Differentiële beeldvorming van biologische structuren met dubbel-resonante Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS)

Summary

Een combinatie van drie enkele golflengte korte gepulste lasers wordt gebruikt om coherent anti-Stokes Raman scattering (auto's) en dubbel-resonante CARS (DR-CARS) te genereren. Het verschil tussen deze signalen zorgt voor een verbeterde gevoeligheid voor anders moeilijk te coherent Raman signalen te detecteren, waardoor beeldvorming van zwakke Raman scatterers.

Abstract

Coherente Raman beeldvormende technieken hebben gezien een dramatische toename van de activiteit de afgelopen tien jaar als gevolg van hun belofte om label-free optische beeldvorming mogelijk is met een hoog moleculair specificiteit ^1. De gevoeligheid van deze technieken is echter vele ordes van grootte zwakker dan fluorescentie, die milli-molaire moleculaire concentraties ^1,2. Hier beschrijven we een techniek die de detectie van zwakke of lage concentraties van de Raman-actieve moleculen kunnen inschakelen door hun signaal versterken met die verkregen uit sterk of overvloedige Raman scatterers. De interactie van korte gepulste lasers in een biologisch monster genereert een scala aan samenhangende Raman scattering signalen, elk van die zich bezighouden met unieke chemische informatie over het monster. Typisch, is slechts een van deze signalen, bijv. Coherent Anti-Stokes Raman scattering (CARS), gebruikt om een ​​beeld te genereren, terwijl de anderen worden verwijderd. Echter, wanneer deze andere signalen, waaronder drie-kleuren CARS en vier-wave mixing (FWM), worden verzameld en vergeleken met de CARS-signaal, kan anders moeilijk om informatie te sporen worden geëxtraheerd ^3. Bijvoorbeeld, dubbel-resonante CARS (DR-CARS) is het resultaat van de constructieve interferentie tussen twee resonantie signalen ^4. We zien hoe afstemming van de drie lasers nodig zijn om DR-CARS-signalen te produceren om de 2845 cm ^-1 CH strekvibratie in lipiden en de 2120 cm ^-1 CD rekken trilling van een gedeutereerde molecuul (bijvoorbeeld gedeutereerde suikers, vetzuren, enz.) kan worden gebruikt om tegelijkertijd probe beide Raman resonanties. Onder deze omstandigheden, in aanvulling op CARS signalen van iedere resonantie, een gecombineerde DR-CARS signaal probing beiden is ook gegenereerd. We zien hoe het detecteren van het verschil tussen de DR-CARS-signaal en het versterken van het signaal van trillingen een overvloedige molecuul kan worden gebruikt om de gevoeligheid voor de zwakkere signaal te verbeteren. We verder laten zien dat deze aanpak ook geldt voor toepassingen waar de beide signalen worden gegenereerd uit verschillende moleculen, zoals dat bijvoorbeeld het gebruik van de sterke Raman signaal van een oplosmiddel kan de zwakke Raman-signaal van een verdunde opgeloste stof te verbeteren.

Protocol

1. Generatie van auto's en DR-CARS Signalen

Met het oog op CARS genereren en DR-CARS-signalen tegelijk, drie afstembare en gesynchroniseerd korte gepulste laser bronnen nodig zijn.

1. Voor het verkrijgen van drie gesynchroniseerde pulsen we beginnen met een 10 W laser (PicoTrain, HighQ laser, Inc.) Deze laser heeft een vaste golflengte van 1064 nm, een vaste puls lengte van 7 ps, en een vaste herhalingsfrequentie van 76 MHz.
2. Met behulp van een reeks van half-wave platen en polariserende bundelsplitser kubussen de bundel is opgedeeld in drie delen. Een half-wave plaat in combinatie met een polariserende beam splitter kubus laat ons toe om de hoeveelheid stroom te passen in elk onderdeel van de bundel, zonder het veranderen van de richting. Meestal worden twee balken aangepast aan ~ 4,5 W per stuk, en de derde bundel bevat de overige 1 W.
3. De twee hoge vermogen bundels worden vervolgens in twee onafhankelijke optische parametrische oscillator (OPO's, Avante, APE GmbH, Berlijn, Duitsland). OPO's gebruik verschil frequentie van generatie op een hogere energie-foton om te zetten in twee lagere energie fotonen met verschillende golflengtes. Door het regelen van de temperatuur van het kristal gebruikt om dit effect te bereiken, kan de golflengten van de resulterende fotonen worden gecontroleerd om binnen 0,1 nm. Door de frequentie-verdubbeling van deze signalen, een laser met een vaste golflengte van 1064 nm kan nu omgezet in een laserstraal die overal kan worden afgestemd tussen 780 nm tot 910 nm. Door het pompen twee aparte OPO's met dezelfde 1064 nm bron, krijgen we twee onafhankelijk van elkaar afstembare laser bronnen die automatisch worden gesynchroniseerd met onze oorspronkelijke pomp laser.
4. De derde (laagste vermogen) straal van de 1064 nm pomp laser is gericht rond de OPO's door een combinatie van dichroïsche spiegels, zodat alle drie bundels (2 van de OPO, een van de pomp laser) kan later worden gerecombineerd. Om efficiënt coherent Raman-signaal fotonen produceren de gerecombineerde pulsen moeten zowel tijdelijk en ruimtelijk worden overlapt. Omdat de OPO's ring holtes bevatten, zodat iedere laserpuls om door het kristal meerdere keren, de balken gestuurd door te reizen van de OPO's een extra afstand resulteert in een aanzienlijke vertraging ten opzichte van de originele pomp balk. Deze afstand moet worden gecompenseerd met de derde bundel door de invoering van extra spiegels die kracht deze balk om dezelfde afstand als de andere twee reizen voordat ze worden opnieuw gecombineerd met dichroïsche spiegels.
5. Om de fijnafstelling van de lengte van het pad elke balk reist instelbare vertraging stadia, met behulp van prisma RETROFLECTOREN, worden ingevoerd in elke bundel pad op te geven.
6. Een andere reeks half-wave platen en polariserende bundelsplitser blokjes worden toegevoegd aan elke balk om ons in staat om de kracht van elke balk aan te passen zonder dat onafhankelijk van de input van de OPO's.
7. Dichroïsche spiegels worden gebruikt om eerst de balken combineren van de twee OPO's en dan met de 1064 nm balk. Zorg moeten worden genomen om ervoor te zorgen dat de balken precies overlappen elkaar (dat wil zeggen ze zijn collineair en hebben vergelijkbare divergentie). Dit kan worden gecontroleerd door het vergelijken van de overlapping van de balken dicht bij de (binnen een paar centimeter) en ver van de (~ 1 m) de dichroïsche spiegel.
8. Het voordeel van het gebruik van gepulste lasers is dat elke puls kan een hoge piek energie hebben op het monster, waardoor een efficiënte genereren van coherente Raman signalen, met behoud van een lage gemiddelde intensiteit. Een hoge gemiddelde intensiteit kan schade aan de steekproef. Dus om verder de gemiddelde intensiteit van controle zonder in te boeten piek energie, zijn de drie gecombineerde balken verstuurd via een elektro-optische modulator (Pockel de cel, ConOptics) functioneren als een puls picker, die ons in staat te stellen de herhalingsfrequentie van de pulsen die komen op onze steekproef en dus de gemiddelde intensiteit.
9. De gecombineerde laserstralen worden vervolgens gekoppeld in een omgekeerde microscoop met een hoge NA doelstelling. Het doel is typisch een 60 X water objectief met een numerieke apertuur (NA) van 1,2 dat is voor chromatische aberratie gecorrigeerd in het bereik van tunability van onze OPO's en de 1064 nm balk. Het strakke focus gegenereerd door de hoge NA objectief zorgt voor de meest efficiënte generatie van coherente Raman signalen op de micron schaal.
10. De gecombineerde bundels worden uitgebreid om de back-poort van de microscoop objectief overvulling. Door overvulling de achterkant van de microscoop doelstelling die we kunnen bereiken de beste omstandigheden voor het scherpstellen en daarom de beste ruimtelijke resolutie in onze microscoop systeem.
11. Het objectief in onze microscoop is gemonteerd op een XYZ piezo fase die ons in staat stelt om beelden te verkrijgen door raster-het scannen van de balken over het monster, vergelijkbaar met commerciële beam-scanning confocale microscopen.

2. Het gebruik van drie korte gepulste lasers

Het gebruik van drie korte gepulste lasers resulteert in de productie van verschillende CARS signalen, uit de verschillende combinations van twee lasers, evenals drie-kleuren CARS-en DR-FWM signalen uit de combinatie van alle drie lasers.

1. De golflengte van de signalen kan spectraal liggen dicht bij elkaar. Als de signalen worden dicht bij elkaar kan het moeilijk zijn om ze te scheiden voor analyse met behulp van vaste golflengte bandpass filters en dichroïde spiegels. Om deze reden onze signalen worden doorgegeven aan een imaging spectrometer (SpectraPro 2300i, Acton Research), dat tevens dienst doet als een efficiënte monochromator om ruimtelijk afzonderlijke signalen bij verschillende golflengten.
2. Een elektronisch bediende flip spiegel in de spectrometer in de laagste positie stuurt het signaal naar een back-verlichte deep-uitputting charge-coupled device (CCD) camera die spectroscopische informatie geeft over het gehele bereik en signaal stelt ons in staat te identificeren en optimaliseren van de verschillende samenhangende Raman signalen.
3. Het selecteren van de signaal waarmee we willen beeld dat wij gewoon draaien het rooster in de spectrometer, met behulp van de leverancier geleverde en data-acquisitie software (WinSpec, Princeton Instruments), naar het centrum van de piek van de rente op de CCD-camera en wijzig de positie van de flip spiegel om dit signaal te leiden naar een tweede uitgang poort waarop een single-photon tellen lawine foto-diode (APD) is bijgevoegd.
4. Het objectief is dan raster-gescand en de signalen die op de APD worden gebruikt om een ​​beeld te genereren door het weergeven van de foton count-tarief voor elke pixel via data-acquisitie software (SymPhoTime, Picoquant GmbH, Berlijn, Duitsland).
5. We herhalen deze beeldvorming procedure voor elke gewenste samenhangende Raman signaal dat ons in staat stelt om de signalen te vergelijken tijdens post-processing.

3. Monstervoorbereiding

Met het oog op heldere, reproduceerbare beelden te verkrijgen enige voorzichtigheid moeten worden genomen bij de voorbereiding van het monster.

1. Monsters zijn meestal opgesteld op ~ 150 micron dik glas dekglaasjes. Deze coverslips zijn dun genoeg om voor hoge resolutie imaging met de 1.2 NA doelstellingen die doorgaans worden gebruikt.
2. Optische vangen van diëlektrische objecten kan optreden wanneer de laser licht wordt afgebogen door kleine transparante objecten. Het gebruik van strak gericht, hoog piekvermogen, kan korte gepulste laserstralen sleep kleine cellen of bacteriën mee, wat resulteert in onscherpe of uitgesmeerd beelden. Om dit te voorkomen kan het noodzakelijk zijn om het monster immobiliseren op het oppervlak van het glas dekglaasje door eerst het aanbrengen van een dunne laag van poly-L-lysine door spin-coating.
3. Voor de cellen in de cultuur met glazen bodem cultuur gerechten kunnen worden gebruikt die het mogelijk maken voor de beeldvorming zonder de noodzaak om de cellen uit hun celcultuur groei gerechten los te maken.
4. Voor de demonstratie in deze bijdrage hebben we de eerste storting een formaldehyde-vaste C. elegans nematode worm op een glazen deksel slip.
5. Voeg vervolgens een 20 pi druppel van 5 M gedeutereerde glucose-oplossing voor de worm. De gedeutereerde glucose-oplossing biedt een unieke en sterke Raman achtergrond handtekening.

4. Voorbeeld Analyse

Om goed te profiteren van de dubbel-resonante enhancement effect van de Raman-spectra van zowel Raman-resonante stoffen moeten bekend zijn.

1. Nadat het monster is voorbereid op het dekglaasje wordt geanalyseerd met behulp van een confocale Raman microscoop naar de relevante spontane Raman-spectrum te verkrijgen en geschikt zijn pieken te identificeren.
2. Voor het uitvoeren van DR-CARS identificeren we de spectrale locaties van de CH stretch mode, meestal geassocieerd met lipiden, en de cd-stretch mode, in verband met de gedeutereerd glucose, te 2845 cm ^-1 en 2121 cm ^-1 respectievelijk.
3. Coherente Raman scattering wordt bereikt wanneer de frequentie verschil tussen twee lasers overeenkomt met de frequentie van een moleculaire vibratie. Door het afstemmen van een OPO tot 817 nm zal sonde de 2845 cm ^-1 CH-modus in combinatie met de 1064 nm laserstraal en door het afstemmen van de andere OPO tot 868 nm zal het de 2121 cm ^-1 piek sonde in combinatie met de 1064 nm straal .
4. Door raster-scanning van het monster op de auto's microscoop kunnen we nu waarnemen drie samenhangende Raman signalen van belang. Een CARS signaal sonderen van de CH rek vibratie, een CARS signaal sonderen van de cd-stretch mode en een DR-CARS signaal indringende beide.
5. Wij selecteren elke piek zoals beschreven in paragraaf 2.3 en maak een opname zoals hierboven beschreven.

5. Image Processing

Extraheren van aanvullende informatie op basis van deze drie beelden nu vereist enige redelijk eenvoudig beeldverwerking.

1. Eerst de beelden moeten worden genormaliseerd. In theorie normalisatie kan worden bereikt door goed voor de intensiteit van elke laser die betrokken zijn bij elk signaal generatie proces. In de praktijk blijkt dit niet altijd werken voornamelijk als gevolg van de niet-uniforme spectrale responsvan dichroïtische spiegels, detectoren, en roosters.
2. Een praktische methode voor normalisatie berust op het feit dat in regio's waar pure lipiden domineren het signaal, de cd-resonantie niet zou moeten bijdragen tot een van het signaal. Ook in gebieden van pure glucose-oplossing van de CH resonantie mag niet bij een van het signaal. Met dit in gedachten, hebben we normaliseren van de DR-CARS beeld en de CARS beeld verkregen op de cd resonantie van de gedeutereerde glucose-oplossing om een gebied ver buiten de C. elegans worm dat er geen CH resonantie te vertonen.
3. Vervolgens identificeren we een gebied binnen de worm in de CH-resonante CARS beeld dat rijk is aan lipiden en normaliseren aan de desbetreffende regio binnen de genormaliseerde DR-CARS beeld. Voor deze methode goed te laten werken we ervan uit dat diep van binnen dit gebied geen gedeutereerde glucose aanwezig is. Dit is een veilige aanname, omdat de lipiden zijn hydrofoob en zal niet mengen met de oplossing.
4. Nu, door het aftrekken van de genormaliseerde CH-resonante CARS afbeelding van de genormaliseerde DR-CARS beeld dat we blijven zitten met alleen de versterkte CD-resonantie-signaal.
5. Zo ook door het aftrekken van de genormaliseerde CD-resonante CARS afbeelding van de genormaliseerde DR-FWM beeld dat we blijven zitten met alleen de versterkte CH-resonantie signaal.

6. Representatieve resultaten

Figuur 1: Diagram van de DR-CARS microscopie systeem zoals hierboven beschreven.

Figuur 2: Wit licht beeld van een C. elegans worm in gedeutereerd glucose-oplossing voorbereid op een glazen dekglaasje en klaar voor imaging.

Figuur 3:. Raman spectrum van gemodificeerde oliezuur (een onverzadigd vetzuur) dat een alkyn modificatie (een koolstof-koolstof binding triple-groep) bestaat uit de sterke CH resonanties bij 2845 cm ^-1 en de alkyn resonantie bij 2100 cm ^-1 zijn beide goed geïsoleerd van de vingerafdruk regio (de regio van dicht op elkaar gepakte pieken), waardoor ze ideaal zijn markers voor een coherente Raman beeldvorming.

Figuur 4:. Typische spectrum van samenhangende Raman signalen gegenereerd als drie korte-gepulste lasers met elkaar worden gecombineerd binnen de steekproef De pijlen wijzen naar de proces (sen) die verantwoordelijk is voor elk signaal zoals vertegenwoordigd door de energie-diagrammen. In de schema's hier getoonde gestippelde pijlen geven fotonen van de laser en de OPO's en solide pijlen geven de resulterende signaal. De solide horizontale lijnen geven de energie van de Raman trillingen en geven een visuele voorstelling dat in DR-CARS, het mengen van de drie dezelfde ingang fotonen tegelijk twee verschillende sondes Raman trillingen.

Figuur 5: Typische gevolgen van beeldvorming C. elegans wormen met behulp van de DR-auto's en auto. De bovenste rij gebruikte de drie signalen aangegeven in figuur 4 het imago van een worm in een oplossing van gedeutereerde glucose. In de tweede rij van de beelden waren voldoende genormaliseerd en in de derde rij het verschil beelden werden gemaakt door het aftrekken van elk van de CARS beelden uit de DR-CARS beeld.

Discussion

Raman spectroscopie en Raman-based imaging zijn krachtige nieuwe tools in de bio-wetenschappen. Op dit moment, dit geldt met name voor de in vivo en in vitro onderzoek van cellulaire metabolisme en metabole stoornissen in de verwerking en opslag van lipiden. De meeste bio-macromoleculen bevatten een groot aantal vergelijkbare, meestal op koolstof gebaseerde moleculaire bindingen, zodat de Raman-spectra verkregen uit cellen en organismen meestal een convolutie van de bijdragen van lipiden, eiwitten, nucleïnezuren, suikers, etc. Lipiden zijn relatief eenvoudig te isoleren van deze complexe spectra, vanwege hun neiging om dichte druppels of dubbellagen vorm en omdat ze bevatten uitgebreid ketens met een groot aantal alifatische CH bindingen. Ons vermogen om specifieke eiwitten, aminozuren, RNA of DNA te isoleren binnen de complexe cellulaire omgeving is echter zeer beperkt. Dit geldt met name als deze moleculen van belang zijn alleen aanwezig in uM concentraties en hieronder. Hier is de mogelijkheid om zwakke Raman resonanties gebruik te maken van onze nieuw geïntroduceerde DR-CARS verschil beeldvormende techniek sonde biedt een potentieel krachtige aanpak voor hun chemische microanalyse en beeldvorming. Toegegeven, de meest ingewikkelde deel van dit protocol is de afstemming en synchronisatie van het lasersysteem. Bij het starten vanaf nul, de synchronisatie van de pulsen, dat wil zeggen ervoor te zorgen dat de pulsen overlappen in de tijd, ondanks de verschillende wegen die zij nemen kan worden vergemakkelijkt door het gebruik van een puls autocorrelator. Zodra ruimtelijke en temporele overlap wordt bereikt, auto's en DR-CARS-signalen moet gemakkelijk detecteerbaar. Echter, de eerste uitlijning is vaak ruw, wat resulteert in zwakke signalen. De best practice voor het uitlijnen van dit systeem goed is om in eerste instantie het genereren van zwakke signalen en vervolgens aan de signaalsterkte te verbeteren door voorzichtig tweaken de spiegels langs elke weg en het aanpassen van de temporele overlap met behulp van de vertraging fasen. Hoewel de spectrometer / monochromator fungeert als een zeer efficiënte klankbord voor de kamer het licht van de schoonste resultaten kunnen worden bereikt door gebruik van het systeem met verlichting in de kamer uitgeschakeld en gordijnen of lens buis op de achtergrond die door de verschillende andere lichtbronnen (bijv. computer beeldschermen te minimaliseren, indicator licht, LED's, etc.).

Onze specifieke setup maakt gebruik van single-photon tellen lawine foto-diode (APD) detectoren en time-gecorreleerd single photon tellen (TCSPC) hardware voor detectie ^5. Dit stelt ons in staat om uiterst zwakke signalen te detecteren met een relatief laag geluidsniveau, maar veel groepen hebben gevonden photo-multiplier buizen (PMT's) met een variabele gain voordeel bij het maken van vergelijkbare metingen. Het voordeel van de PMT's is dat ze een variabele gain bieden en hebben een veel groter detectiebereik die uitlijning van de detector kan vereenvoudigen. Bovendien, onze setup maakt gebruik van piëzo-etappes aan de doelstelling te vertalen om scanning te bereiken. Het voordeel hiervan is dat we de mogelijkheid om op een plek terug te keren binnen de eerder gescande beeld met een hoge graad van nauwkeurigheid en aanvullende metingen met inbegrip van spontane Raman-spectra hebben. Andere groepen waren succesvol gebruik te maken van scanning spiegel vergaderingen, of zelfs hele confocale scanning-eenheden zoals de Olympus FluoView systeem, dat veel sneller beeldvorming biedt, maar is beperkt in zijn vermogen om nauwkeurig naar willekeurige locaties terug te keren binnen een afbeelding.

Afstemmen van de lasers overeenkomen met de resonantie Raman is ook een kritische stap die sommige optimalisatie nodig heeft. Hoewel de Raman pieken kunnen worden gekend de maximale spectrale piek intensiteit verkregen van DR-auto's en auto niet noodzakelijk overeen met het maximum van de spontane Raman piek. Dit is te wijten aan de intrinsieke interferentie van signalen gegenereerd door vier-wave mixing leidt tot een niet-resonante achtergrond signaal en auto's, welke auto's spectra ten opzichte van spontane Raman-spectra vervormt. De spectrale plaats van de piek van de CARS-signaal kan worden berekend, maar een meer praktische aanpak is om het OPO af te stemmen op verschillende, kleine spectrale stappen over de verwachte locatie van de Raman resonantie. Dit proces moet opleveren een duidelijk maximum. In feite, voor de grootste gevoeligheid van de DR-FWM beide resonanties moet worden afgestemd op dit maximum.

Een laatste potentieel probleem van de DR-CARS aanpak moet ook worden besproken, dat wil zeggen de DR-CARS-signaal is afhankelijk van een homogene verdeling van de Raman-actieve versterken molecuul. Voor de meeste biologische objecten, zou dit wel eens de brede OH resonantie van water, dat is overvloedig en bijna alomtegenwoordig. Water is echter uitgesloten van hydrofobe regio's met een cel, zoals lipide druppels, waardoor een verstoring van de signalen verkregen wanneer gebruik te maken van het water resonantie aan lipide modi versterken. In ons voorbeeld hebben we gebruik gemaakt van een oplossing van gedeutereerde glucose naar een gemakkelijk te detecteren en overvloedige signaal voor onze biologisch monster te genereren. Ook gedeutereerde water of gedeutereerde biologische Buffers, zoals d-HEPES kunnen worden gebruikt. In ons voorbeeld, de lipide druppels in de C. elegans worm waren klein genoeg om zowel de gedeutereerde glucose-oplossing en lipiden bevatten altijd binnen de laser-plek van ons systeem. Dit is echter niet altijd waar. Een bijzonder voorbeeld hiervan is adipocyten, wat vrij groot lipide druppels te genereren in hun cytoplasma. Dit betekent een experiment uitgevoerd met de DR-CARS-techniek vereist een zorgvuldige voorbereiding en controle-experimenten om de resultaten te verifiëren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60X water immersion objective	Olympus Corporation	UPLSAPO 60XW
Inverted Microscope	Olympus Corporation	IX-71SIF-3
Pockels Cell	ConOptics	350-160
Picotrain pump Laser	HighQ	IC-1064-10000
Optical Parametric Oscillator	APE	Levante IR
1.5 Glass cover slips	Fisher Scientific	12-545-102 25cm-1
Half-wave plates	Thorlabs Inc.	AHWP05M-980
Polarizing Beam Splitter Cubes	Thorlabs Inc.	PBS052 or PBS053
Spectrometer/Monochromator	Princeton Instruments/Acton	Spectra Pro 2300i
CCD Camera	Princeton Instruments/Acton	PIXIS: 100B
Avalanche Photo Diode	PerkinElmer, Inc.	SPCM-AGR-14-12691
XYZ Piezo Stage	Physik Instruments	P 733-2CL P 721.CDQ	This is a combination of an XY stage and a Z objective holder
Dichroic Mirrors	Semrock	Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25	These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient.
Dichroic Mirror	Chroma Technology Corp.	Z830rdc	To combine the different near-infrared laser beams
TCSPC board	PicoQuant	Timeharp 200
Symphotime Imaging Software	PicoQuant
Matlab	Mathworks