Summary
이 프로토콜은 절연, 강화하고, 이소성 소닉 헤지 호그 경로 활동과 돌연변이 생쥐에서 파생된 medulloblastoma 종양의 줄기 세포의 유지 보수를 설명합니다.
Abstract
뇌 종양은 tumorigenesis의 근본 원인 아르 줄기 세포의 작은 인구를 보유하기 위해 제안되었습니다. Neurosphere의 assays는 일반적으로 정상과 tumorous 조직에서 추출한 포함 신경 줄기 세포의 특성을 연구하기 위해 채택되었습니다. 그러나, 분화 및 세포 사망의 감지할 수있을 정도의 금액은 문화 매체 영역을 합산 내의 모든 세포의 접근성 등 하위 최적의 상태로 가능성 때문에 교양 neurospheres에서 흔히 있습니다.
Medulloblastoma, 가장 일반적인 소아 CNS 종양은 그 빠른 진행과 디즈멀 임상 결과와 전체 뇌 - 척추 축을 따라 확산 경향이 특징입니다. Medulloblastoma은 각각 1 20 %와 아동기에 intracranial 및 사후 포사 종양의 40 %에 대한 회계, 소뇌의 neuroepithelial 종양이다. 그것은 지금은 잘 쉬 신호는 소뇌 발달 2-4 중 소뇌 과립 신경 세포의 엽 성의 전구 물질 (CGNPs)의 확산을 자극한다는 걸 입증합니다. 쉿 경로가 constitutively 활성화되는 마우스 모델을 사용하여 많은 연구가, medulloblastoma 5-9로 쉬 신호를 연결했습니다.
최근 보고서는 Patched1 LacZ / + 마우스에서 파생된 medulloblastoma 세포의 일부가 종양 10 시작하고 propogating 능력이 암 줄기 세포,있는 것으로 나타났습니다. 여기서 우리는 효율적인 방법 Smoothened에 돌연변이 (11, hereon가 SmoM2로 함), 쉬를 위해 중요합니다 GPCR로 인해 constitutively 활성화 쉬 경로와 medulloblastoma의 여러 마우스 모델에서 파생된 종양 줄기 세포를 분리 풍부 및 유지 보수를 설명 경로 활성화. 모든 격리된 medulloblastoma 조직에서 우리는 많은 높은 proliferative 식민지를 설정할 수 있었다. 견고 같은 Nestin 및 Sox2 등 여러 신경 줄기 세포의 마커를 표현이 세포는, 일련 구절을 받다 (20보다 큰)과 clonogenic되었습니다 수 있습니다. 이러한 교양 종양의 줄기 세포가 줄기 세포의 성장을 좋아하는 조건에서 양식 때 세포질 비율이 높은 핵과 자주 bipoar 비교적 작은 동안, 그들은 극적으로, 그들의 형태를 변경 여러 세포 프로세스를 확장 평평하고 세포로 전환시 세포주기에서 전학을 가겠다고 문화 매체 10 % 태아 소 혈청과 보완. 더 중요한 것은, 이러한 종양 줄기 세포가 Tuj1로 차별 + 또는 NeuN + 뉴런, GFAP + astrocytes 및 CNPase + oligodendrocytes, 따라서 그들의 멀티 힘을 강조. 또한, 이들 세포는 orthotopically 호스트 마우스에 이식하면 보조 medulloblastomas을 전파 수 있었다.
Protocol
1. 종양 - 베어링 소뇌의 마이크로 절개, 종양 조직과 도금의 해리
- 종양 조직 검색
- 아픈 쥐 베어링 medulloblastoma가 자주 runted 있었다 hydrocephaly 및 사후 마비 및 전복시 자세를 회복하기 위해 실패를 포함하여 전형적인 신경 증상이 표시됩니다. 종양 조직을 검색하려면, 이산화탄소 흡입하여 쥐를 안락사. 자궁 경부 전위, 뒷부분 두개골에 압력을 생성하고 종양 조직 무결성을 손상 수있는 절차를 수행하지 않는 것이 중요합니다.
- 잘린은 두개골의 좋은 시각화를위한 머리 근육 조직 최대한 제거, 가위를 사용하여 죽은 후 즉시 수행됩니다. 95 % 에탄올로 적셔 Kimwipe와 두개골의 표면을 청소하십시오.
- 두개골의 정중선을 따라 개방 잘라하고, 어느 시점에 종양 베어링 소뇌를 포함하여 전체 두뇌가 노출, 괜찮아요 핀셋을 사용하여 두개골 조직을 제거하는 미세 가위를 사용합니다.
- 건강한 성인의 cerebella 잘 정의 반구와 vermis를 표시하지만, 종양이 베어링 생쥐의 cerebella은 종종 매끄러운 표면과 눈에 혈관과 비정질, 확대하고 있습니다. 무균 기법을 사용하여, Mg2 않고 얼음처럼 차가운 PBS에 핀셋과 장소를 사용하여 소뇌 종양을 검색 + 및 CA 2 +.
참고 : 모든 악기가 사용하기 전에 95 %의 에탄올로 소독하고 있습니다. - 종양 조직의 분리
- 4 분간 37 인큐베이션 다음 실온에서 3 분 고급 가위, ° C로 조직을 말하다, PBS에서 종양 조직의 4 배 볼륨 약 50 % Accutase (PBS에 희석)에 종양 조직을 전송 , 그 이후 조직 추가 3 분 1 - ML의 Pipetman와 반복 pipeting를 겪습. 이 방법은 단일 세포와 작은 세포 집합체의 혼합물을 얻을 것입니다.
- 펠렛 세포에 1천그램에서 5 분 동안 휴대폰 정지 PBS로 3 배와 원심 분리기를 희석. gelatinized 60mm의 Primaria 조직 문화 요리에 신선한 신경 줄기 세포 배양 매체와 플레이트의 세포 펠렛을 Resuspend. 우리가 먼저 도금에서 향상된 첨부 파일 Primaria 요리를 사용하여, 후속 단락은 일반적인 조직 문화 요리에 도금 수 있습니다.
참고 : 적어도 30 분 젤라틴 0.1 %로 코트 문화 요리. 글루타민, 펜 - Strep, N2, B27, 인간 EGF (25 NG / ML)과 기본 FGF (25ng / ML)로 Neurobasal 매체의 구성 신선한 신경 줄기 세포 배양 매체를 준비합니다.
2. 강화, 유지 보수 및 시리얼 항로로 Medulloblastoma 종양 세포 확장
우리는 일반적으로 초기 도금의 일주합니다 (그림 1) 이후 많은 식민지를 얻을. 이들 식민지는 dissociated 및 종양 세포 인구의 농축을위한 새로운 gelatinized 요리에 replated 수 있습니다. 새로운 문화 매체 먼저 변경 사항은 다음 단순히 기계적으로 세포 현탁액 (아무 Accutase가 필요하지)를 항복 4 분 동안 반복 pipeting 다음 식민지를 분리하기 위해 1 - ML Pipetman를 사용합니다. 대형 세포 대단히 짧은 시간이 dissociated되었는지 확인하기 위해 현미경으로 확인합니다. 그런 다음 추가 culturing에 대한 새로운 gelatinized 요리에 세포 현탁액을 조제하고 추가 구절에 대해 동일한 절차를 통해 이동합니다. 무소속의 종양 세포, 혈액 세포와 다른 세포 유형이 부착된 종양 세포가 급속하게 확장 떠나, 다시 platings 직렬에 의해 제거됩니다. 문화 초기 시딩 다음 두 번째 날이 매체 및 이후 매일을 변경합니다.
3. Immunofluorescent 스테 이닝 및 교양 세포의 시험
1. 유리 coverslips에 종양 세포를 성장
1 일, 6 잘 접시의 각 놓으 유리 coverslip에 다음 37 30 분 젤라틴 0.1 % ° C.를 추가 ML 당 종자는 약 2 - 4X 10 5 종양 세포. 세포가 하룻밤 사이에 첨부해야하고 신경 줄기 세포 매체는 하루에 3 바뀌었습니다. 얼룩은 4 일 수행됩니다.
이 Immunofluorescent 얼룩
얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 배지 및 세척 세포를 제거합니다. 15 분 동안 갓 만든 4퍼센트 PFA로 세포를 수정. 간단히 PBS로 두 번 세포를 씻어 5 분 0.3 % 트리톤 (PBS)와 permeablize. 간단히 40 분 10 % 염소 혈청과 PBS와 블록과 두 세포를 씻으십시오. 90 분간 일차 항체와 세포를 부화 후, 오분 각, PBS로 세포를 세 번 씻는다. 60 분 차 항체와 세포를 부화 후, 오분 각각, PBS로 세 번 씻어. 수성 설치 매체의 5 ML과 슬라이드에 coverslips를 탑재하고 공촛점 현미경을 수행합니다.
4. 종양 세포의 분화
n을 제거eural의 줄기 세포 매체와 짧게 두 번 PBS로 세포를 씻어. 일 1 차별 매체를 추가, 일 4 매체를 변경하고 일 7 immunofluorescence 염색법에 의해 분화의 수준을 결정합니다. 차별화 매체 DMEM, 펜 - Strep와 10 % 태아 소 혈청으로 구성되어 있습니다.
5. 대표 결과
형태 결과
Accutase 처리 및 부드러운 반복 pipeting 후, 종양 조직은 작은 세포 집계 및 단일 세포로 대부분 dissociated해야합니다. 많은 상당한 식민지는 그림 1과 같이 초기 도금 후 5 일 빠르면 볼 수 있습니다. 높은 proliferative 종양 세포가 높은 핵 / 세포질 비율로 종종 이중 극성입니다. 이러한 세포는 일반적으로 gelatinized 표면에 부착된 작은 세포 집합체에서 발산 볼 수 있습니다. 작고 둥근 혈액 세포는, 일반적으로 후속 매체 변경 및 시리얼 platings에 의해 제거됩니다. 몇 구절 후, 하나는 볼 수 균일하게 분산, proliferative Ki67 + 종양 세포와 다른 세포 유형 (그림 2)와 작은 오염.
신경 줄기 세포의 마커, clonal 분석 및 여러 lineages로 분화 표현
proliferative 세포 종양 줄기 세포의 dissociated 소뇌 종양 조직 쇼 특성에서 파생된 여부를 확인하기 위해, 우리는 줄기 세포 마커 표현, clonal 분석 및 차별화의 힘에 의해 더욱 특성화를 수행했습니다. 우리는이 분리된 종양 세포가 높은 등 Sox2과 Nestin (그림 3)과 같은 신경 줄기 세포의 마커를 표현하는 것으로 나타났습니다. 우리가 SmoM2 - YFP 종양에서 조직을 검색할 때, 모든 종양 세포 표현 YFP. 그 기본 속눈썹을보고 최근의 연구와 일치는 쉬 경로에 의존 medulloblastoma 12 SmoM2 - YFP 표현이 명확하게 Sox2의 속눈썹 + 종양 세포 (그림 3) 지역화된했습니다의 발전을 위해 중요합니다. 문화 매체의 ML 300 세포의 clonal 밀도에 도금 때, 우리는 하나의 종양 세포에서 상당한 식민지 (그림 4) clonal 확장을 관찰했다. 또한, 이들 세포는 프로 차별화 조건 (그림 5)에서 양식 때 여러 가지의 연결 및 glial 세포 유형으로 구별 수있었습니다.
그림 1. dissociated medulloblastoma 조직의 첫 번째 도금 후에 높은 proliferative 식민지의 형태. 일반적으로, 5 dissociated 종양 조직의 초기 시딩 며칠 후에, 그리고 대표 하나에 상당한 크기의 식민지 양식은 밝은 분야에서 여기에 그림입니다. 고밀도 코어 셀 집합에서 BI - 극지, 길쭉한 세포의 방출. 점진적으로 일련 platings에 의해 고갈 작은 둥근 적혈구가있는 종양 세포에 첨부.
그림 2. 세 구절 이상 설립 medulloblastoma 세포의 형태. 이 명시야 이미지는 몇 구절 후 설립 medulloblastoma 세포의 전형적인 모습을 보여줍니다. 세포가 높은 세포질 / 핵의 비율로 대부분 이중 극성 남아 있습니다. 우리는 종양 세포의 acetylated tubulin의 얼룩을 표시,이 중 대부분은 강력한 Ki67 표현으로 표시된 사이클링됩니다.
그림 3. 설립 medulloblastoma 세포는 신경 줄기 세포 마커를 표현한다. SmoM2 - YFP는 constitutively 활성화 SMO, 따라서 쉬 통로의 활동을 표현하는 세포를 표시합니다. 설립 medulloblastoma 세포 라인의 모든 세포가 YFP을 표현하고, 그들의 대부분은 Nestin 및 Sox2 등 다양한 신경 줄기 세포 마커, 높은 수준의 공동 표현. 흥미롭게도, 우리가 공촛점 현미경 동안 최소한의 레이저 전원과 YFP 신호 감지를 수행할 때, 우리는 Sox2 + 세포의 속눈썹에 집중 YFP 신호를 발견했습니다. 이 관찰 쉬 경로에 의존 medulloblastoma 개발에 솜털의 필수적인 역할을 설명한 최근 보고서 12 일치합니다.
그림 4. 설립 종양 세포가 clonal 확장을 받고있다. 분리 후 단일 세포 현탁액에, 종양 세포는 배지의 ML 300 세포의 clonal 밀도에서 24 잘 판에 도금했다. 각 물론 우리는 clonally 확대 식민지를 관찰했다. 명시야 이미지의이 시리즈는 문화의 10 일간에 걸쳐 전형적인 변화를 보여줍니다.
그림 5. 설립 medulloblastoma 세포의 차별화 분석. 종양 세포는 EGF / bFGF가 DMEM/10 % FBS, YFP + 종양 세포는 크게 자신의 형태를 변경하고 다양한 셀 유형, 병원에 차별에 혈청이없는 매체를 포함에서 전환되었을 때Tuj1를 luding + 또는 NeuN + 뉴런, GFAP + astroglial 셀 또는 CNPase + oligodendrocytes.
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Discussion
우리는 constitutively 적극적인 헤지 호그 신호와 돌연변이 생쥐에서 가져온 기본 종양 조직에서 medulloblastoma의 줄기 세포를 분리 풍부하고 유지하는 효율적인 방법을 설명합니다. 우리는 성공적으로 건강한 종양의 줄기 세포 라인을 확립 한 중요한 단계는 기본 종양 조직의 분리시 사용되는 Accutase 치료되고있는 것으로 나타났습니다. 우리의 경험에서 때 소뇌에서 첫번째 dissociating 종양 조직, 37에서 50 % Accutase 처리 사분 ° C, 일반적으로 성공적인 첫번째 시딩가 발생합니다 1 ML Pipetman를 사용하여 반복 pipeting 3 분 따라갔다. 상당한 식민지가 다시 도금 (그림 1) 이전에 형성 때까지 기다리는 것도 중요합니다. 첫 번째 시딩 후, Accutase 치료가 더 이상 필요가 없습니다, 1 - ML Pipetman를 사용하여 3~4분에 대한 반복 pipeting 다시 도금을위한 세포 대단히 짧은 시간을 이동시키다하고 교제를 끊다에 충분합니다. 양질의 도움말을 광범위하게 세포를 손상시킬 수 있으므로 작은 볼륨 Pipetman를 사용하지 마십시오. 설립 세포주 고립된 각 종양 조직에서 생성된 이러한 세포가 매우 proliferative 아르 수 있으며, 견고하게 여러 신경 줄기 세포의 마커를 표현하고 모두의 연결 및 glial 세포 종류로 구별하실 수 있습니다. 우리는 이후 보조 medulloblastomas을 개발 단백질 손상받는 마우스에 이들 세포의 orthotopic 이식을 수행했습니다. 문화의 이러한 종양 세포는 거의 자연스럽게 차별화 또는 apoptosis, neurosphere 문화 방법에 일반적인 기능을 전시하지 않습니다. 이 프로토콜은 기본 medulloblastomas에서 파생된 종양 줄기 세포의 성공적인 번식을 위해 설계되었으며 따라서, 우리는 헤지 호그 중심의 종양 세포 성장과 행동에 대한 후보 유전자 및 화학 억제제의 효과를 테스트하기 위해 사용됩니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 밴더빌트 - 잉그램 암 센터 지원 그랜트 (P30 CA068485), 아동 뇌종양 재단과 국립 보건원 (NS042205)에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | 0.1% |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM |
| Primaria dishes | Fisher Scientific | 087724C | |
| Sox2 antibody | EMD Millipore | MAB4343 | Mouse, 1:1000 |
| Nestin antibody | DSHB | rat401 | Mouse, 1:200 |
| YFP antibody | Molecular Probes, Life Technologies | A11122 | Rabbit, 1:2000 |
| GFAP antibody | Neuromics | CH22102 | Chicken, 1:1000 |
| Tuj1 antibody | Sigma-Aldrich | T5076 | Mouse, 1:2000 |
| NeuN antibody | EMD Millipore | MAB377 | Mouse, 1:2000 |
| CNPase antibody | EMD Millipore | MAB326 | Mouse, 1:1000 |
References
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