Summary
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד, העשרה, ותחזוקה של הגידול מדולובלסטומה בתאי גזע שמקורם בעכברים מוטנטים עם פעילות חוץ רחמי מסלול סוניק הקיפוד.
Abstract
גידולים במוח הוצעו להחזיק אוכלוסייה קטנה של תאי גזע הם שורש tumorigenesis. מבחני Neurosphere אומצו בדרך כלל ללמוד את טבעו של בתאי גזע עצביים, כולל אלו שמקורם ברקמות נורמליות tumorous. עם זאת, כמות ניכרת של התמיינות ומוות התא נפוצים neurospheres תרבותי בשל סביר מצב תת אופטימלי כגון נגישות של כל התאים בתוך אגרגטים בתחום התרבות עד בינוני.
מדולובלסטומה, הנפוצים ביותר בגידול ילדים CNS, מאופיינת בהתקדמות המהירה שלה נטייה להתפשט לאורך הציר מוח השדרה שלם עם התוצאה הקלינית העגומה. מדולובלסטומה היא גידול neuroepithelial של המוח הקטן, והיוו 20% ו -40% של גידול תוך גולגולתי ו הפוסות האחורי בילדות, בהתאמה 1. עכשיו זה מבוססת היטב כי ששש איתות מעודד ריבוי cerebellar נוירון מבשרי גרגיר (CGNPs) במהלך הפיתוח cerebellar 2-4. מחקרים רבים באמצעות מודלים העכבר, שבו מסלול ששש מופעל constitutively, מצאו קשר איתות ששש עם מדולובלסטומה 5-9.
דו"ח האחרונות הראו כי תת קבוצה של תאים שמקורם מדולובלסטומה Patched1 עכברים LacZ / + הם גזע סרטניים בתאים, אשר מסוגלים ליזום propogating גידולים 10. כאן אנו מתארים שיטה יעילה לבודד, להעשיר ולתחזק בתאי גזע סרטניים שמקורם מודלים העכבר כמה מדולובלסטומה, עם מסלול ששש מופעל constitutively עקב מוטציה והחליק (11, hereon כאמור SmoM2), GPCR כי הוא קריטי עבור ששש מסלול ההפעלה. ברקמת כל מדולובלסטומה מבודדים, הצלחנו להקים מושבות שגשוג רבים מאוד. תאים אלה הביעו וחסונה בתאי גזע עצביים מספר סמנים כגון Nestin ו Sox2, יכול לעבור קטעים סדרתי (יותר מ 20) והיו clonogenic. בעוד גזע אלה תאים בתרבית הגידול היו קטנות יחסית, bipoar לעתים קרובות עם גרעיני גבוהה יחס cytoplasmic כאשר בתרבית בתנאים לטובת צמיחה תא גזע, הם שינו באופן דרמטי את המורפולוגיה שלהם, הוארך תהליכים תאיים רבים, שטוח ונסוג מן מחזור התא על מעבר לתא בינוני תרבות בתוספת סרום 10% שור העובר. וחשוב יותר, אלה בתאי גזע סרטניים הבדיל לתוך Tuj1 + + או NeuN נוירונים, האסטרוציטים GFAP + + ו oligodendrocytes CNPase, ובכך הדגשת עוצמה מרובה שלהם. יתר על כן, תאים אלה מסוגלים הפצת medulloblastomas משני כאשר מושתלים orthotopically לעכברים המארח.
Protocol
1. Micro-דיסקציה של המוח הקטן נושאות גידולים, דיסוציאציה של רקמות ציפוי הגידול
- איחזור של רקמת הגידול
- מדולובלסטומה עכברים חולים נושאת לעתים קרובות היו המנוון, מוצג hydrocephaly ועל סימפטומים נוירולוגיים טיפוסי, כולל שיתוק האחורי ואי להחזיר יציבה כאשר התהפכה. כדי לאחזר את רקמת הגידול, להרדים עכברים משאיפת פחמן דו חמצני. חשוב לא לבצע את העקירה צוואר הרחם, תהליך שיוצר לחץ על הגולגולת האחורי והוא יכול לסכן את שלמות רקמת הגידול.
- עריפת ראש מבוצעת מיד לאחר מותו באמצעות מספריים, הסרת שיער רקמת שריר ככל האפשר עבור להדמיה טוב של הגולגולת. נקו את פני השטח של הגולגולת עם Kimwipe ספוגה אתנול 95%.
- השתמש במספריים בסדר לחתוך פתח לאורך קו האמצע של הגולגולת, ולהסיר רקמה הגולגולת באמצעות פינצטה בסדר, ובנקודה המוח כולו כולל המוח הקטן נושאות גידולים חשוף.
- בעוד cerebella של מבוגרים בריאים להציג מוגדרים היטב ההמיספרות ו vermis, cerebella של נושאות גידולים בעכברים לעיתים מוגדלת, אמורפי עם משטח חלק וכלי דם בולט. באמצעות שימוש בטכניקות סטריליות, לאחזר את הגידול cerebellar באמצעות פינצטה ומכניסים קר כקרח PBS ללא Mg2 + ו - Ca 2 +.
הערה: כל המכשירים הם מעוקרים באתנול 95% לפני השימוש. - דיסוציאציה של רקמת הגידול
- מעבירים את רקמת הגידול של PBS על Accutase 50% (בדילול מלא PBS) כי הוא על נפח 4 פעמים של רקמת הגידול, לרכך את רקמת עם מספריים בסדר 3 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו הדגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות , לאחר מכן הרקמה עובר pipeting חוזרות עם Pipetman 1-מ"ל למשך 3 דקות נוספות. שיטה זו אמורה להניב תערובת של תאים בודדים ו אגרגטים סלולריות קטנות.
- לדלל את ההשעיה הסלולר של פי 3 עם PBS ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 1000 גרם ל גלולה התאים. Resuspend התא גלולה בינוני טרי עצביים תא גזע תרבות צלחת על צלחת Primaria gelatinized 60 מ"מ רקמת תרבות. אנו משתמשים מנות Primaria עבור התקשרות משופרת ב ציפוי הראשון; הקטעים הבאים עשוי להיות מצופה על מנות התרבות קבוע רקמות.
הערה: סמל תרבות מנות עם 0.1% ג'לטין במשך לפחות 30 דקות. הכן תא טרי גזע עצביים תרבות בינוני המורכב בינוני Neurobasal עם גלוטמין, עט סטרפטוקוקוס, N2, B27, אדם EGF (25 ng / mL) ו FGF בסיסיים (25ng / mL).
2. , העשרה תחזוקה הרחבה של תאים סרטניים על ידי מדולובלסטומה מעברים סידורי
בדרך כלל אנחנו מקבלים מושבות רבות לאחר שבוע 1 של ציפוי ראשוני (איור 1). מושבות אלה ניתן הפרידו replated על מנות gelatinized חדש להעשרת אוכלוסיית תאים סרטניים. שינוי ראשון עד בינוני תרבות חדשה, ואז פשוט להשתמש 1-mL Pipetman כדי לנתק באופן מכני מושבות ואחריו pipeting חוזרות ונשנות במשך 4 דקות להניב ההשעיה הסלולר (Accutase ללא צורך). בדוק תחת מיקרוסקופ על מנת להבטיח כי גושי תאים גדולים כבר ניתק. אז לוותר על ההשעיה תא מנות gelatinized חדש culturing נוספת לעבור הליך זהה קטעים נוספים. תאים סרטניים פנוי, כדוריות הדם ואת סוגי תאים אחרים מוסרים על ידי סדרתי מחדש platings, עוזב את התאים הסרטניים מצורף להתרחב במהירות. שינוי התרבות בינוני ביום השני הבא זריעת הראשונית, וכל יום אחר לאחר מכן.
3. מכתים Immunofluorescent ועל בחינת תאים בתרבית
1. לגדל תאים סרטניים על coverslips זכוכית
ב 1 יום, מקום אחד זכוכית coverslip בכל צלחת 6-היטב, ואז להוסיף 0.1% ג'לטין במשך 30 דקות על 37 ° C. Seed כ 2-4X 10 5 תאים סרטניים לכל מ"ל. התאים צריכים לצרף לילה ואמצעי בתאי גזע עצביים השתנה ביום 3. מכתים מתבצעת ביום 4.
2 Immunofluorescent מכתים
הסר בינוני התרבות תאים לשטוף פעמיים עם קרים כקרח PBS. תקן את התאים עם טרי מתוצרת PFA 4% במשך 15 דקות. בקצרה לשטוף תאים פעמיים עם PBS ו permeablize טריטון עם 0.3% (ב PBS) במשך 5 דקות. בקצרה לשטוף תאים פעמיים עם PBS ולחסום עם סרום עיזים 10% במשך 40 דקות. דגירה התאים עם הנוגדנים העיקרית 90 דקות, ואז לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS, במשך 5 דקות כל אחד. דגירה התאים עם הנוגדנים משני במשך 60 דקות, ואז לשטוף שלוש פעמים עם PBS, 5 דקות כל אחד. הר coverslips על שקופיות עם 5 מ"ל של מדיום הרכבה מימית ולבצע מיקרוסקופיה confocal.
4. התמיינות של תאים סרטניים
הסר nתא eural גזע בינוני בקצרה לשטוף תאים עם PBS פעמיים. הוסף בינוני בידול ביום 1, לשנות בינוני ביום 4 ולקבוע רמת בידול על ידי מכתים immunofluorescence ביום 7. בידול בינוני מורכב DMEM, עט סטרפטוקוקוס ו -10% בסרום שור העובר.
5. נציג תוצאות
מורפולוגיה תוצאות
לאחר הטיפול Accutase ו pipeting חוזרות עדין, רקמת הגידול צריכה להיות מנותקת בעיקר לתוך אגרגטים הסלולר קטן תאים בודדים. מושבות ניכר רבים ניתן להבחין כבר 5 ימים לאחר ציפוי ראשוני, כפי שמוצג על ידי באיור 1. שגשוג תאים סרטניים ביותר הם לעתים קרובות דו קוטבי עם יחס גרעיני / cytoplasmic גבוהה. תאים אלה נתפסים בדרך כלל מקרין מן אגרגטים הסלולר קטן המחובר אל פני השטח gelatinized. תאים דם, קטן ועגול, מוסרים בדרך כלל על ידי שינויים במדיה עתידיים platings סדרתי. אחרי כמה קטעים, ניתן לראות מפוזרים באופן אחיד, שגשוג תאים סרטניים Ki67 + וזיהום קטנה עם סוגי תאים אחרים (איור 2).
הביטוי של סמנים עצביים תא גזע, ניתוח והבחנה משובט לתוך שושלות מרובים
כדי לקבוע אם שגשוג התאים שמקורם ניתק cerebellar רקמת הגידול המאפיינים להראות בתאי גזע סרטניים, ביצענו אפיון נוסף של ביטוי סמן תא גזע, ניתוח המשובטים ואת העוצמה בידול. מצאנו כי אלה תאים סרטניים מבודדים לבטא בתאי גזע עצביים סמנים כגון Sox2 ו Nestin (איור 3). כשלקחנו רקמות מן הגידול SmoM2-YFP, כל התאים הסרטניים להביע YFP. בקנה אחד עם מחקר שנערך לאחרונה דיווח כי cilia העיקרי חשובים לפיתוח של מדולובלסטומה מסלול תלויי ששש 12, SmoM2-YFP ביטוי מקומי היה ברור cilia של Sox2 + תאים סרטניים (איור 3). כאשר מצופה בצפיפות המשובטים של 300 תאים לכל מ"ל של מדיום תרבות, ראינו התרחבות משובטים מתא בודד גידול למושבה ניכר (איור 4). יתר על כן, תאים אלה היו מסוגלים להתמיין לסוגי תאים שונים עצב גליה כאשר בתרבית תחת בעד בידול התנאים (איור 5).
באיור 1. מורפולוגיה של מושבה שגשוג מאוד לאחר ציפוי הראשון של רקמות מדולובלסטומה ניתק. ככלל, צורות מושבה גדולה בתוך 5 ימים לאחר זריעה ראשונית של רקמת הגידול ניתק, וכן נציג אחד מודגם כאן בשדה בהיר. דו קוטבי, להקרין תאים מאורכים מתוך הצבירה הליבה תא צפוף. הנספחות תאים סרטניים הם קטנים, תאים עגולים דם אדומים, אשר מתרוקנים בהדרגה platings סדרתי.
איור 2. מורפולוגיה של תאים מדולובלסטומה הוקמה מעבר לשלושה קטעים. תמונה זו מציגה את השדה בהיר מראה טיפוסי של תאים מדולובלסטומה שהוקמו אחרי כמה פסקאות. התאים נשארים לרוב דו קוטבי עם יחס גרעיני / cytoplasmic גבוהה. אנחנו מראים מכתים טובולין acetylated של תאים סרטניים, אשר רובם רכיבה על אופניים, כפי שמוצג על ידי ביטוי Ki67 חזק.
איור 3. תאים מדולובלסטומה הוקמה להביע סמנים תא גזע עצביים. SmoM2-YFP סימני תאים להביע SMO constitutively פעיל, ולכן הפעילות מסלול ששש. כל התאים של שורות תאים הוקמה מדולובלסטומה הביע YFP, ורובם שיתוף הביעו רמות גבוהות של סמנים שונים עצביים תא גזע, כגון Nestin ו Sox2. מעניין, כאשר ביצענו זיהוי YFP אות עם כוח לייזר מינימלי במהלך מיקרוסקופיה confocal, זיהינו אות YFP מרוכזים cilia של תאים Sox2 +. תצפית זו עקבית עם 12 דיווח לאחרונה כי תיאר את תפקיד חיוני של cilia בפיתוח של מדולובלסטומה מסלול תלויי ששש.
איור 4. תאים סרטניים הוקמה עוברים משובטים הרחבה. לאחר ניתוק לתוך ההשעיה תא בודד, תאים סרטניים היו מצופה על 24 היטב צלחת בצפיפות המשובטים של 300 תאים לכל מ"ל של מדיום תרבות. בשנת היטב כל צפינו מושבות מורחבת clonally. זו סדרה של תמונות ממחישות שינויים בשדה בהיר אופייני לאורך תקופה של 10 יום של תרבות.
איור 5. התמיינות של תאים מנתח מדולובלסטומה הוקמה. כאשר תאים סרטניים היו משיטת EGF / bFGF המכילה סרום ללא בינוני עד DMEM/10 FBS%, YFP + תאים סרטניים שינו באופן משמעותי את המורפולוגיה שלהם מובחן לתוך תאים מסוגים שונים, including Tuj1 + + או NeuN נוירונים, GFAP + תאים astroglial או CNPase + oligodendrocytes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מתארים דרך יעילה לבודד, להעשיר ולתחזק גזע מדולובלסטומה תאים מרקמת הגידול הראשוני שנמצאו בעכברים עם מוטציה פעיל constitutively הקיפוד איתות. מצאנו כי צעד קריטי בהצלחה בהקמת גידול בריא קו תא גזע הוא הטיפול Accutase שימוש במהלך דיסוציאציה של רקמת הגידול הראשוני. מניסיוננו, כאשר dissociating first גידול רקמות במוח הקטן, 4 דקות של טיפול Accutase 50% ב 37 ° C, ואחריו 3 דקות של pipeting חוזרות באמצעות 1-mL Pipetman בדרך כלל תוצאה של זריעת ראשונה מוצלחת. כמו כן, חשוב להמתין עד מושבות ניכר נוצרות לפני ציפוי מחדש (איור 1). לאחר זריעת הראשונה, טיפול Accutase כבר לא נחוץ; pipeting חוזרות במשך 3-4 דקות באמצעות 1-mL Pipetman מספיקה כדי לסלק ו לנתק גושים התא ציפוי מחדש. אין להשתמש Pipetman נפח קטן יותר כמו טיפים עדין תגרום נזק לתאים בהרחבה. הקו הוקם תא יכול להיווצר מרקמת כל הגידול מבודדים תאים אלה שגשוג מאוד, וחסונה לבטא מספר סמנים עצביים תא גזע יכול להתמיין לשני סוגי תאים עצביים ועל גליה. ביצענו השתלת orthotopic של תאים אלה לתוך חיסונית נפגעת עכברים הנמען אשר לאחר מכן פיתח medulloblastomas משנית. אלו תאים סרטניים בתרבית רק לעתים נדירות הוצגו התמיינות ספונטנית או אפופטוזיס, התכונות המשותפות שיטות התרבות neurosphere. פרוטוקול זה מיועד ריבוי מוצלח של בתאי גזע סרטניים שמקורם medulloblastomas העיקרי ובכך, יאפשר לנו לבדוק את ההשפעות של גנים מועמדים ומעכבי כימיים על הצמיחה הקיפוד מונחה הגידול תא והתנהגות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי תרומות של ונדרבילט Ingram-Cancer Center תמיכה גרנט (P30 CA068485), המוח ילדות קרן גידול לבין המכון הלאומי לבריאות (NS042205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | 0.1% |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM |
| Primaria dishes | Fisher Scientific | 087724C | |
| Sox2 antibody | EMD Millipore | MAB4343 | Mouse, 1:1000 |
| Nestin antibody | DSHB | rat401 | Mouse, 1:200 |
| YFP antibody | Molecular Probes, Life Technologies | A11122 | Rabbit, 1:2000 |
| GFAP antibody | Neuromics | CH22102 | Chicken, 1:1000 |
| Tuj1 antibody | Sigma-Aldrich | T5076 | Mouse, 1:2000 |
| NeuN antibody | EMD Millipore | MAB377 | Mouse, 1:2000 |
| CNPase antibody | EMD Millipore | MAB326 | Mouse, 1:1000 |
References
- Rossi, A., Caracciolo, V., Russo, G. Medulloblastoma: From Molecular Pathology to Therapy. Clin Cancer Res. 14 (4), 971-971 (2008).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. Control of Neuronal Precursor Proliferation in the Cerebellum by Sonic Hedgehog. P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).
- Dahmane, N., Ruiz, A., Altaba, I. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3089 (1999).
- Wallace, V. A. Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum. Curr Biol. 9 (8), 445-445 (1999).
- Fan, X., Eberhart, C. G. Medullablastoma Stem Cells. J Clin Oncol. 26 (17), 2821-2821 (2008).
- Yoon, J. W., Gilbertson, R., Iannaccone, S. Defining a Role for Hedgehog Pathway Activation in Desmoplastic Medulloblastoma by Identifying GLI1 Target Genes. International journal of cancer. 124 (1), 109-109 (2009).
- O'Dorisio, M. S., Khanna, G., Bushnell, D. Combining anatomic and molecularly targeted imaging in the diagnosis and surveillance of embryonal tumors of the nervous and endocrine systems in children. Review. Cancer metastasis reviews. 27 (4), 665-665 (2008).
- Corcoran, R. B., Bachar Raveh, T., Barakat, M. T. Insulin-like Growth Factor 2 Is Required for Progression to Advanced Medulloblastoma in patched1 Heterozygous Mice. Cancer research. 68 (21), 8788-8788 (2008).
- Gilbertson, R. J., Ellison, D. W. The Origins of Medulloblastoma Subtypes. Annual review of pathology. 3, 341-341 (2008).
- Ward, R. J., Lee, L., Graham, K. Multipotent CD15+ Cancer Stem Cells in Patched-1 Deficient Mouse Medulloblastoma. Cancer research. 69 (11), 4682-4682 (2009).
- Mao, J., Ligon, K. L., Rakhlin, E. Y. A Novel Somatic Mouse Model to Survey Tumorigenic Potential Applied to the Hedgehog Pathway. Cancer research. 66, 10171-10171 (2006).
- Han, Y. G., Kim, H. J., Dlugosz, A. A. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature medicine. 15 (9), 1062-1062 (2009).
