Summary
Комбинация из трех одной длины волны короткие импульсные лазеры используется для генерации когерентного антистоксова рассеяния света (КАРС) и дважды резонансных CARS (DR-КАРС). Разница между этими сигналами обеспечивает повышенную чувствительность в противном случае трудно обнаружить когерентного комбинационного сигналы, что позволяет визуализации слабых комбинационного рассеивателями.
Abstract
Когерентного комбинационного методов визуализации наблюдается резкое повышение активности за последнее десятилетие из-за их обещание включить без наклеек оптических изображений с высокой молекулярной специфичности 1. Чувствительность этих методов, однако, на много порядков слабее, чем флуоресценция, требующих милли-молярных молекулярной 1,2 концентрациях. Здесь мы описываем технику, которая может включить обнаружение слабых или низких концентрациях комбинационно-активных молекул путем усиления их сигнал с полученным от сильных или обильным комбинационного рассеивателями. Взаимодействия коротких импульсных лазеров в биологических пример приводит к возникновению различных когерентного комбинационного рассеяния сигналов, каждый из которых выполнять уникальную информацию о химических образца. Как правило, только один из этих сигналов, например когерентного антистоксова рассеяния света (КАРС), используется для создания изображения, а остальные отбрасываются. Однако, когда эти другие сигналы, в том числе 3-цветный АВТОМОБИЛИ и четыре смешения (ЧВС), собираются и по сравнению с КАРС-сигнала, в противном случае трудно обнаружить информацию можно извлечь 3. Например, дважды резонансных CARS (DR-КАРС) является результатом конструктивной интерференции между двумя резонансными сигналами 4. Мы показываем, как настройка трех лазеров, необходимых для производства DR-АВТОМОБИЛИ сигналов на 2845 см -1 CH растянуть вибрации в липиды и 2120 см -1 CD валентного колебания дейтерированных молекулы (например дейтерированных сахара, жирные кислоты и др.) могут быть использованы для исследования и комбинационного резонансов одновременно. В этих условиях, в дополнение к АВТОМОБИЛИ сигналы от каждого резонанса, комбинированные DR-КАРС-сигнала зондирования и также генерируется. Мы показываем, как обнаружить различия между DR-КАРС-сигнала и усиливает сигнал от вибрации обильные молекулы могут быть использованы для повышения чувствительности для слабого сигнала. Кроме того, мы показали, что этот подход распространяется даже для приложений, где оба сигнала создаются из различных молекул, таких, что например, с помощью сильного комбинационного сигнала растворителя может усилить слабый сигнал комбинационного разбавленный раствор.
Protocol
1. Поколение автомобилей и DR-АВТОМОБИЛИ Сигналы
Для того, чтобы генерировать АВТОМОБИЛИ и DR-АВТОМОБИЛИ сигналов одновременно, три перестраиваемых и синхронизированы коротких импульсных лазерных источников не требуется.
- Для получения трех синхронизированных импульсов мы начинаем с одной 10 Вт лазер (PicoTrain, HighQ лазер, Inc.) Этот лазер имеет фиксированную длину волны 1064 нм, фиксированной длительности импульса от 7 пс, а фиксированная частота повторения 76 МГц.
- Использование серии полуволновой пластины и поляризационный светоделитель кубов луч делится на три части. Полуволновой пластинки в сочетании с поляризационными куб светоделитель позволяет регулировать количество энергии в каждом компоненте пучка без изменения его направления. Как правило, два луча приспособлены к ~ 4,5 Вт каждый, а третий луч содержит оставшиеся 1 Вт
- Две высокие пучки мощностью затем направляются на два независимых оптических параметрических генераторов (ОПГ, в Avante, APE GmbH, Берлин, Германия). Использование ПГС в разностной частоты поколения для преобразования высокой энергии фотона в двух нижних фотонов энергии с различными длинами волн. Контролируя температуру кристалла используется для достижения этого эффекта, длины волн фотонов в результате может контролироваться с точностью до 0,1 нм. По удвоения частоты этих сигналов лазера с фиксированной длиной волны 1064 нм, теперь может быть преобразована в лазерный луч, который может быть настроен в диапазоне от 780 нм до 910 нм. По насосных два отдельных ОПГ с той же длине волны 1064 нм источника, мы получаем два независимо настраиваемых лазерных источников, которые автоматически синхронизируются с нашей первоначальной накачки лазера.
- Третья (самая низкая мощность) пучка от лазера накачки 1064 нм направлено около OPO путем сочетания дихроичных зеркал так, чтобы все три луча (2 из ОПГ, один из лазера накачки) может быть рекомбинированное позже. Для того, чтобы эффективно производить когерентного комбинационного фотонов сигнала рекомбинированное импульсы должны быть перекрыты и во времени и пространстве. Потому что OPO содержат кольцевых резонаторов, что позволяет каждому лазерного импульса, чтобы пройти через кристалл несколько раз, пучки направлены через туристические OPO в дополнительное расстояние в результате значительной задержкой относительно исходного пучка накачки. Это расстояние должно быть компенсировано с третьего луча, вводя дополнительные зеркала, что сила этого луча, чтобы пройти то же расстояние, как и другие два, прежде чем они рекомбинированное использованием дихроичных зеркал.
- Для обеспечения точной регулировки длины пути каждого луча путешествует регулируемые этапы задержки, используя призму retroreflectors, вводятся в каждом луча.
- Другой набор полуволновой пластины и поляризационный светоделитель кубов добавляют в каждом пучке, чтобы мы могли регулировать мощность каждого пучка независимо друг от друга, не влияя на входе ПГС в.
- Дихроичных зеркал используются для первого объединить лучей от двух ОПГ, а затем с 1064 нм луча. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы лучи точно перекрываются (то есть они лежат на одной прямой и имеют аналогичные расхождения). Это может быть проверено путем сравнения перекрытия лучей вблизи (в пределах нескольких сантиметров) и вдали от (~ 1 м) дихроичных зеркал.
- Преимущество использования импульсных лазеров является то, что каждый импульс может иметь высокую энергию пика образца, что позволяет для эффективной генерации когерентного комбинационного сигналов, сохраняя при этом низкую интенсивность средняя. Высокой интенсивности может привести к повреждению среднего образца. Поэтому в целях дальнейшего контроля средней интенсивности, не жертвуя пик энергии, три комбинированных пучках посылаются через электрооптический модулятор (ячейка Pockel, в ConOptics) функционирование в качестве выбора импульса, который позволяет регулировать частоты повторения импульсов, придем нашей выборке и, следовательно, средней интенсивности.
- Комбинированные лазерные лучи затем связаны в инвертированный микроскоп с высоким цель NA. Цель, как правило, 60 X воды объектива с числовой апертурой (NA) в 1,2, который был с устраненной хроматической аберрации по всему спектру управляемость нашей ОПГ и 1064 нм луча. Жесткой фокусировки порожденные высокими объектив NA позволяет наиболее эффективной генерации когерентного комбинационного сигналов на микронных масштабах.
- Комбинированные пучки расширена с целью переполнения обратно-порт объектива микроскопа. По переполнения задней части объектива микроскопа мы можем достичь лучших условий фокусировки и, следовательно, лучшее пространственное разрешение микроскопа в нашей системе.
- Объектива в нашем микроскоп устанавливается на стадии XYZ пьезо которая позволяет получать изображения, растр сканирования пучка через образец, похожий на коммерческой пучка сканирующей конфокальной микроскопии.
2. Использование трех коротких Импульсные лазеры
Использование трех коротких импульсных лазеров результатов в производстве несколько сигналов автомобилей, из различных сombinations двух лазеров, а также 3-Цвет АВТОМОБИЛИ и DR-ЧВВ сигналов от комбинации всех трех лазеров.
- Длины волн сигналов может лежать спектрально близких друг к другу. Когда сигналы близко друг к другу, может быть трудно отделить их для анализа с использованием фиксированных длин волн полосовых фильтров и дихроичных зеркал. По этой причине наши сигналы передаются в визуализации спектрометра (SpectraPro 2300i, Эктон исследований), который также служит в качестве эффективного монохроматора к пространственно разделенных сигналов на разных длинах волн.
- Электронным приводом перевернуть зеркало внутри спектрометра в опущенном положении посылает сигнал на задней подсветкой глубокого истощения прибор с зарядовой связью (ПЗС) камеры, которая обеспечивает спектроскопической информации по всему спектру сигнала и позволяет идентифицировать и оптимизировать различные когерентные комбинационного сигналов.
- Для выбора сигнала, с которым мы хотим изображение, которое мы просто повернуть решетку в спектрометр, используя поставляемые производителями контроля и сбора данных программного обеспечения (WinSpec, Princeton Instruments), в центре пик интереса ПЗС-камеры, а затем изменить Положение перевернуть зеркало, чтобы перенаправить этот сигнал для второго порта с выходом на котором одним счета фотонов лавина фотодиод (APD) было подключено.
- Объектива является то растровых отсканированы и сигналов, записанных на APD используются для создания изображений, отображая фотона скорость счета для каждого пикселя с помощью сбора данных программного обеспечения (SymPhoTime, Picoquant GmbH, Берлин, Германия).
- Мы повторяем эту процедуру визуализации для каждого желаемого когерентного комбинационного сигнал, который позволяет сравнивать сигналы во время пост-обработки.
3. Подготовка образцов
Для того чтобы получить ясный, воспроизводимых изображений некоторых необходимо соблюдать осторожность при подготовке образца.
- Образцы, как правило, подготовлены на ~ 150 микрон покровные стекла. Эти покровные достаточно тонкие, чтобы учесть высоким разрешением с 1,2 целей Н.А., которые обычно используются.
- Оптический захват диэлектрических объектов может происходить, когда лазерный свет дифрагирует через небольшие прозрачные объекты. Использование четко сфокусированные, высокая пиковая мощность, короткое импульсных лазерных лучей можно перетащить мелкие клетки или бактерии вместе, в результате чего размыты или смазанный изображений. Для того чтобы избежать этого может оказаться необходимым для иммобилизации образца на поверхности стекла покровного первым применением тонкий слой поли-L-лизин спин-покрытие.
- Для клеток в культуре стеклянная посуда нижней культуры могут быть использованы, которые позволяют для работы с изображениями без необходимости отделить клетки от своего сотового блюда роста культуры.
- Для демонстрации в этом вклад, который мы первый депозит формальдегида фиксированной C. Элеганс нематоды червя на скольжение покровного стекла.
- Затем добавить 20 мкл капли 5 М дейтерированных раствора глюкозы с червем. Дейтерированных раствора глюкозы обеспечивает уникальный и сильный комбинационного подпись фоне.
4. Пример анализа
Для того чтобы правильно воспользоваться дважды резонансного усиления эффекта комбинационного спектры обоих комбинационно-резонансной веществ должны быть известны.
- Как только образец подготовлен на покровное оно анализируется с помощью конфокальной микроскопии комбинационного для получения соответствующих СКР спектра и определения соответствующих пиков.
- Для выполнения DR-АВТОМОБИЛИ мы отождествляем спектральных места режиме CH натяжкой, обычно связанных с липидами, и режим CD стрейч, связанные с дейтерированных глюкозы, чтобы быть 2845 см -1 и 2121 см -1 соответственно.
- Когерентного комбинационного рассеяния достигается тогда, когда разность частот двух лазеров матчей частоты молекулярных вибраций. Настраивая один OPO до 817 нм, оно будет пытаться 2845 см -1 CH режим в сочетании с лазерным лучом 1064 нм и настройка других OPO до 868 нм, оно будет пытаться 2121 см -1 пика, когда в сочетании с 1064 нм луч .
- По растровой сканирования образца на АВТОМОБИЛИ микроскопом мы можем теперь наблюдать три когерентного комбинационного сигналы интересов. АВТОМОБИЛИ сигнала зондирования CH валентных колебаний, АВТОМОБИЛИ сигнала зондирования режиме CD растягивать и DR-КАРС-сигнала зондирования и другое.
- Мы выбираем каждый пик, как описано в разделе 2.3 и принимать изображение как описано выше.
5. Обработка изображений
Извлечение дополнительной информации на основе этих трех изображений теперь требует довольно простой обработки изображений.
- Первые изображения должны быть нормализованы. В теории нормализации может быть достигнуто путем учета интенсивности каждого лазера вовлечены в каждый процесс генерации сигнала. Однако на практике это не всегда работает, в основном за счет неоднородного спектральная чувствительностьдихроичных зеркал, датчики, и решетки.
- Практический метод для нормализации основана на том, что в регионах, где преобладают чистые липиды сигнал, CD резонанс не должны содействовать осуществлению любого из сигнала. Кроме того, в регионах чистого раствора глюкозы резонанс СН не должны содействовать осуществлению любого из сигнала. Имея это в виду, мы нормализуем DR-АВТОМОБИЛИ изображения и АВТОМОБИЛИ изображение, полученное на компакт-диске резонанс дейтерированных раствора глюкозы в регионе и за пределами С. Элеганс червь, который должен обладать не CH резонанс.
- Затем мы отождествляем региона в рамках червя в CH-резонансной АВТОМОБИЛИ изображения, богатой липидами и нормализуют его в соответствующей области в течение нормированного DR-АВТОМОБИЛИ изображения. Чтобы этот метод работает должным образом, мы предполагаем, что глубоко внутри этого региона не дейтерированного глюкозы присутствует. Это безопасное предположение, поскольку липиды являются гидрофобными и не будут смешиваться с раствором.
- Теперь, вычитая нормированного CH-резонансной АВТОМОБИЛИ изображение из нормированного DR-АВТОМОБИЛИ изображения у нас остается только усиливается CD-резонансный сигнал.
- Аналогичным путем вычитания нормированного CD-резонансной АВТОМОБИЛИ изображение из нормированного DR-ЧВВ изображения у нас остается только усиливается CH-резонансный сигнал.
6. Представитель Результаты
Рисунок 1: Схема DR-АВТОМОБИЛИ микроскопии систему, как описано выше.
Рисунок 2: Белое изображение светом C. Элеганс червя в дейтерированных раствора глюкозы подготовлен на покровное стекло и готов для работы с изображениями.
Рисунок 3:. Спектре КРС изменение олеиновой кислоты (ненасыщенные жирные кислоты), который включает в себя модификации алкин (углеродных тройных связей углерод группы) сильные резонансы СН на 2845 см -1 и алкин резонанс при 2100 см -1 и хорошо изолирована от отпечатков пальцев области (региона плотно упакованных пиков), что делает их идеальными маркерами для когерентного комбинационного изображений.
Рисунок 4:. Типичный спектр когерентного комбинационного сигналы, генерируемые, когда три коротких импульсных лазеров накладываются друг на друга в пределах выборки стрелки указывают на процесс (ы), ответственный за каждый сигнал в лице энергетических диаграмм. На диаграммах показано здесь пунктирными стрелками указывают фотонов от лазера и ПГС и сплошными стрелками указывают результирующего сигнала. Твердой горизонтальной линии показывают энергии комбинационного вибрации и дают наглядное представление, что в DR-CARS, смешивая же 3 фотонов вход одновременно двух различных зондов комбинационного вибрации.
Рисунок 5: Типичные результаты визуализации C. Элеганс червей использующих DR-автомобили и автомобили. верхнем ряду использованы три сигнала показано на рисунке 4, чтобы образ червя в растворе дейтерированного глюкозы. Во втором ряду изображения были надлежащим образом нормализована и в третьем ряду разница изображения были получены путем вычитания каждого из АВТОМОБИЛИ изображений DR-АВТОМОБИЛИ изображения.
Discussion
Спектроскопии комбинационного рассеяния и комбинационного основе изображений являются мощными инструментами в новых био наук. В настоящее время это особенно верно для в естественных условиях и в пробирке изучение клеточного метаболизма и нарушения обмена веществ по переработке и хранению липидов. Большинство биологических макромолекул содержат большое количество подобных, в основном на основе углерода молекулярных связей, так что спектры комбинационного рассеяния получены из клеток и организмов, как правило, свертки взносов из липидов, белков, нуклеиновых кислот, сахара, липиды и т.д. могут быть сравнительно легко изолировать от этих сложных спектров, из-за их склонности к образованию плотных капель или бислоев и потому, что они содержат расширенные цепей с большим количеством облигаций алифатических СН. Наша способность изолировать специфические белки, аминокислоты, РНК или ДНК в комплексе клеточного окружения, однако, весьма ограничены. Это особенно верно, если эти молекулы представляют интерес только присутствовать на мкМ концентрации и ниже. Здесь, возможность проверки слабые комбинационного резонансов используя наши вновь вводимых DR-АВТОМОБИЛИ разница изображения техники обеспечивает потенциально мощный подход к их микроанализа химического и обработки изображений. По общему признанию, самым сложным часть этого протокола является выравнивание и синхронизацию лазерной системы. Начиная с нуля, синхронизации импульсов, то есть обеспечение того, чтобы импульсы накладываются друг на друга во времени, несмотря на разные пути они берут может быть облегчен за счет использования импульса автокоррелятора. Как только пространственные и временные перекрытия достигается, автомобили и DR-АВТОМОБИЛИ сигналы должны быть легко обнаружены. Тем не менее, первое выравнивание часто сырой, в результате слабых сигналов. Рекомендуется для выравнивания этой системы также является изначально генерировать слабые сигналы, а затем для улучшения сигнала, осторожно настройки зеркала вдоль каждого пути и корректировки временных перекрытия использованием задержки этапов. Хотя спектрометр / монохроматора действует как очень эффективный перегородка для комнаты светом чистым результатов можно добиться от операционной системы с комнате свет выключен и занавески или объектив трубы, чтобы минимизировать фон введены различные другие источники света (мониторы например, компьютер, индикаторы, светодиоды и др.).
Наша особая установка использует одного счета фотонов лавина фотодиод (APD) детекторов и с корреляцией по времени одного счета фотонов (TCSPC) аппаратные средства для обнаружения 5. Это позволяет обнаруживать чрезвычайно слабые сигналы с относительно низким уровнем шума, но многие группы нашли фото-умножители (ФЭУ в) с переменной получить выгодный при принятии подобных измерений. Преимущество PMT является то, что они предлагают переменную прибыль и имеют гораздо больший зоны обнаружения, которые могут упростить выравнивание детектора. Кроме того, в нашей установке используется пьезо этапах переводить цели для достижения луч сканирования. Преимуществом этого является то, что у нас есть возможность вернуться в любое место в пределах ранее отсканированное изображение с высокой степенью точности и принять дополнительные измерения, включая спектры СКР. Другие группы добились успеха использованием сканирующего зеркала собраний, или даже целые конфокальной единиц, таких как сканирование системы Olympus FluoView, который предлагает гораздо быстрее визуализация, но ограничен в своих возможностях, чтобы точно вернуться в произвольных местах в пределах изображения.
Настройка лазеров в соответствии с комбинационным резонансом также является важным шагом, который может потребовать некоторой оптимизации. Хотя комбинационного пики могут быть известны максимальной спектральной интенсивности пик, полученный от DR-автомобили и автомобили не обязательно соответствует максимуму СКР пика. Это связано с внутренним вмешательством сигналы, генерируемые четьрехволновые, ведущих к нерезонансный фоновый сигнал и легковых автомобилей, что искажает АВТОМОБИЛИ спектрах относительно спектров СКР. Спектральных расположение пика сигнала КАРС можно рассчитать, но более практичным подходом является мелодия ОПГ в нескольких, небольшие спектральные шаги по ожидаемом месте комбинационного резонанса. Этот процесс должен дать четкий максимум. В самом деле, для наибольшей чувствительностью от DR-ЧВС как резонансы должны быть настроены на этот максимум.
Последний потенциальные проблемы DR-АВТОМОБИЛИ подход должен также обсудить, т.е. DR-КАРС-сигнала будет зависеть от однородного распределения комбинационно-активной усиливающей молекулы. Для большинства биологических объектов, это может быть широкий резонанс ОН из воды, которая есть в изобилии и почти вездесущим. Вода, однако, исключены из гидрофобных регионов с клеток, например, липидные капли, что привело искажения сигналов, полученных при использовании воды для усиления резонанса липидного режимах. В нашем примере мы использовали решение дейтерированных глюкозы для получения легко обнаружить и обильные сигнал для нашего биологического образца. Кроме того, дейтерированных воды или дейтерированных биологических buffeRS, такие, как г-HEPES могут быть использованы. В нашем примере, липидные капли в C. Элеганс червя были достаточно малы, чтобы всегда содержать как, дейтерированных раствора глюкозы и липидов в сфокусированного лазерного пятна нашей системе. Это, однако, вообще говоря, неверно. Конкретный пример будет адипоцитов, которые генерируют достаточно большие капли липидного в их цитоплазме. Это означает, что любой эксперимент, проведенный с DR-АВТО техника требует тщательной подготовки и контрольные эксперименты для проверки результатов.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Ивана Schie и Себастьян Wachsmann-Hogiu за их вклад в развитие DR-АВТОМОБИЛИ техники. Тайлер недели признает поддержке Программы Лоуренс ученый из Ливерморской национальной лаборатории. Томас Huser выражает благодарность за поддержку со стороны Американской ассоциации сердца через Грант-в-помощь программы. Эта работа также была частично поддержана финансирование от Национального научного фонда. Центр биофотоники, NSF научно-технический центр, находится в ведении Университета Калифорнии в Дэвисе, под соглашением о сотрудничестве номер 0120999 PHY. Поддержка также признал от UCD Клинические Поступательное Научного центра по гранту Число UL1 RR024146 из Национального центра по ресурсам исследований (NCRR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60X water immersion objective | Olympus Corporation | UPLSAPO 60XW | |
| Inverted Microscope | Olympus Corporation | IX-71SIF-3 | |
| Pockels Cell | ConOptics | 350-160 | |
| Picotrain pump Laser | HighQ | IC-1064-10000 | |
| Optical Parametric Oscillator | APE | Levante IR | |
| 1.5 Glass cover slips | Fisher Scientific | 12-545-102 25cm-1 | |
| Half-wave plates | Thorlabs Inc. | AHWP05M-980 | |
| Polarizing Beam Splitter Cubes | Thorlabs Inc. | PBS052 or PBS053 | |
| Spectrometer/Monochromator | Princeton Instruments/Acton | Spectra Pro 2300i | |
| CCD Camera | Princeton Instruments/Acton | PIXIS: 100B | |
| Avalanche Photo Diode | PerkinElmer, Inc. | SPCM-AGR-14-12691 | |
| XYZ Piezo Stage | Physik Instruments | P 733-2CL P 721.CDQ | This is a combination of an XY stage and a Z objective holder |
| Dichroic Mirrors | Semrock | Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25 | These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient. |
| Dichroic Mirror | Chroma Technology Corp. | Z830rdc | To combine the different near-infrared laser beams |
| TCSPC board | PicoQuant | Timeharp 200 | |
| Symphotime Imaging Software | PicoQuant | ||
| Matlab | Mathworks |
References
- Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. J Opt Soc Am B. 19 (9), (2002).
- Tolles, W. M., Nibler, J. W., McDonald, J. R., Harvey, A. B. A Review of the Theory and Application of Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS). Appl Spectrosc. , (1977).
- Weeks, T., Schie, I. W., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. Signal generation and Raman-resonant imaging by non-degenerate four-wave mixing under tight focusing conditions. J Biophoton. 3 (3), 169-175 (2010).
- Weeks, T., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. Raman Microscopy based on Doubly-Resonant Four-Wave Mixing (DR-FWM). Opt Express. 17 (19), 17044-17051 (2009).
- Schie, I. W., Weeks, T., McNerney, G. P., Fore, S., Sampson, J. K., Wachsmann-Hogiu, S., Rutledge, J. C., Huser, T. Simultaneous forward and epi-CARS microscopy with a single detector by time-correlated single photon counting. Optics Express. 16 (3), 2168-2175 (2008).
