Summary
يمكن أن تكون على غرار تأثير على وظيفة صلابة الطبقات التحتية الخلوية
Abstract
تصلب الأنسجة عاملا هاما في تحديد وظيفة الخلوية ، وترتبط عادة التغيرات في تصلب الأنسجة مع السرطان ، والتليف الرئوي وأمراض القلب والشرايين 11/01. نهج الخلية البيولوجية التقليدية لدراسة وظيفة الخلوية تنطوي على زراعة الخلايا التحتية الصلبة (الأطباق البلاستيك أو الزجاج coverslips) والتي لا يمكن حساب لتأثير وجود مرونة ECM أو الاختلافات في تصلب الأنسجة بين ECM. لنموذج في الجسم الحي شروط الامتثال الأنسجة في المختبر ، ونحن وآخرون استخدام ECM المغلفة الهلاميات المائية. في مختبرنا ، تستند على بولي أكريلاميد الهلاميات المائية التي يمكن أن تحاكي مجموعة من التوافق الأنسجة البيولوجية المشاهدة 12. يتم إنشاء "رد الفعل" زلات تغطية الحضانة مع هيدروكسيد الصوديوم التي تليها إضافة APTMS - 3. يستخدم غلوتارالدهيد العابرة للربط 3 APTMS وهلام بولي أكريلاميد. يستخدم محلول من مادة الأكريلاميد (ميلان) ، مكررا الأكريلاميد (BIS - AC) وبيرسلفات الأمونيوم للبلمرة من هيدروجيل. أدرج N - hydroxysuccinimide (NHS) في حل التيار المتردد لبروتين ECM تشعبي إلى هيدروجيل. بعد البلمرة لهيدروجيل ، وهي مغلفة سطح هلام مع البروتين ECM اختيار مثل فبرونيكتين الكولاجين ، vitronectin ، الخ.
ويمكن تحديد صلابة من هيدروجيل الريولوجيا أو بواسطة المجهر القوة الذرية (AFM) وتعديلها من خلال تغيير نسبة AC و / أو مكررا AC - 12 في الحل. بهذه الطريقة ، يمكن أن تكون مطابقة صلابة التحتية للتصلب الأنسجة البيولوجية التي يمكن أيضا أن يكون كميا أو باستخدام الريولوجيا فؤاد. ويمكن عندئذ أن تكون خلايا المصنف على هذه الهلاميات المائية وتربيتها على أساس الظروف التجريبية المطلوبة. تصوير الخلايا وشفائهم للتحليل الجزيئي واضح ومباشر. لهذه المقالة ، أن نحدد الطبقات التحتية لينة ومرنة وجود تلك moduli (E) <3000 باسكال والطبقات التحتية تيبس / مثل تلك الأنسجة مع E> 20000 باسكال.
Protocol
إعداد
- يجب تعقيمها Coverslips.
- وينبغي استخدام معقم أو منزوع الأيونات الماء المقطر لإعداد الحلول وcoverslips الغسيل.
- ميلان (40 ٪ W / V) ومكررا - AC (1 ٪ ث / ت) يتم تعقيم الحلول عن طريق الترشيح ميكرومتر 0.2. إعداد 10 ٪ بيرسلفات الأمونيوم (APS ؛ 100μg/ml المياه) قبل وقت قصير من استخدامها وتصفية العقيمة. حل محل وكالة الأنباء الجزائرية الشهرية.
- يتم الاحتفاظ الكواشف الكيماوية مثل APTMS - 3 ، الكلوروفورم ، glutaradehyde ، NHS ، وSurfaSil التي لا يمكن تعقيمها في زجاجة تعيين تستخدم فقط لإعداد الهلاميات المائية.
- للحصول على أفضل النتائج ، ينبغي استغلال الهلاميات المائية في غضون بضعة أيام بعد الحضانة بين عشية وضحاها مع البروتين ECM المناسبة.
- يعد حل SurfaSil 10 ٪ في الكلوروفورم (10 مل هو عادة ما يكفي لمدة 20 coverslips أعلى) في أنبوب 50 مل فالكون البولي بروبلين قبل صب هيدروجيل. (لدينا مختبر siliconizes عادة coverslips الأعلى خلال الخطوة غلوتارالدهيد حضانة 0.5 ٪). إضافة إلى أنبوب coverslips فالكون والصخور لا يقل عن 10 دقيقة. صب الحل SurfaSil والهواء الجاف على coverslips Kimwipes في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية حيث سيتم إعداد الهلاميات المائية.
- يعد حل جيش صرب البوسنة الحرارة المعطل على النحو التالي : المحتضنة قدرها 20 ملغ / مل من محلول حمض BSA الدهنية الحرة في برنامج تلفزيوني في 68 ° C حمام الماء لمدة 30 دقيقة. الحل هو معقم ثم تصفيتها وتخزينها في 4 درجة مئوية.
إجراء
- وضع طبقة من Parafilm على النصف السفلي من طبق بيتري 150 ملم.
- مكان ما يصل الى 25 ملم coverslips 9 على رأس Parafilm وغطاء لهم مع 1 مل من هيدروكسيد الصوديوم 0.1 M. احتضان لمدة 3 دقائق ثم نضح مع خط فراغ.
- العمل في هود الكيميائية ، ضع 0.5 مل 3 APTMS على كل ساترة. احتضان لمدة 3 دقائق ثم نضح وAPTMS. اذا كنت تنتظر طويلا ، وشكل رغوة.
- شطف coverslips مرة واحدة مع الماء منزوع الأيونات 20 مل في الطبق نفسه. إزالة coverslips من الطبق باستخدام الملقط المنحنية ونقلها ، مع من تعامل من جانب مواجهة ، وطبق 150 ملم جديدة. تغسل بماء منزوع الأيونات coverslips ثلاث مرات ، على الروك ، لمدة 10 دقيقة كل غسل. إذا لم تتمكن من إزالة كافة APTMS ، وسوف تتفاعل مع غلوتارالدهيد في الخطوة التالية وترك يعجل غائم الأبيض (الشكل 1).
- ذوبان الجليد في غلوتارالدهيد (~ 10 دقيقة قبل الاستخدام).
- باستخدام الملقط المنحني ، ونقل إلى coverslips طبق نظيف الطبقات مع Parafilm ونضح أي السائل المتبقية. استخدام خط فراغ أو لطخة Kimwipe المياه المتبقية حسب الحاجة.
- تغطية كل ساترة تماما مع 0.5 مل من غلوتارالدهيد 0.5 ٪ في الماء منزوع الأيونات معقمة واحتضان لمدة 30 دقيقة في غطاء الكيميائية. نضح في غلوتارالدهيد. شطف وغسل coverslips كما في الخطوة 4. تجفيف coverslips تماما. [يمكنك التوقف هنا وترك coverslips لعدة أسابيع في منطقة جافة].
- عندما تكون مستعدا لإعداد الهلاميات المائية ، واستخدام الملقط منحنية لنقل coverslips ، حتى رد الفعل الجانب ، إلى ورقة من Parafilm التي تم مسجلة على سطح مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. تأكد من أن يتم coverslips شقة على السطح Parafilm.
- يعد حل NHS المشبعة في التولوين. (ذوب كمية صغيرة من NHS في التولوين يكفي لتجربة معينة. NHS مضيفا أن تبقي شيئا فشيئا حتى لم يعد NHS يذوب ، والحل هو المشبعة عادة غائم والوردي).
- المقبل ، وإعداد مادة الأكريلاميد ، مكررا الأكريلاميد ، والمياه وكالة الأنباء الجزائرية للوصول الى نسبة الأكريلاميد المطلوب. إضافة الكواشف في أنابيب microcentrifuge كما هو مبين أدناه إلى إجمالي حجم 0.8ml.
- ثم ، واحد قسامة في وقت واحد ، إضافة إلى الخدمات الصحية الوطنية وTEMED الحل AC 0.8 لتر ، ودوامة لفترة وجيزة من أجل فورا باستخدام المواد الهلامية 3-5 في 140 ميكرولتر ساترة في غطاء السلامة البيولوجية. كلما كان ذلك ممكنا ، ينبغي أن يتم تنفيذ كل الخطوات من هذه النقطة في خزانة السلامة البيولوجية. [ملاحظة : يمكن استخدام coverslips مختلفة الحجم على أساس الحاجة. إذا تم استخدام 18 ملم coverslips ، استخدم 33 ~ AC حل لكل ميكرولتر ساترة و18 ملم ساترة siliconized أعلى.]
مكررا - AC (٪) 0.3 (تيبس) 0.15 0.06 0.03 (الناعمة) ميكرولتر ميكرولتر ميكرولتر ميكرولتر ماء 402 522 594 618 AC 150 150 150 150 مكررا - AC 240 120 48 24 وكالة الأنباء الجزائرية 8 8 8 8 TEMED 1 1 1 1 NHS 228 228 228 228 - المكان بسرعة siliconized 25 ملم ساترة على رأس كل جيل قبل أن تبدأ تتبلمر. وينبغي إضافة ساترة الأعلى السماح للميلان لتغطية تماما ساترة القاع. احتضان هذه "ساندويتش" في درجة حرارة الغرفة حتى AC polymerizes. (راجع الحل AC المتبقية في الأنبوب microcentrifuge البلمرة لتحديد متى حدث ، وعادة بضع دقائق عن المواد الهلامية وقاسية لفترة أطول قليلا عن تلك التي سوف يكفي لينة).
- اختيار بعناية الساندويتش (قفازات معقمة على!) والشريحة العليا ساترة قبالة حتى يتدلى الجل بلمرة. يمكنك نقب ثم تشغيله الجل. اذا كنت تنتظر طويلا قبل إزالة ساترة أعلى ، فإن جل شقا كما هو إزالة ساترة.
- تجاهل ساترة العلوي. مكان أسفل هلام coverslips (تسمى الآخرة هيدروجيل) في 6 لوحات جيدة مع PBS مل / 2 أيضا. يمكن إضافة برنامج تلفزيوني قبل أو بعد ساترة جل إلى كل بئر. يغسل مع الهلاميات المائية ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني ، على الروك ، 5 دقائق لكل يغسل.
- كرر الخطوات من 11-14 حتى تم إعداد العدد المطلوب من الهلاميات المائية.
- تغطية كل هيدروجيل مع 2 مل من محلول فبرونيكتين (3 ميكروغرام / مل في PBS) أو غيرها من البروتين ECM (انظر كلاين وآخرون. 13 للحصول على التفاصيل). البروتين ECM تصبح ملزمة تساهميا إلى هيدروجيل خلال الحضانة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- نضح الحل ECM والمتفاعل مع كتلة NHS 1mg/ml BSA الدهنية حمض الحرارة المعطل الحرة في المصل خالية من وسائل الإعلام لا يقل عن 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في خلية حاضنة الثقافة. شطف الهلاميات المائية مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني العقيمة أو خلية متوسطة الثقافة.
- لوحة الخلايا في مستنبت المناسبة التي تحتوي على FBS. وينبغي تحديد عدد الخلايا المصنفة على هيدروجيل من قبل المستخدم على أساس درجة انتشار الخلايا وconfluency اللازمة لإجراء التجارب. ما يقرب من 10 5 الخلايا عادة ما تكون كافية لتحليل الغربي النشاف وqPCR.
- بعد فترة حضانة المرض ، ويمكن استخراج البروتين الخلية أو مرنا. تتم إزالة بعناية coverslips من الآبار باستخدام الملقط المنحنية وضعت (الخلايا الجانب السلبي) على أعلى من 100 ميكرولتر من قطرات تحلل العازلة التي كانت متباعدة من (2 - 3cm) على طول ورقة Parafilm على مقاعد البدلاء المختبر. (ونحن نستخدم معيار العازلة عينة SDS وTRIzol ، على التوالي ، لإعداد العينات للالنشاف الغربية وعزل الحمض النووي الريبي لqPCR). احتضان الخلايا مع المخزن المؤقت للتحلل دقيقة واحدة بالضبط. إزالة coverslips ونقل إلى تحلل العازلة أنبوب microcentrifuge. بدلا من ذلك لاستخراج الحمض النووي الريبي فقط ، يمكن للمستخدم نقل كل لوحة هيدروجيل 6 بئر جديدة وإضافة 1ml جيدا / TRIzol. احتضان لمدة 3 دقائق وإزالة TRIzol حل للتخزين في أنبوب microcentrifuge.
معلومات إضافية بشأن الإجراءات مثل المناعي ، يوصف BrdU تلطيخ ، ترنسفكأيشن ، وما إلى ذلك لخلايا المصنف في الهلاميات المائية في كلاين وآخرون. 2007 13.
ممثل النتائج
الغسل الكامل للcoverslips التالية إضافة APTMS خطوة مهمة في إنتاج "رد الفعل" coverslips. إذا كان أحد فشل لإزالة APTMS تماما ، وسوف تتفاعل مع غلوتارالدهيد في الخطوة التالية ، وينتج راسب غائم الأبيض كما هو مبين في الشكل 1A. 1B الرقم يدل على ساترة غسلها وتجفيفها بشكل صحيح. إذا كان يعجل يطور ، يجب إعادة تشغيل الاجراء برمته من البداية حيث لم يعد ساترة صالحة للاستعمال.
بعد تشكيل وطلاء هيدروجيل مع بروتينات ECM بين عشية وضحاها ، يمكن خلايا المصنف في اليوم التالي. كما يظهر الشكل رقم 2 ، هناك فرق واضح بين انتشار الخلايا على الهلاميات المائية قاسية مقابل الناعمة. كما يمكن أن يرى من خلال تلطيخ phalloidin في الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs) ، والخلايا تنتشر إلى حد أكبر على شديدة بالمقارنة مع الهلاميات المائية لينة. في الواقع ، فإن معظم الخلايا ربط لينة تظل هيدروجيل المدمجة ونعلق أقل كفاءة.
اختبار على الرغم من أن يظهر ذلك فقط MEF التشكل في الشكل 2 ، والفرق في الخلية نشر متناسقة عبر عدة خطوط الخلايا الأخرى 11-12،14.
أسرار النجاح
- مرة واحدة يتم تشغيل هذا الإجراء ، فإنه من المهم جدا للحفاظ على coverslips مع الجانب "رد الفعل" صعودا ونأخذ في الاعتبار الجانب الذي تم المغلفة.
- يجب ارتداء القفازات في كل وقت أثناء إجراءات لتوفير بيئة العمل ومعقمة قدر الإمكان.
- يتم تنفيذ معظم الخطوات الأولية بين غطاء الدخان الكيميائية والمختبرات. وينبغي أن يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة لإزالة الزائدة من غلوتارالدهيد coverslips في إطار مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
- بسبب الاختلافات في الخلية spreaقرع (الشكل 2) ، نوصي بذر ضعف عدد الخلايا في الهلاميات المائية لينة بالمقارنة مع الهلاميات المائية شديدة.
- عملية البلمرة AC سريع للغاية. لأول مرة للمستخدمين ، يمكن للمرء أن تقلل من كمية وكالة الأنباء الجزائرية أو TEMED في الحل لإطالة عملية البلمرة. لا تحاول أن تعد أكثر من coverslips قليلة في وقت واحد.
- دراسات في دورة الخلية التي تتطلب التزامن في G0 ، ونحن عادة تجويع الخلايا المصل في أطباق بلاستيكية الثقافة ، يعرض للتريبسين الخلايا وreseed لهم على الهلاميات المائية المختلفة من التوافق في وجود mitogens (FBS و / أو عوامل النمو). هذا الإجراء يضمن أن السكان بدءا من خلايا متطابقة G0 متزامنة في جميع العينات. ومع ذلك ، بالنسبة للعديد من الدراسات نقل الإشارة ، قد حفز mitogen المطلوبة فترة لا تكون طويلة بما فيه الكفاية للسماح للمرفق وانتشار الخلايا. في هذه الحالة ، فإننا المصل تجويع الخلايا على والهلاميات المائية ومن ثم حفز مباشرة لهم mitogen.
الشكل 1A. وجرفت نحو غير لائق ساترة وبعد إضافة APTMS ، وغسلها ساترة لمدة 1-2 دقائق قبل إضافة محلول غلوتارالدهيد. راسب النماذج على ساترة التي لم يتم غسلها وفقا للخطوات المحددة في الإجراءات.
الشكل 1B. تم غسلها بشكل صحيح ساترة. بالإضافة إلى ذلك عقب APTMS ، وغسلها ساترة لثلاث مرات كل 10 دقائق قبل إضافة محلول غلوتارالدهيد. لا يعجل النماذج على ساترة.
الشكل 2. تأسست مورفولوجيا الخلايا على الهلاميات المائية متفاوتة الصلابة ، وقد المصنف MEFs على فبرونيكتين المغلفة الهلاميات المائية من صلابة عالية أو منخفضة لمدة 9 ساعات. بعد فترة حضانة المرض ، تم إصلاح الخلايا ، وpermeabilized ملطخة FITC - phalloidin الذي يربط أكتين - F. MEFs المواد الهلامية على صلابة عالية الألياف المعرض التوتر وتنتشر بشكل جيد بالمقارنة مع تلك المصنفة في الهلاميات المائية صلابة منخفضة. مقياس شريط = 50μm.
الشكل 3. وكان ممثل مطلي نتيجة PCR الكمي لمستويات cyclin الماوس مرنا D1. المصل تجويع الخلايا الليفية الماوس الجنينية على ارتفاع (3 ٪ الأكريلاميد) أو منخفضة الهلاميات المائية صلابة (0.3 ٪ الأكريلاميد) ، وحفز مع FBS 10 ٪ لمدة 9 ساعات. بعد استخراج الحمض النووي الريبي ، وكان أداؤها في الوقت الحقيقي تحليل PCR الكمي لمستويات مرنا cyclin D1 (الحمض النووي الريبي لتطبيع 18S). G0 يمثل cyclin D1 مرنا من خلايا هادئة. مستويات Cyclin مرنا D1 زيادة كبيرة في الهلاميات المائية شديدة ولكن ليس على الهلاميات المائية لينة. البيانات يعني + / -- SD من ردود الفعل PCR مكررة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وثمة عنصر حاسم في عملية البلمرة هيدروجيل لتجنب تشكيل فقاعة الهواء التي تسمح الخلايا لربط ساترة الزجاج بدلا من هيدروجيل ECM المغلفة نفسها. ويمكن منع ذلك عن طريق حل pipetting بعناية بعد البلمرة vortexing البصر ، وجعل على يقين من أي فقاعات هواء أصبحت المحاصرين في هلام. كنا دائما ننصح إعداد "رد الفعل" إضافية coverslips والهلاميات المائية لضمان وجود ما يكفي للتجريب.
وينبغي إيلاء اهتمام خاص كلما غسل المواد الهلامية مع برنامج تلفزيوني. يجب أن تكون عملية شفط تجنب الاتصال الوثيق مع هيدروجيل نفسها قد ننشغل بها وتمزقها. الطريق الأسلم لنضح السائل دون إقلاق الهلاميات المائية هو تلميح لوحة في حين المص.
ومن الصعب الحصول على مستوى الهلاميات المائية بشكل كامل ، والاختلافات في سمك هيدروجيل المجهرية يمكن أن يؤدي إلى الأسطح غير المستوية التي تجعل من الصعب التركيز طوال الصور مجال الرؤية. يمكن للمرء أن التركيز على مناطق صغيرة نسبيا ، ونجد أن هذا النهج هو كاف لعكس معظم التطبيقات epifluorescence المرحلة وكما هو مبين في الشكل. 2. وتصبح المشكلة أكثر حدة كما يزيد التكبير ، بحيث يتم تحليل أفضل التحليلات ذات الدقة العالية مثل توطين المشترك للشرائح الضوئية والبروتينات من المجاهر مبائر. يتم إجراء الفحص المجهري متحد البؤر باستخدام الاجراءات القياسية ، ولكن هيدروجيل قد تحتاج إلى الصعود إلى مقلوب ساترة بدلا من شريحة من أجل استيعاب المسافة من الأهداف في العمل المجهر an مبائر مقلوب.
في هذا النظام هلام بولي أكريلاميد المختبر قادر على النمذجة الفسيولوجية المختلفة صلابة ECM شروطه. ECM الامتثال يتفاوت بين الأنسجة الطبيعية ، وأيضا تم الكشف عن التغيرات في صلابة مرضي. على هذا النحو ، يمكن لهذا النظام هيدروجيل تكون ذات قيمة في الفحص المختبري للتحقيق في كيفية تأثير التغيرات في صلابة ECM تؤثر على تطور المرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
العمل هو معتمد مختبرنا من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde, 70% | Sigma-Aldrich | G7776 | Store at -20°C |
| 3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%) | Sigma-Aldrich | 281778 | Store at room temperature |
| SurfaSil Siliconizing Fluid | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 42800 | Store at room temperature |
| NHS (N-hydroxysucinimide Ester) | Sigma-Aldrich | A-8060 | Store at 4°C Replace monthly |
| Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003-100G | Store at 4°C |
| Coverslips (25mm) | Fisher Scientific | 12-545-86 25 Cir 1D | |
| Coverslips (18mm) | Fisher Scientific | 12-545-84 18 Cir 1D |
References
- Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta. J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).
- Bernini, G. Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibrosis in patients with primary aldosteronism. J Hypertens. 26, 2399-2405 (2008).
- Boonyasirinant, T. Aortic stiffness is increased in hypertrophic cardiomyopathy with myocardial fibrosis: novel insights in vascular function from magnetic resonance imaging. J Am Coll Cardiol. 54, 255-2562 (2009).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Duprez, D. A., Cohn, J. N. Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).
- Lee, R. T. Prediction of mechanical properties of human atherosclerotic tissue by high-frequency intravascular ultrasound imaging. An in vitro study. Arterioscler Thromb. 12, 1-5 (1992).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples. Phys Med Biol. 52, 1565-1576 (2007).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad Sci USA. 94, 13661-13665 (1997).
- Klein, E. A., Yung, Y., Castagnino, P., Kothapalli, D., Assoian, R. K. Cell adhesion, cellular tension, and cell cycle control. Methods Enzymol. 426, 155-175 (2007).
- Klein, E. A. Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening. Current Biology. 19, 1511-1518 (2009).
