Summary
Este protocolo descreve o isolamento, enriquecimento e manutenção das células do tumor meduloblastoma-tronco derivadas de camundongos mutantes com ectópica atividade da via sonic hedgehog.
Abstract
Tumores cerebrais têm sido sugeridos para possuir uma pequena população de células-tronco que são a causa raiz de tumorigênese. Neurosphere ensaios têm sido geralmente adotado para estudar a natureza das células-tronco neurais, incluindo aquelas derivadas de tecidos normais e tumorais. No entanto, quantidades apreciáveis de diferenciação e morte celular são comuns na cultura neurospheres provavelmente devido ao sub-ótimas condições tais como a acessibilidade de todas as células dentro de agregados esfera para meio de cultura.
Meduloblastoma, o tumor mais comum do SNC pediátrica, é caracterizada pela sua rápida progressão e tendência a se espalhar ao longo do eixo cérebro-espinhal inteira com o resultado clínico sombrio. Meduloblastoma é um tumor neuroepiteliais do cerebelo, responsável por 20% e 40% dos tumores intracranianos e fossa posterior na infância, respectivamente 1. É agora bem estabelecido que a sinalização Shh estimula a proliferação de precursores granulares do cerebelo neurônio (CGNPs) durante o desenvolvimento do cerebelo 2-4. Numerosos estudos utilizando modelos de ratos, em que a via de Shh é constitutivamente ativado, ligaram sinalização Shh com meduloblastoma 5-9.
Um relatório recente mostrou que um subconjunto de células derivadas de meduloblastoma Patched1 ratos LacZ / + são as células-tronco cancerosas, que são capazes de iniciar e propogating tumores 10. Aqui nós descrevemos um método eficiente para isolar, enriquecer e manter células-tronco tumorais derivados de modelos do rato várias meduloblastoma, com constitutivamente ativado via de Shh devido a uma mutação no Smoothened (11, doravante referida como SmoM2), um GPCR, que é fundamental para Shh ativação da via. Em todos os tecidos meduloblastoma isoladas, foram capazes de estabelecer numerosas colônias altamente proliferativa. Estas células robustamente expressa vários marcadores de células-tronco neurais, tais como nestina e Sox2, pode sofrer passagens em série (maior que 20) e foram clonogênica. Embora essas células-tronco cultivadas tumor eram relativamente pequenos, muitas vezes com bipoar nuclear elevada relação entre citoplasmática quando cultivadas em condições favorecendo o crescimento de células-tronco, que alterou drasticamente sua morfologia, estendida vários processos celulares, achatada e retirou-se do ciclo celular após a mudança para uma célula meio de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino. Mais importante, estas células-tronco tumorais diferenciado em Tuj1 + ou + NeuN neurônios, astrócitos GFAP + e + CNPase oligodendrócitos, ressaltando assim a sua potência multi-. Além disso, essas células eram capazes de propagar meduloblastomas secundário quando ortotopicamente transplantadas em camundongos host.
Protocol
1. Micro dissecção de Tumor-rolamento Cerebelo, dissociação do tecido tumoral e Galvanização
- Recuperação do tecido tumoral
- Meduloblastoma tendo doente camundongos foram muitas vezes runted, exibido hidrocefalia e típicos sintomas neurológicos, incluindo paralisia posterior e insuficiência de recuperar a postura, quando capotou. Para recuperar tecido tumoral, euthanize ratos por inalação de dióxido de carbono. É importante não realizar deslocamento cervical, um procedimento que gera pressão para a posterior do crânio e pode comprometer a integridade do tecido do tumor.
- Decapitação é realizada imediatamente após a morte usando um par de tesouras, a remoção de pêlos e tecido muscular, tanto quanto possível para uma boa visualização do crânio. Limpe a superfície do crânio com Kimwipe embebido com álcool 95%.
- Use uma tesoura fina para cortar uma abertura ao longo da linha média do crânio, e remover o tecido usando uma pinça fina crânio, altura em que todo o cérebro, incluindo tumor-rolamento cerebelo é exposto.
- Enquanto o cerebelo de adultos saudáveis mostrar bem definidas hemisférios e vermis, o cerebelo de camundongos portadores de tumor são muitas vezes alargada, amorfa com uma superfície lisa e vasos sanguíneos visíveis. Usando técnicas estéreis, recuperar o tumor cerebelar usando uma pinça e coloque em PBS gelado sem Mg2 + e Ca 2 +.
Nota: todos os instrumentos são esterilizados em etanol 95% antes de usar. - Dissociação do tecido tumoral
- Transferir o tecido tumoral a partir de PBS para Accutase 50% (diluído em PBS), que é cerca de 4 vezes o volume do tecido tumoral, mince o tecido com uma tesoura bem por 3 minutos em temperatura ambiente, seguido de incubação a 37 ° C por 4 minutos , após o qual o tecido passa por pipetagem repetitiva com um Pipetman de 1 ml para mais 3 minutos. Este método deve render uma mistura de células isoladas e pequenos agregados celulares.
- Diluir a suspensão celular 3 vezes com PBS e centrifugar por 5 minutos a 1000 g para agregar as células. Ressuspender o pellet celular em meio de cultura fresco neural de células-tronco e em uma placa de 60 milímetros gelatinizado Primaria prato de cultura de tecidos. Usamos pratos Primaria para fixação reforçada em chapeamento em primeiro lugar; passagens subseqüentes podem ser semeados em placas de cultura de tecido normal.
Nota: pratos Brasão cultura com 0,1% de gelatina por pelo menos 30 minutos. Prepare-tronco neurais fresco meio de cultura celular consistindo de médio Neurobasal com glutamina, Pen-Strep, N2, B27, EGF humano (25 ng / mL) e FGF básico (25 ng / mL).
2. Manutenção, enriquecimento e expansão das células tumorais Meduloblastoma por passagens seriadas
Costumamos ter muitas colônias após 1 semana de o início do cultivo (Figura 1). Estas colônias podem ser dissociadas e replated em novos pratos gelatinizado para o enriquecimento da população de células tumorais. Primeira mudança de meio de cultura novo, então simplesmente use um Pipetman de 1 ml para separar mecanicamente colônias seguido por pipetagem repetitiva por 4 minutos para produzir uma suspensão celular (não Accutase necessário). Verificar sob um microscópio para assegurar que aglomerados de grandes células foram dissociadas. Então dispensar suspensão de células em novos pratos gelatinizado para cultura ainda mais e atravessar o mesmo procedimento para passagens adicionais. Células tumorais desapegado, células sanguíneas e outros tipos de células são removidas por série re-chapeamentos, deixando as células do tumor ligado a expandir-se rapidamente. Alterar meio de cultura, no segundo dia após a semeadura inicial, e todos os outros dias depois.
3. A coloração de imunofluorescência e Exame de células cultivadas
1. Cultivar células tumorais em lamínulas
No dia 1, coloque uma lamela de vidro em cada um uma placa 6-bem, em seguida, adicionar 0,1% de gelatina por 30 minutos a 37 ° C. Semente de cerca de 2-4X 10 5 células tumorais por ml. As células devem anexar noite eo meio células-tronco neurais mudou no dia 3. Coloração é realizada no dia 4.
2 coloração imunofluorescência
Remova o meio de cultura e lave as células duas vezes com PBS gelado. Fixar as células com recém-made PFA 4% por 15 minutos. Brevemente lavar as células duas vezes com PBS e permeablize com Triton 0,3% (em PBS) por 5 minutos. Brevemente lavar as células duas vezes com PBS e bloquear com soro de cabra 10% por 40 minutos. Incubar as células com o anticorpo primário por 90 minutos, depois lave as células três vezes com PBS, por 5 minutos cada. Incubar as células com anticorpo secundário por 60 minutos, depois lavar três vezes com PBS, 5 minutos cada. Monte lamínulas em lâminas com 5 mL de um meio aquoso de montagem e realização de microscopia confocal.
4. Diferenciação das células tumorais
Remover nEURAL meio de células-tronco e brevemente lavar as células com PBS duas vezes. Adicionar médio diferenciação no dia 1, a mudança média no dia 4 e determinar o nível de diferenciação por imunofluorescência no dia 7. O meio de diferenciação consiste em DMEM, Pen-Strep e 10% de soro fetal bovino.
5. Resultados representante
Resultados morfologia
Após o tratamento Accutase pipetagem repetitiva e suave, o tecido do tumor deve ser dissociadas em sua maioria em pequenos agregados celulares e células individuais. Muitas colônias considerável pode ser observado logo em 5 dias após o início do cultivo, como mostrado na Figura 1. Células tumorais altamente proliferativa são muitas vezes bi-polar com relação nuclear / cytoplasmic elevada. Estas células são vistos tipicamente irradiam de pequenos agregados celulares ligados à superfície gelatinizada. Células do sangue, pequenas e redondas, são normalmente removidas por alterações posteriores mídia e chapeamentos serial. Depois de várias passagens, pode-se observar uniformemente distribuída, proliferativa Ki67 + células tumorais e contaminação pouco com outros tipos de células (Figura 2).
Expressão de marcadores de células-tronco neurais, análise clonal e diferenciação em múltiplas linhagens
Para determinar se as células proliferativas derivado de tumor cerebelar dissociada características do tecido show de células-tronco tumorais, foi realizada a caracterização adicional pela expressão marcador de células-tronco, a análise clonal e potência de diferenciação. Descobrimos que essas células tumorais isoladas altamente expressam marcadores de células-tronco neurais, tais como Sox2 e nestina (Figura 3). À medida que recuperados a partir de tecidos SmoM2-YFP tumor, todas as células do tumor expressar YFP. De acordo com um recente estudo relatando que cílios são importantes para o desenvolvimento de meduloblastoma caminho-dependente Shh 12, SmoM2-YFP expressão foi claramente localizada aos cílios de Sox2 + células tumorais (Figura 3). Quando plaqueadas na densidade clonal de 300 células por mL de meio de cultura, observou-se expansão clonal de uma célula de tumor único para uma colônia de tamanho considerável (Figura 4). Além disso, essas células foram capazes de se diferenciar em vários tipos de células neuronais e gliais, quando cultivado nas condições pro-diferenciação (Figura 5).
Figura 1. Morfologia de uma colônia altamente proliferativa após o plaqueamento primeiro de tecido meduloblastoma dissociados. Geralmente, uma forma considerável colônia dentro de 5 dias após a semeadura inicial de tecido tumoral dissociados, e um representante é ilustrada aqui em campo claro. Bi-polar, irradiar células alongadas a partir de um agregado denso núcleo da célula. Anexado às células tumorais são pequenas, redondas glóbulos vermelhos, que são gradualmente esgotado por chapeamentos serial.
Figura 2. Morfologia das células meduloblastoma estabelecido além de três passagens. Esta imagem de campo claro mostra a aparência típica de células meduloblastoma estabelecido após várias passagens. As células permanecem em sua maioria bi-polar com relação nuclear / cytoplasmic elevada. Mostramos coloração tubulina acetilada das células tumorais, a maioria dos quais de bicicleta, como mostrado pela expressão Ki67 forte.
Figura 3. Meduloblastoma células expressam marcadores estabelecidos células-tronco neurais. SmoM2-YFP marcas células que expressam Smo constitutivamente ativa, portanto, atividade da via Shh. Todas as células das linhas celulares estabelecidas meduloblastoma expressa YFP, ea maioria deles co-expressa altos níveis de vários marcadores de células-tronco neurais, tais como nestina e Sox2. Curiosamente, quando realizamos YFP detecção de sinal com potência do laser mínima durante microscopia confocal, detectamos sinal YFP concentrados nos cílios das células Sox2 +. Esta observação é consistente com um relatório recente que 12 descreveu o papel essencial dos cílios no desenvolvimento de meduloblastoma via dependente de Shh.
Figura 4. Fundada células tumorais sofrer expansão clonal. Depois de dissociação em suspensão única célula, células tumorais foram semeadas em uma placa de 24 poços a uma densidade clonal de 300 células por ml de meio de cultura. Em cada poço observamos colônias clonalmente expandida. Esta série de imagens de campo claro demonstrar alterações típicas ao longo de um período de 10 dias da cultura.
Figura 5. Analisa a diferenciação de células meduloblastoma estabelecida. Quando as células tumorais foram trocados a partir de EGF / bFGF contendo soro livre de médio a DMEM/10% FBS, YFP + células tumorais alteraram significativamente a sua morfologia e diferenciada em vários tipos celulares, incLuding Tuj1 + ou + NeuN neurônios, células GFAP + + CNPase astroglial ou oligodendrócitos.
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Discussion
Descrevemos uma forma eficiente para isolar, enriquecer e manter as células-tronco do tecido meduloblastoma tumor primário recuperados de camundongos mutantes com constitutivamente ativa Hedgehog sinalização. Descobrimos que um passo crítico no sucesso estabelecer uma linha saudável tumor de células-tronco é o tratamento Accutase usado durante a dissociação do tecido do tumor primário. Em nossa experiência, quando o tecido do tumor primeiro dissociar do cerebelo, 4 minutos de tratamento Accutase 50% a 37 ° C, seguidos de 3 minutos de pipetagem repetitiva usando um Pipetman de 1 ml geralmente resultarão em semeadura primeiro sucesso. Também é importante esperar até considerável colônias são formadas antes de re-regulamentação (Figura 1). Após a semeadura em primeiro lugar, o tratamento Accutase não é mais necessário; pipetagem repetitiva por 3-4 minutos usando um Pipetman de 1 ml é suficiente para desalojar e dissociar aglomerados de células para re-plating. Não use Pipetman menor volume como o mais fino dicas irá danificar as células extensivamente. Uma linhagem celular pode ser gerado a partir de cada tecido do tumor isolado e estas células são altamente proliferativas, robustamente expressar vários marcadores de células-tronco neurais e podem se diferenciar em dois tipos de células neuronais e gliais. Temos realizado o transplante ortotópico dessas células em camundongos imuno-comprometidos destinatário que posteriormente desenvolveram meduloblastomas secundário. Estas células tumorais em cultura raramente exibido diferenciação espontânea ou apoptose, características que são comuns a métodos de cultura neurosphere. Este protocolo é projetado para a propagação bem sucedida de células-tronco derivadas de tumor primário meduloblastomas e, assim, nos permitirá testar os efeitos de genes candidatos e inibidores químicos em Hedgehog-driven crescimento de células tumorais e no comportamento.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado por concessões do Vanderbilt-Ingram Cancer Center de Suporte Grant (P30 CA068485), a Childhood Foundation tumor cerebral e os Institutos Nacionais de Saúde (NS042205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | 0.1% |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM |
| Primaria dishes | Fisher Scientific | 087724C | |
| Sox2 antibody | EMD Millipore | MAB4343 | Mouse, 1:1000 |
| Nestin antibody | DSHB | rat401 | Mouse, 1:200 |
| YFP antibody | Molecular Probes, Life Technologies | A11122 | Rabbit, 1:2000 |
| GFAP antibody | Neuromics | CH22102 | Chicken, 1:1000 |
| Tuj1 antibody | Sigma-Aldrich | T5076 | Mouse, 1:2000 |
| NeuN antibody | EMD Millipore | MAB377 | Mouse, 1:2000 |
| CNPase antibody | EMD Millipore | MAB326 | Mouse, 1:1000 |
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