡システムで最高の空間分解能を達成することができます。
- 私たちの顕微鏡の対物レンズは、私たちは商業ビーム走査型共焦点顕微鏡と同様のサンプル間のビームを、ラスターは、スキャンして画像を取得できるようにXYZピエゾステージに取り付けられている。
2。 3つの短いパルスレーザーの使用
様々なCからいくつかのCARS信号の生産の3つのショートパルスレーザを使用した結果、二つのレーザーだけでなく、すべての3つのレーザーの組み合わせから3色のCARSとDR - FWM信号のombinations。
- 信号の波長が互いに近いスペクトルに置くことができます。信号が互いに近接しているときには、固定波長のバンドパスフィルタやダイクロイックミラーを用いて分析のためにそれらを分離することが困難な場合があります。このような理由から私たちの信号はまた、空間的に異なる波長の信号を分離する効率的なモノクロメータとして機能イメージング分光計（SpectraPro 2300i、アクトンリサーチ）に渡されます。
- 下降位置での分光器内で電子的に作動フリップミラーは、全信号範囲での分光情報を提供し、私たちはさまざまな一貫性を識別し、最適化を可能にする裏面照射型の深い空乏電荷結合素子（CCD）カメラに信号を送信しますラマン信号。
- 我々は単純にCCDカメラを中心に、ベンダ提供の制御およびデータ収集ソフトウェア（WinSpec、プリンストンインスツルメンツ）を使用して、分光器内の関心のピークを回折格子を回転してから、変更のイメージにしたいとの信号を選択するには単一光子計数のアバランシェフォトダイオード（APD）が添付されている2番目の出口ポートにこの信号をリダイレクトするためにフリップミラーの位置。
- 対物レンズは、ラスタスキャンであり、APDに記録された信号は、データ収集ソフトウェア（SymPhoTime、Picoquant GmbHは、ベルリン、ドイツ）を経由して各ピクセルのカウントレート光子を表示することによって画像を生成するために使用されます。
- 私たちは、私たちは後処理中に信号を比較することができる各目的のコヒーレントラマン信号のためのこのイメージの作成処理を繰り返します。
3。サンプル準備
明確な、再現可能な画像を得るためにいくつかの注意は、サンプルを調製するのに注意する必要があります。
- サンプルは通常、〜150ミクロンの厚さのガラス製カバースリップ上に用意されています。これらのカバースリップは、一般的に使用されている1.2 NA対物レンズと高分解能のイメージングを可能にするために十分に薄いです。
- レーザー光は、小さな透明のオブジェクトを介して回折のときの誘電体オブジェクトの光トラッピングが発生する可能性があります。しっかりと焦点、高ピークパワー、短パルスレーザービームを使用すると、その後ぼやけたりスミア画像になって、一緒に小さな細胞や細菌をドラッグすることができます。これを回避するためには、まずスピンコーティングによってポリ- L -リジンの薄層を適用することにより、ガラスのカバースリップの表面に試料を固定する必要があるかもしれません。
- 文化のガラス底の培養皿中の細胞のためにそれらの細胞培養の成長の皿から細胞を剥離することなくイメージングを可能にすることに利用することができる。
- この貢献のデモでは、まずホルムアルデヒド固定Cを預けるガラス製カバースリップ上でelegansの線虫。
- その後、ワームに5 M重水素化グルコース溶液20μL滴を追加します。重水素化グルコース溶液は、ユニークで強力なラマン背景のシグネチャを提供します。
4。サンプル分析
適切に二重共鳴増強効果を活用するために、両方のラマン共鳴物質のラマンスペクトルがわかっている必要があります。
- サンプルはカバースリップ上に用意されるとそれは関連する自発ラマンスペクトルを取得し、適切なピークを識別するために、共焦点ラマン顕微鏡を用いて分析される。
- DR - CARSを実行するために我々は-1をそれぞれ2845センチメートル-1と2121センチメートルように、重水素化グルコースに関連付けられている一般的に脂質に関連付けられているCHの伸縮モードと、CDのストレッチモードのスペクトル位置を、識別する。
- 二つのレーザーの周波数差が分子振動の周波数と一致する場合にコヒーレントラマン散乱が達成されます。 1064nmのレーザービームと組み合わせると817 nmのチューニングone OPOによってそれが2845センチメートル-1 CHモードをプローブし、1064nmの光と組み合わせると868 nmの他のOPOをチューニングすることで、それは2121センチメートルを-1にピークを検出します。
- によるラスタスキャン我々が今関心の三コヒーレントラマン信号を観察できるCARS顕微鏡でサンプルを。 CARSは、伸縮振動CHをプロービング信号、CARSは、CDのストレッチモード、および両方をプロービングDR - CARS信号をプロービング信号。
- 我々は2.3節で説明したように各ピークを選択し、上記のような画像を取る。
5。画像処理
これらの3つの画像に基づいて抽出する追加情報は、現在いくつかの非常に単純な画像処理を必要とします。
- 最初の画像を正規化する必要があります。理論の正規化では、各信号の生成プロセスに関係する各レーザーの強度のために会計することによって達成することができます。しかし実際には、これは常に不均一なスペクトル応答のために主に、動作しませんダイクロイックミラー、検出器、及び回折格子の。
- 正規化のための実用的な方法は、純粋な脂質が信号を支配地域では、CDの共鳴は、信号のいずれにも貢献ではないという事実に依存しています。同様に、純粋なグルコース溶液の地域でCHの共鳴は、信号のいずれかに貢献しないでください。これを念頭に、我々はC.外側のウェル領域に重水素化グルコース溶液のCDの共鳴を得DR - CARSイメージとCARSの画像を正規化はCHの共振を示さないはずelegansのワーム 。
- その後、我々は脂質に富んでいるCH -共鳴CARSイメージでワーム内の領域を識別し、正規化されたDR - CARSイメージ内の対応する領域にそれを正規化する。この方法を正しく動作させるために我々は深く、この領域内では重水素化グルコースが存在しないことを前提としています。脂質は疎水性であり、溶液と混合しないので、これは安全な仮定である。
- 今、正規化されたDR - CARS画像から正規化されたCH -共鳴CARSイメージを差し引くことによって我々は、単に増幅したCD -共鳴信号が残されています。
- 同様に正規化されたDR - FWM画像から正規化されたCD -共鳴CARSイメージを差し引くことによって我々は、単に増幅CH -共鳴信号が残されています。
6。代表的な結果
図1：前述のようにDR - CARS顕微鏡システムの図。
図2：Cの白色光のイメージ重水素化グルコース溶液中の虫のワームは、ガラスのカバースリップ上に調製し、イメージングのための準備。
図3：。アルキンの変更を（炭素三重結合炭素のグループ）が含まれて修正されたオレイン酸（不飽和脂肪酸）のラマンスペクトルは、2845センチメートル-1と2100 cmのアルキン共振に強いCH共鳴は-1両方ですそれらもコヒーレントラマンイメージングのための理想的なマーカーを作り、指紋領域（高密度に充填されたピークの領域）から単離された。
図4：3つ短パルスレーザが試料内で重なっているときに生成されるコヒーレントなラマン信号の典型的なスペクトルは、矢印はエネルギーダイアグラムで表されるように各信号の責任プロセス（ES）を指している。ここに示した図では点線の矢印は、結果として得られる信号を示すレーザーとOPOのと実線の矢印から光子を示している。実線の水平線は、ラマン振動のエネルギーを示すと同時に、同じ3つの入力光子プローブつの異なるラマン振動を混合、DR - CARSで、視覚的な表現を与える。
図5：画像Cからの典型的な結果DR - CARSとCARSを用いた線虫ワームは。一番上の行は、重水素化グルコースの溶液中でのイメージワームをするために図4に示された3つの信号を使用する。 2行目に画像が適切に正規化され、3行目の差分画像は、DR - CARSイメージからCARSイメージをそれぞれ減算することにより製造された。
Discussion
ラマン分光法とラマンベースのイメージングは、バイオサイエンスの強力な新しいツールです。現在のところ、これはin vivo及び脂質の処理と保管の細胞の代謝と代謝性疾患のin vitro試験のために特に当てはまります。ほとんどの生体高分子は、細胞および生物から得られたラマンスペクトルは、通常、脂質、タンパク質、核酸、糖からの貢献の畳み込みになるように、同じような、ほとんどが炭素ベースの分子結合の多数を含んでいる、など脂質が比較的容易であるために密集した小滴または二重層を形成する傾向があるから、彼らは脂肪族CH結合の数が多いと拡張されたチェーンが含まれているため、これらの複雑なスペクトルから隔離する。複雑な細胞環境内で特定のタンパク質、アミノ酸、RNA、またはDNAを単離する当社の能力は、しかしながら、非常に限られている。興味のこれらの分子は以下のみμM濃度で存在している場合は特にそうです。ここで、私たちの新しく導入されたDR - CARS差イメージング技術を利用した弱いラマン共鳴を調べる機能は、それらの化学的微量分析やイメージングのための潜在的に強力なアプローチを提供します。確かに、このプロトコルの最も複雑な部分は、レーザーシステムのアライメントおよび同期です。ゼロから始めるときは、パルスの同期は、すなわちパルスを彼らが取る別のパスにもかかわらず、時間に重なっていることを保証することはパルスの自己相関を使用することによって促進することができます。一度空間的および時間的重なりが達成され、CARSとDR - CARS信号は、容易に検出可能なはずです。ただし、最初のアラインメントが弱い信号で、その結果、多くの場合、原油です。このシステムを揃えるためのベストプラクティスは、よく最初に微弱な信号を生成し、その後穏やかに微調整することにより、各パスに沿ってミラーと遅延段を使用して時間的重複を調整して信号強度を改善することです。部屋のライトのための非常に効率的なバッフルのような分光器/分光器の行為は、もののきれいな結果が他の様々な光源（例えば、コンピュータのモニタ、によって導入された背景を最小限に抑えるためにオフに部屋の照明を使用してシステムを操作することにより、カーテンやレンズチューブを達成することができますインジケータライト、LEDを、等）。
私たちの特定の設定は、シングルフォトンカウンティングのアバランシェフォトダイオード（APD）検出器と検出5時間相関単一光子計数（TCSPC）ハードウェアを利用しています。これは、私たちは比較的低いノイズが多くのグループが同様の測定を行う有利な可変利得を持つ光電子増倍管（PMTの）を発見したとの非常に弱い信号を検出することができます。 PMTのの利点は、可変ゲインを提供し、検出器の配置を簡素化することができるより大きな検出面積を持っていることです。さらに、我々のセットアップは、ビーム走査を実現するために、客観的に変換するピエゾステージを利用しています。これの利点は、我々は高い精度で以前にスキャンした画像内の任意の場所に戻って、自発ラマンスペクトルを含む追加の測定を行う能力を持っているということです。他のグループは、走査ミラーアセンブリ、またはそのようなはるかに高速イメージングを提供していますが、正確に画像内の任意の位置に戻るには、その能力に制限されているオリンパスFluoViewシステム、などであっても全体の走査型共焦点ユニットを利用して成功している。
ラマン共鳴に一致するようにレーザーのチューニングにもいくつかの最適化を必要とするかもしれない重要なステップです。ラマンピークが知られていることがありますが、DR - CARSとCARSから得られる最大のスペクトルのピーク強度が必ずしも自発ラマンピークの最大値に対応していません。これは、自発ラマンスペクトルの相対CARSスペクトルを歪める非共鳴バックグラウンド信号とCARS、につながる四波混合によって生成される信号の本質的な干渉によるものです。 CARS信号のピークのスペクトル位置は計算が、より実用的なアプローチは、ラマン共鳴の予想される場所で、いくつかの、小さなスペクトルのステップでOPOSを調整することですすることができます。このプロセスは、明確な最大値をもたらす必要があります。実際には、DR - FWMから最高感度のために両方の共鳴は、この最大値に調整する必要があります。
DR - CARSのアプローチの1つの最後の潜在的な問題も議論しなければならない、すなわちDR - CARS信号がラマン活性増幅分子の均一な分布に依存します。ほとんどの生物学的なオブジェクトの場合、これはよく豊富で、ほぼどこにでもある水から幅広いOHの共鳴、可能性があります。水は、しかし、脂質のモードを増幅するために水の共鳴を利用したときに得られる信号の歪みをリードするような脂肪滴として細胞、、との疎水性領域から除外されます。この例では、我々の生体試料のための容易に検出可能と豊富な信号を生成するために重水素化グルコースのソリューションを使用している。同様に、水を重水素化や生物学的buffe重水素化このようなD - HEPESなどのRSは、使用することができる。 C.内この例では、脂肪滴elegansのワームは 、常に我々のシステムの集束レーザスポット内に、重水素化グルコース溶液と脂質の両方を含むのに十分小さかった。これは、しかし、一般的には真ではありません。特定の例では、それらの細胞質内ではなく、大きな脂肪滴を生成する脂肪細胞、であろう。この手段は、DR - CARS法で実施したどんな実験では、結果を検証するために慎重な準備と対照実験が必要です。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、DR - CARS法の開発に貢献してイワンSchieとセバスチャンWachsmann - Hogiuに感謝したいと思います。タイラーの週はローレンスリバモア国立研究所からのローレンスScholarのプログラムによるサポートを認めている。トーマスHuserは、補助金プログラムを通じて米国心臓協会からの支援に感謝しています。この作品は、全米科学財団からの資金によって部分的にサポートされていました。バイオフォトニクス、NSF科学技術センター、研究センターが協力協定第PHY 0120999の下、デイビス、カリフォルニア大学によって管理されます。サポートはまた、研究資源（NCRR）のためのナショナルセンターからの助成金番号UL1 RR024146下UCD臨床トランスレーショナル科学センターから認められています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60X water immersion objective | Olympus Corporation | UPLSAPO 60XW | |
| Inverted Microscope | Olympus Corporation | IX-71SIF-3 | |
| Pockels Cell | ConOptics | 350-160 | |
| Picotrain pump Laser | HighQ | IC-1064-10000 | |
| Optical Parametric Oscillator | APE | Levante IR | |
| 1.5 Glass cover slips | Fisher Scientific | 12-545-102 25cm-1 | |
| Half-wave plates | Thorlabs Inc. | AHWP05M-980 | |
| Polarizing Beam Splitter Cubes | Thorlabs Inc. | PBS052 or PBS053 | |
| Spectrometer/Monochromator | Princeton Instruments/Acton | Spectra Pro 2300i | |
| CCD Camera | Princeton Instruments/Acton | PIXIS: 100B | |
| Avalanche Photo Diode | PerkinElmer, Inc. | SPCM-AGR-14-12691 | |
| XYZ Piezo Stage | Physik Instruments | P 733-2CL P 721.CDQ | This is a combination of an XY stage and a Z objective holder |
| Dichroic Mirrors | Semrock | Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25 | These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient. |
| Dichroic Mirror | Chroma Technology Corp. | Z830rdc | To combine the different near-infrared laser beams |
| TCSPC board | PicoQuant | Timeharp 200 | |
| Symphotime Imaging Software | PicoQuant | ||
| Matlab | Mathworks |
References
- Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. J Opt Soc Am B. 19 (9), (2002).
- Tolles, W. M., Nibler, J. W., McDonald, J. R., Harvey, A. B. A Review of the Theory and Application of Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS). Appl Spectrosc. , (1977).
- Weeks, T., Schie, I. W., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. Signal generation and Raman-resonant imaging by non-degenerate four-wave mixing under tight focusing conditions. J Biophoton. 3 (3), 169-175 (2010).
- Weeks, T., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. Raman Microscopy based on Doubly-Resonant Four-Wave Mixing (DR-FWM). Opt Express. 17 (19), 17044-17051 (2009).
- Schie, I. W., Weeks, T., McNerney, G. P., Fore, S., Sampson, J. K., Wachsmann-Hogiu, S., Rutledge, J. C., Huser, T. Simultaneous forward and epi-CARS microscopy with a single detector by time-correlated single photon counting. Optics Express. 16 (3), 2168-2175 (2008).
