Differential avbildning av biologiska strukturer med dubbeldestillerat-resonant Coherent Anti-Stokes Ramanspridning (CARS)

Summary

En kombination av tre enda våglängd kort pulsad laser används för att generera konsekvent anti-Stokes Ramanspridning (CARS) och dubbelt-resonanta bilar (DR-bilar). Skillnaden mellan dessa signaler ger bättre känslighet för annars är svårt att upptäcka sammanhängande Raman signaler, vilket möjliggör avbildning av svag Raman spridare.

Abstract

Sammanhängande Raman avbildningstekniker har sett en dramatisk ökning av aktiviteten under det senaste decenniet på grund av sitt löfte att göra det möjligt etiketten utan optisk avbildning med hög molekylär specificitet ^1. Känslighet för dessa tekniker är dock många storleksordningar svagare än fluorescens, vilket kräver milli-molar molekylära koncentrationer ^1,2. Här beskriver vi en teknik som kan möjliggöra upptäckt av svaga eller låga koncentrationer av Raman-aktiva molekyler genom att förstärka sin signal med uppgifter från starka eller riklig Raman spridare. Samspelet mellan korta pulsad laser i ett biologiskt prov genererar en mängd sammanhängande Ramanspridning signaler, som alla bär unika kemiska information om provet. Normalt är bara en av dessa signaler, t ex Coherent Anti-Stokes Ramanspridning (CARS), används för att skapa en bild medan de andra tas bort. Men när dessa andra signaler, inklusive 3-färg Personvagnar och fyra-våg blandning (FWM), samlas in och jämförs med CARS signalen, kan annars är svårt att identifiera information hämtas ^3. Till exempel är dubbelt-resonant bilar (DR-CARS) resultatet av konstruktiv interferens mellan två resonant signaler ^4. Vi visar hur inställning av tre lasrar krävs för att producera DR-bilar signaler till 2845 cm ^-1 CH sträcka vibrationer i lipider och 2120 cm ^-1 CD stretching vibrationen av en deuterated molekyl (t.ex. deuterated sockerarter, fettsyror, etc.) kan utnyttjas för att undersöka både Raman resonanser samtidigt. Under dessa förhållanden, förutom CARS signaler från varje resonans, en kombinerad DR-CARS signalen sondering båda också genereras. Vi visar hur upptäcka skillnaden mellan DR-CARS signalen och förstärker signalen från en riklig molekylens vibrationer kan användas för att öka känsligheten för den svagare signalen. Vi visar vidare att detta tillvägagångssätt även sträcker sig till applikationer där båda signalerna genereras från olika molekyler, så att t.ex. med hjälp av den starka Raman signal om ett lösningsmedel kan förbättra den svaga Raman signal om en utspädd lösning.

Protocol

1. Generations bilar och DR-bilar Signaler

För att skapa CARS och DR-bilar signaler samtidigt, är tre avstämbara och synkroniseras korta pulsad laser källor krävs.

1. För att få tre synkroniserade pulser börjar vi med en 10 W laser (PicoTrain, HighQ laser, Inc.). Denna laser har en fast våglängd på 1064 nm, en fast pulslängd på 7 PS, och en fast repetitionsfrekvens 76 MHz.
2. Med hjälp av en serie halv-våg plattor och polariserande stråldelare kuber strålen är uppdelad i tre delar. En halv-våg platta i kombination med en polariserande stråldelare kub ger oss möjlighet att justera mängden makten i varje del av balken utan att ändra dess riktning. Normalt är två balkar anpassas till ~ 4,5 W vardera och den tredje balken innehåller de resterande 1 W.
3. De två höga effekten balkar sedan riktas i två självständiga optiska parametriska oscillatorer (OPO-talet, Avante, APE GmbH, Berlin, Tyskland). OPO användning skillnad frekvens generation att konvertera en högre energi fotonen i två lägre energi fotoner med olika våglängder. Genom att kontrollera temperaturen i kristall används för att uppnå denna effekt kan våglängder av den resulterande fotoner styras till inom 0,1 nm. Genom frekvensdubbling dessa signaler, en laser med en fast våglängd på 1064 nm kan nu omvandlas till en laserstråle som kan ställas in någonstans mellan 780 nm och 910 nm. Genom att pumpa två separata OPO-talet med samma 1064 nm källa, får vi två oberoende avstämbara laser källor som automatiskt synkroniseras till vår ursprungliga pumpen laser.
4. Den tredje (lägsta effekt) strålen från 1064 nm pumpen laser är riktat runt OPO-talet av en kombination av dikroiska speglar så att alla tre strålar (2 från OPOS, 1 från pumpen laser) kan återförenas senare. För att effektivt producera sammanhängande Raman signal fotoner i rekombinerat pulser måste omlott både tidsmässigt och rumsligt. Eftersom OPO s innehåller ring håligheter, så att varje laserpuls att passera genom kristallen flera gånger, de strålar som skickas via OPO s resa ett extra avstånd vilket resulterar i en avsevärd försening i förhållande till den ursprungliga pumpen strålen. Detta avstånd måste kompenseras med den tredje strålen genom att införa extra speglar som tvingar denna balk att färdas samma sträcka som de andra två innan de återförenas med dichroic speglar.
5. För att ge finjustering av längden på den väg varje stråle färdas inställbar fördröjning steg, med hjälp av prisma REFLEXANORDNINGAR, införs i varje bom väg.
6. En annan uppsättning av halv-våg plattor och polariserande stråldelare kuber läggs till varje bom så att vi kan anpassa kraften på varje bom självständigt utan att påverka ingången på OPO-talet.
7. Dichroic speglar används för att först kombinera strålar från två Porto-talet och sedan med 1064 nm strålen. Försiktighet måste vidtas för att säkerställa att balkarna exakt överlappar (dvs de är collinear och har liknande divergens). Detta kan kontrolleras genom att jämföra överlappning av balkar nära (inom några centimeter) och långt ifrån (~ 1 m) dikroiskt spegeln.
8. Fördelen med att använda pulsad laser är att varje puls kan ha en hög topp energi på provet, vilket möjliggör effektiv generering av sammanhängande Raman signaler, och samtidigt bibehålla en låg genomsnittlig intensitet. En hög genomsnittlig intensitet kan skada provet. Därför för att ytterligare kontrollera den genomsnittliga intensiteten utan att offra topp energi, är de tre kombinerade strålar skickas genom en elektro-optisk modulator (Pockel cell, ConOptics) fungerar som en puls plockare, som tillåter oss att justera repetitionsfrekvens av pulser som anländer till vårt urval och därmed den genomsnittliga intensitet.
9. Den kombinerade laserstrålar sedan kopplas in i ett inverterat mikroskop med hög NA mål. Målet är vanligtvis en 60 X vatten objektiv med en numerisk apertur (NA) på 1,2 som har korrigerat för kromatisk aberration över hela skalan av avstämbarhet av våra OPO-talet och 1064 nm strålen. Den snäva fokus som genereras av den höga NA objektiv möjliggör den mest effektiva generationen sammanhängande Raman signaler på micron skala.
10. Den kombinerade balkar utvidgas för att mycket i back-porten på mikroskop målet. Genom att överfyllning baksidan av mikroskop mål vi kan uppnå det bästa att fokusera villkor och därför det bästa rumsliga upplösningen i våra mikroskop system.
11. Det objektivet i våra mikroskop är monterad på en XYZ piezo stadium som tillåter oss att få bilder av raster-scanning strålarna över provet, liknande kommersiella balk-scanning konfokala mikroskop.

2. Användning av tre korta pulsad laser

Användningen av tre korta pulsad laser resulterar i produktionen av flera bilar signaler från de olika combinations av två lasrar, samt 3-färg Personvagnar och DR-FWM signaler från en kombination av alla tre lasrar.

1. Våglängderna av signalerna kan ligga spektralt nära varandra. När signalerna är nära varandra kan det vara svårt att skilja dem för analys med fasta filter våglängd bandpass och dichroic speglar. Av denna anledning våra signaler går in i en avbildning spektrometer (SpectraPro 2300i, Acton Research) som också fungerar som en effektiv monokromator att rumsligt separata signaler på olika våglängder.
2. En elektroniskt manövrerad vända spegeln i spektrometern i nedfällt läge sänder signalen till en back-belyst djupt utarmning charge-coupled enhet (CCD) kamera som ger spektroskopisk information över hela signalen sortiment och ger oss möjlighet att identifiera och optimera olika sammanhängande Raman signaler.
3. För att välja den signal som vi vill bild vi roterar bara gallret i spektrometern, med från leverantören kontroll och datainsamling programvara (WinSpec, Princeton Instrument), till centrum toppen av ränta på CCD-kameran och ändra sedan positionen för flip spegeln att dirigera denna signal till en andra avfarten port som en enda foton räknar lavin fotodioden (APD) har bifogats.
4. Det objektivet är då raster-skannas och de signaler inspelade på APD används för att generera en bild genom att visa fotonen räkna ränta för varje pixel via datainsamling programvara (SymPhoTime, Picoquant GmbH, Berlin, Tyskland).
5. Vi upprepar denna avbildning förfarande för varje önskad sammanhängande Raman signal som tillåter oss att jämföra signaler under efterbehandlingen.

3. Provberedning

För att få tydliga, reproducerbara bilder viss försiktighet måste vidtas för att förbereda provet.

1. Proverna är oftast förberedda på ~ 150 micron tjockt glas täckglas. Dessa täckglas är tunna nog för att möjliggöra hög upplösning avbildning med 1,2 NA mål som vanligtvis används.
2. Optisk fångst av dielektriska objekt kan uppstå när laserljus brytas genom små genomskinliga objekt. Användningen av väl fokuserad, hög toppeffekt, kan korta pulsad laser strålar och dra sedan små celler eller bakterier tillsammans, vilket resulterar i suddiga eller utsmetade bilder. För att undvika detta kan det bli nödvändigt att immobilisera provet på ytan av glaset täckglas genom att först tillämpa ett tunt skikt av poly-L-lysin av spin-beläggning.
3. För celler i kultur glas botten kultur rätter kan utnyttjas som möjliggör avbildning utan att behöva lossa cellerna från deras tillväxt cellodling rätter.
4. För demonstration på detta bidrag vi sätta först en formaldehyd-fixed C. elegans nematod mask på en glaskupa halka.
5. Tillsätt sedan en 20 mikroliter droppe 5 M deuterated glukoslösning till masken. Den deuterated glukoslösning ger en unik och stark Raman bakgrund signatur.

4. Exempel på analys

För att kunna dra fördel av de två gånger resonant förstärkningseffekten Raman spektra av både Raman-resonant ämnen måste vara kända.

1. När provet är beredd på täckglas är det analyseras med hjälp av en konfokala ramanmikroskop att få fram den spontana Ramanspektrum och identifiera lämpliga toppar.
2. För att utföra DR-bilar vi identifiera de spektrala platserna för CH stretch-läge, vanligtvis förknippas med lipider, och CD-stretch-läge, i samband med deuterated glukos, att vara 2845 cm ^-1 och 2121 cm ^-1 respektive.
3. Sammanhängande Ramanspridning uppnås när frekvensen skillnaden mellan två lasrar matchar frekvensen av en molekylär vibration. Genom att ställa en OPO till 817 nm det kommer att söka av 2845 cm ^-1 CH-läge när de kombineras med 1064 nm laser och genom att finjustera andra Porto till 868 nm det kommer att söka av 2121 cm ^-1 topp när de kombineras med 1064 nm strålen .
4. Med raster-scanning provet på CARS mikroskop kan vi nu konstatera tre sammanhängande Raman signaler av intresse. En CARS signalen sondera CH stretching vibrationer, en CARS signal sondera läget CD-sträcka, och ett DR-CARS signalen sondering båda.
5. Vi väljer varje topp som beskrivs i avsnitt 2,3 och ta en bild som beskrivits ovan.

5. Bildbehandling

Extrahera ytterligare information baserat på dessa tre bilder nu kräver en del ganska enkla bildbehandling.

1. Första bilderna måste normaliseras. I teorin normalisering kan uppnås genom att redogöra för intensiteten i varje laser involverade i varje signal generation process. I praktiken har dock detta inte fungerar alltid, främst på grund av ojämn spektrala känslighetav dikroiskt speglar, detektorer, och galler.
2. En praktisk metod för normalisering förlitar sig på det faktum att i regioner där rena lipider dominerar signalen bör cd resonans inte bidra till någon av signalen. Likaså i områden av ren glukoslösning CH resonans bör inte bidra till någon av signalen. Med detta i åtanke normalisera vi DR-Cars bild och bilarna bilden fås på CD-skivan resonans av deuterated glukoslösning till en region bra utanför C. elegans mask som bör uppvisa någon CH resonans.
3. Då kan vi identifiera en region inom en mask i CH-resonant CARS bild som är rik på lipider och normalisera den till motsvarande region i den normaliserade DR-bilar bild. För den här metoden ska fungera antar vi att djupt inom denna region ingen deuterated glukos är närvarande. Detta är ett säkert antagande eftersom lipider är hydrofoba och kommer inte att blanda med lösningen.
4. Nu, genom att subtrahera den normaliserade CH-resonant BILAR bild från normaliserad DR-Cars bild vi är kvar med bara förstärks CD-resonant signal.
5. På samma sätt genom att subtrahera normaliserade cd-resonant BILAR bild från normaliserad DR-FWM bild vi är kvar med bara förstärkte CH-resonant signal.

6. Representativa resultat

Figur 1: Diagram över DR-CARS mikroskopi som beskrivs ovan.

Figur 2: Vitt ljus bild av ett C. elegans mask i deuterated glukoslösning beredd på ett glas täckglas och redo för avbildning.

Figur 3:. Ramanspektrum av modifierade oljesyra (en omättad fettsyra) som innehåller en alkyne modifiering (en kol trippel-band kol grupp) De starka CH resonanser vid 2845 cm ^-1 och alkyne resonans vid 2100 cm är ^-1 både väl isolerad från fingeravtryck regionen (regionen tätt packade toppar), vilket gör dem idealiska markörer för sammanhållen Raman avbildning.

Figur 4:. Typisk spektrum av sammanhängande Raman signaler när tre kort pulsade lasrar överlappas i provet Pilarna pekar på process (er) som ansvarar för varje signal som representeras av energi diagram. I diagrammen visas här streckade pilarna visar fotoner från lasern och OPO-talet och solida pilarna visar den resulterande signalen. Den fasta horisontella linjerna anger energin i Raman vibrationer och ge en visuell representation som i DR-bilar, mixning samma 3 ingång fotoner samtidigt sonder två olika Raman vibrationer.

Figur 5: Typiska resultat från bildbehandling C. elegans maskar med DR-bilar och bilar. Övre raden använde tre signaler som anges i figur 4 till bild en mask i en lösning av deuterated glukos. I den andra raden bilderna var lämpligt normaliserade och i den tredje raden skillnaden bilder som producerades genom att subtrahera varje CARS bilder från DR-Cars bild.

Discussion

Raman-spektroskopi och Raman-baserad avbildning är kraftfulla nya verktyg i bio vetenskaper. För närvarande gäller detta särskilt för in vivo och in vitro studier av cellulär metabolism och metabola sjukdomar i bearbetning och lagring av lipider. De flesta biologiska makromolekyler innehåller ett stort antal liknande, de flesta kolbaserade molekylbindningar, så att Raman spektra från celler och organismer är vanligtvis en faltning av bidrag från lipider, proteiner, nukleinsyror, socker, etc. Lipider är relativt lätt att isolera från dessa komplexa spektra, på grund av deras tendens att bilda täta droppar eller bilayers och eftersom de innehåller längre kedjor med ett stort antal obligationer alifatiska CH. Vår förmåga att isolera specifika proteiner, aminosyror, RNA eller DNA i den komplexa cellulära miljön är dock mycket begränsad. Detta gäller särskilt om dessa molekyler av intresse är bara närvarande vid mikroM koncentrationer och nedan. Här ger möjlighet att söka svaga Raman resonanser utnyttja vår nyligen introducerade DR-bilar tekniken skillnad avbildning ett potentiellt kraftfullt strategi för deras kemiska mikroanalys och bildhantering. Visserligen är den mest komplicerade delen av detta protokoll för anpassning och synkronisering av lasersystem. När man börjar från scratch, synkronisering av pulser, se dvs att pulserna överlappas i tiden trots olika vägar de tar kan underlättas genom användning av en puls autocorrelator. När rumsliga och tidsmässiga överlappning uppnås, bilar och DR-bilar signaler bör vara lätt upptäckas. Dock är den första justeringen ofta råa, vilket resulterar i svaga signaler. Det bästa praxis för att rikta det här systemet är väl att inledningsvis skapa svaga signaler och sedan för att förbättra signalstyrkan genom att försiktigt tweaking speglarna längs varje väg och justera tidsmässiga överlappningen med förseningen steg. Även spektrometern / monokromator fungerar som en mycket effektiv baffel för rumsbelysning det renaste resultat kan uppnås genom att tillämpa systemet med rummets belysning avstängd och gardiner eller objektivet rör för att minimera bakgrunden införts av flera andra ljuskällor (t.ex. datorskärmar, tänds, lysdioder osv.)

Vår specifika konfiguration använder single-photon räknar lavin fotodioden (APD) detektorer och tidskorrelerade enda foton räkna (TCSPC) hårdvara för att upptäcka ^5. Detta ger oss möjlighet att upptäcka extremt svaga signaler med relativt låg ljudnivå, men många grupper har hittat foto-multiplikator rör (PMT: s) med variabel förstärkning fördel när man gör liknande mätningar. Fördelen med PMT: s är att de erbjuder varierande vinna och har en mycket större upptäckt område som kan förenkla anpassningen av detektorn. Dessutom använder vår inställning piezo steg att översätta de mål för att uppnå balk skanning. Fördelen med detta är att vi har förmågan att gå tillbaka till någon plats inom det tidigare skannad bild med en hög grad av noggrannhet och ta ytterligare mätningar inklusive spontana Raman spektra. Andra grupper har lyckats utnyttja skanning spegel församlingar, eller hela konfokal enheter skanning som Olympus FluoView systemet, som ger mycket snabbare bildhantering, men är begränsad i sin förmåga att exakt återvända till godtyckliga platser i en bild.

Tuning lasrarna att matcha Raman resonans är också ett viktigt steg som kan kräva en del optimering. Även om Raman topparna kan vara känt den maximala spektraltopp intensiteten från DR-bilar och bilar inte nödvändigtvis motsvarar den högsta av de spontana Raman topp. Detta beror på den inneboende störningar av signaler som genereras av fyra våg blandning leder till en icke-resonant bakgrund signal och bilar, som snedvrider CARS spektra förhållande till spontana Raman spektra. Den spektrala läge toppen av CARS signalen kan beräknas, men en mer praktisk metod är att ställa in OPOS i flera, små spektrala steg över den förväntade platsen för Raman resonans. Denna process bör ge ett tydligt maximum. I själva verket, för den största känsligheten från DR-FWM båda resonanser måste vara inställda på detta tak.

En sista potentiellt problem i DR-bilar tillvägagångssätt har också diskuteras, dvs DR-CARS signalen beror på en homogen fördelning av Raman-aktiva förstärka molekyl. För de flesta biologiska objekt, kan detta vara väl breda OH resonans från vatten, som är riklig och nästan allestädes närvarande. Vatten är dock undantagna från hydrofoba regioner med en cell, till exempel lipid droppar, vilket leder till en snedvridning av de signaler som erhålls när använder vattnet resonans för att förstärka lipid lägen. I vårt exempel har vi använt en lösning av deuterated glukos för att skapa en enkelt kan upptäckas och riklig signal för vår biologiska prov. Likaså deuterated vatten eller deuterated biologiska Buffers, såsom d-HEPES kunde användas. I vårt exempel lipiddropparna inom C. elegans mask var små nog att alltid innehålla både det deuterated glukoslösning och lipider inom fokuserad laser plats i vårt system. Detta är dock i allmänhet inte sant. Ett särskilt exempel skulle vara adipocyter, som genererar ganska stora lipiddropparna inom sina cytoplasman. Detta innebär kräver varje experiment som utfördes med DR-CARS teknik noggranna förberedelser och experiment kontroll för att verifiera resultaten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60X water immersion objective	Olympus Corporation	UPLSAPO 60XW
Inverted Microscope	Olympus Corporation	IX-71SIF-3
Pockels Cell	ConOptics	350-160
Picotrain pump Laser	HighQ	IC-1064-10000
Optical Parametric Oscillator	APE	Levante IR
1.5 Glass cover slips	Fisher Scientific	12-545-102 25cm-1
Half-wave plates	Thorlabs Inc.	AHWP05M-980
Polarizing Beam Splitter Cubes	Thorlabs Inc.	PBS052 or PBS053
Spectrometer/Monochromator	Princeton Instruments/Acton	Spectra Pro 2300i
CCD Camera	Princeton Instruments/Acton	PIXIS: 100B
Avalanche Photo Diode	PerkinElmer, Inc.	SPCM-AGR-14-12691
XYZ Piezo Stage	Physik Instruments	P 733-2CL P 721.CDQ	This is a combination of an XY stage and a Z objective holder
Dichroic Mirrors	Semrock	Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25	These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient.
Dichroic Mirror	Chroma Technology Corp.	Z830rdc	To combine the different near-infrared laser beams
TCSPC board	PicoQuant	Timeharp 200
Symphotime Imaging Software	PicoQuant
Matlab	Mathworks