Summary
세포 기능에 substrata의 강성의 효과는 모델 수
Abstract
조직 강성은 세포 기능의 중요한 결정자이며, 조직 강성의 변화는 일반적으로 섬유증, 암 및 심장 혈관 질환 1-11와 관련된 있습니다. 세포 기능을 공부하기 위해 전통적인 세포 생물 학적 접근은 탄성 ECM 또는 조직 사이의 ECM의 강성의 변화의 영향에 대해 설명할 수없는 단단한 하층에 culturing 세포를 (플라스틱 요리 또는 유리 coverslips) 포함. 체외에서 생체내 조직 준수 조건 모델에, 우리와 다른 ECM - 코팅 hydrogels을 사용합니다. 우리 연구실에서 hydrogels는 생물학 12 본 조직 compliances의 범위를 모방 수 polyacrylamide를 기반으로합니다. "반응"커버 전표는 3 APTMS의 또한 다음 NaOH와 인큐베이션에 의해 생성됩니다. 글루 타 알데히드는 3 APTMS와 polyacrylamide 젤을 상호 연결하는 데 사용됩니다. 아크릴 아미드 (AC), 비스 - 아크릴 아미드 (BIS - AC)과 암모늄 persulfate의 솔루션은 히드로겔의 중합에 사용됩니다. N - hydroxysuccinimide (NHS)이 히드로겔에 crosslink ECM 단백질에 AC 솔루션에 통합됩니다. 히드로겔의 중합에 따라, 겔 표면은 같은 fibronectin, vitronectin, 콜라겐 등 선택의 ECM 단백질로 코팅되어
히드로겔의 강성은 레올로지 또는 원자 힘 현미경 (AFM)에 의해 결정 및 솔루션 12 AC 및 / 또는 BIS - AC의 비율을 변화하여 조정할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 하층의 강성도 레올로지 또는 AFM을 사용하여 계량 수있는 생물 학적 조직의 강성 일치될 수 있습니다. 세포 그런 다음 필요한 실험 조건에 따라 이러한 hydrogels과 교양에 씨앗을하실 수 있습니다. 분자 분석을위한 세포 및 복구의 영상은 간단합니다. 이 기사에 대한, 우리는 20,000 파스칼 <E 분들로 3000 파스칼과 치열한 substrata / 조직> 탄성 moduli (E)를 가지고 그 같은 부드러운 substrata을 정의합니다.
Protocol
준비
- Coverslips는 autoclaved해야합니다.
- 멸균 증류수 또는 탈이온수는 솔루션을 준비하고 세탁 coverslips를 위해서 사용해야합니다.
- AC (40 % W / V) 및 BIS - AC (1 % W / V)이 솔루션은 0.2 μm의 여과 소독을하고 있습니다. 빠른 시일 내에 사용하고 살균 필터를하기 전에, 10 % 암모늄 persulfate (100μg/ml 물을 APS)를 준비합니다. APS 솔루션은 매월 바꿉니다.
- autoclaved 수없는 등 3 APTMS, 클로로포름, glutaradehyde, NHS, 그리고 SurfaSil 같은 화학 시약은 hydrogels의 준비를 위해서만 사용되는 할당 병에 보관하고 있습니다.
- 최상의 결과를 얻으려면, hydrogels는 해당 ECM 단백질과 함께 하룻밤 배양 후 며칠 이내에 이용해야합니다.
- 히드로겔의 따르는 이전 50 ML 폴리 프로필렌 팰컨 튜브 클로로포름 (10 ML은 보통 정도로 20 위로 coverslips입니다)의 10 % SurfaSil 솔루션을 준비합니다. (저희 연구실은 보통 0.5 % 글루 타 알데히드 인큐베이션 단계에서 상단 coverslips을 siliconizes). 최소한 10 분 팔콘 튜브와 바위에 coverslips을 추가합니다. SurfaSil 솔루션을 가만히 따르다하고 공기는 hydrogels가 준비되는 생물 학적 안전 캐비닛에 Kimwipes에 coverslips을 건조.
- 다음과 같이 열 - inactivated BSA 솔루션을 준비 : PBS의 지방산 - 초산 무료 BSA의 20 MG / ML 솔루션은 30 분 68 ° C 물 목욕에 incubated입니다. 이 솔루션은 다음 멸균 4 ° C.에 여과 및 저장
절차
- 150 mm 배양 접시의 절반 아랫부분에 Parafilm의 레이어를 놓습니다.
- Parafilm 위에 9 25 mm coverslips까지 플레이스 1 ML 0.1 M NaOH으로 그들을 커버. 진공 라인 대기음 후 3 분 부화합니다.
- 각 coverslip에 화학 후드, 장소 0.5 ML 3 APTMS에서 근무. 3 분위한 부화 후 APTMS를 대기음. 당신이 너무 오래 기다려야하는 경우, 거품이 형성됩니다.
- 같은 접시 20 ML 탈이온수로 번 coverslips을 씻어. 곡선 집게를 사용하여 요리의 coverslips를 제거하고 자신이 대접 측 새로운 150 mm 요리로, 최대 직면와 함께 그들을 전송합니다. 10 분 각 세척 들어, 로커에 탈이온수 세 번있는 coverslips 씻으십시오. 여러분 모두 APTMS을 제거하지 않으면, 그것은 다음 단계에서 글루 타 알데히드와 반응하여 흰색 침전 클라 우디 (그림 1)을 벗어나게됩니다.
- 글루 타 알데히드를 (사용하기 전에 ~ 10 분) 해동.
- 곡선 포셉 사용 Parafilm와 겹쳐 깨끗한 접시에 coverslips를 전송하고 나머지 액체를 대기음. 필요에 따라 나머지 물을 얼룩에 진공 라인이나 Kimwipe을 사용합니다.
- 무균 탈이온수의 0.5 % 글루 타 알데히드 0.5 ML로 완전히 각 coverslip을 커버 및 화학 후드에서 30 분 알을 품다. 글루 타 알데히드를 대기음. 린스와 4 단계에서로 coverslips 씻으십시오. 완전히 coverslips 건조. [당신은 건조한 지역의 중지하고 몇 주 동안 coverslips을 남길 수 있습니다].
- 당신이 hydrogels를 준비 준비가되면, 생물 안전 캐비닛의 표면에 녹화되어 Parafilm의 시트에 coverslips, 반응 측면까지를 전송 곡선 집게를 사용합니다. coverslips이 Parafilm 표면에 평평하게되었는지 확인합니다.
- 톨루엔의 포화 NHS 솔루션을 준비합니다. (특정 실험에 대한 충분한 톨루엔의 NHS의 작은 금액을 디졸브. NHS가 더 이상 해소하지 않을 때까지 비트에 의해 NHS 비트를 추가하는 유지. 포화 솔루션은 일반적으로 흐리고과 분홍색입니다.)
- 다음, 원하는 아크릴 아미드 비율에 도달하는 아크릴 아미드, 비스 - 아크릴 아미드, 물, APS를 준비합니다. 로 0.8ml의 총 볼륨으로 아래에 설명된 microcentrifuge 튜브의 시약을 추가합니다.
- 그런 다음 한 번에 하나 나누어지는가 NHS를 추가하고 0.8 ML AC 솔루션 TEMED, 소용돌이 간략 즉시 생물 학적 안전 모자 coverslip 당 140 μl를 사용하여 3-5 젤 잔. 가능하다면,이 시점에서 모든 단계는 생물 학적 안전 캐비넷에서 수행되어야합니다. [주 : 서로 다른 크기 coverslips는 필요에 따라 이용하실 수 있습니다. 18 mm coverslips를 사용하는 경우, ~ 33 coverslip 당 μl AC 솔루션과 18 mm 최고 siliconized coverslip을 사용합니다.]
BIS - AC (%) 0.3 (딱딱한) 0.15 0.06 0.03 (소프트) μl μl μl μl 물 402 522 594 618 AC 150 150 150 150 비스 - AC 240 120 48 24 APS 8 8 8 8 TEMED 1 1 1 1 NHS 228 228 228 228 - 이 중합을 시작하기 전에 신속하게 각 젤 위에 siliconized 25 mm coverslip을 놓으십시오. 상단 coverslip의 추가는 AC 완전히 바닥 coverslip을 충당하기 위해 허용해야합니다. AC가 polymerizes 때까지 실온에서이 "샌드위치"를 품어. (중합이 발생했을 때 결정하는 microcentrifuge 관의 잔류 AC 솔루션을 확인하십시오. 보통 몇 성실히 젤류 분 동안 부드러운 사람을위한 이상 약간 충분이..)
- 조심스럽게 샌드위치를 픽업 (에 멸균 장갑!)하고 overhangs polymerized 젤 때까지 최고 coverslip을 슬라이드. 그런 다음 젤 그것을 캐내다 수 있습니다. 당신이 최고 coverslip을 제거하기 전에 너무 오래 기다리지는 경우 coverslip가 제거로 젤이 찢어 것입니다.
- 상단 coverslip 폐기하십시오. 물론이 ML PBS /와 함께 6 - 잘 접시에 바닥 젤 - coverslips을 (이하 히드로겔라고도 함) 놓습니다. PBS는 각 잘 수있는 젤 - coverslip 앞 또는 뒤에 추가할 수 있습니다. 로커, 세차 당 5 분에 PBS로 세 번 hydrogels 씻으십시오.
- hydrogels의 필요한 번호가 준비 때까지 반복 11-14 단계를 반복합니다.
- fibronectin 용액 (PBS 3 μg / ML) 또는 기타 ECM 단백질 (클라인 외를 참조하십시오. 자세한 내용은 13.) 2 ML 각 히드로겔 표지. ECM 단백질은 covalently 4 ° C.에서 하룻밤 배양 동안 히드로겔에 바인딩됩니다
- 37 최소한 30 분 ECM 솔루션과 혈청이없는 미디어 1mg/ml 열 inactivated 지방산 - 초산 무료 BSA와 블록 unreacted NHS를 대기음 ° C 세포 문화 인큐베이터 인치 멸균 PBS 또는 세포 배양 매체로 한 번 hydrogels을 씻어.
- FBS를 포함하는 적절한 문화 매체 플레이트 세포. 히드로겔에 씨앗을 품고 세포의 숫자는 셀 실험에 필요한 확산과 confluency의 정도에 따라 사용자에 의해 결정되어야합니다. 약 10 5 세포는 일반적으로 모래 바닥 서양 qPCR 분석을 위해 충분합니다.
- 잠복기에 따라, 세포의 단백질이나 mRNA가 추출 수 있습니다. coverslips 신중하게 곡선 집게를 사용하여 우물에서 제거하고 실험실 벤치에서 Parafilm의 시트 따라 (2~3cm) 밖으로 간격되었습니다 용해 완충액 100 μl 방울 위에 (세포 쪽 아래) 위치하고 있습니다. (우리는 서쪽 모래 바닥에 대한 샘플을 준비하고 qPCR에 대한 RNA를 분리하고, 각각 표준 SDS 샘플 버퍼와 TRIzol를 사용합니다.) 정확히 하나 분간 용해 완충액으로 세포를 품어. coverslips를 제거하고 microcentrifuge 관에 용해 버퍼를 전송할 수 있습니다. 또는 전용 RNA 추출을 위해, 사용자는 새로운 6 자 판 각 히드로겔를 전송하고 TRIzol / 음의 1ml를 추가할 수 있습니다. 3 분 부화하고 microcentrifuge 관에 저장 TRIzol 솔루션을 제거합니다.
같은 immunofluorescence 같은 절차에 대한 자세한 내용은 hydrogels의 씨앗 세포 BrdU의 얼룩, transfection 등 클라인 외에 설명되어 있습니다. 2007 13.
대표 결과
APTMS의 또한 다음과 같은 coverslips 철저히 세척은 "반응"coverslips 생산에 중요한 단계입니다. 하나는 완전히 APTMS를 제거하지 못하면, 그것은 다음 단계에서 글루 타 알데히드와 반응하여 그림 1A에서 볼 흰색 클라 우디 침전물을 생산합니다. 그림 1B는 제대로 씻어 말린 coverslip을 보여줍니다. 침전물이 개발하는 경우 coverslip가 더 이상 유용한없는 것처럼, 모든 절차는 처음부터 다시 시작해야합니다.
하룻밤 ECM 단백질과 히드로겔 형성과 코팅에 따라, 세포는 다음날 씨앗 수 있습니다. 그림 2 보여줍로서, 뻣뻣한 비해 부드러운 hydrogels에 확산 세포 사이에 뚜렷한 차이가있다. 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)에 phalloidin의 얼룩에서 볼 수 있듯이 소프트 hydrogels에 비해, 전지는 뻣뻣한에 큰 정도로 확산. 사실, 부드러운 히드로겔에 부착 대부분의 전지는 소형 유지하고 덜 효율적으로 연결합니다.
단 MEF의 형태는 그림 2에 표시된 있지만, 세포 확산의 차이가 다른 여러 세포 라인에 걸쳐 일관가 11-12,14을 테스트했습니다.
성공의 비밀
- 절차가 시작되면, 그것은 "반응"면을 coverslips를 유지하고 코팅되어있는 면을 염두에 두어야하는 것은 매우 중요합니다.
- 장갑은 가능한 한 무균되는 작업 환경을 제공하기 위해 절차를 수행하는 동안 모든 시간에 착용한다.
- 초기 단계의 대부분은 화학 퓸 후드 및 실험실 벤치 사이에 수행됩니다. coverslips에서 여분의 글루 타 알데히드를 제거하기 위해 이후 모든 단계는 생물 학적 안전 캐비닛에 따라 실행해야합니다.
- 세포 sprea의 차이로 인해뻣뻣한 hydrogels에 비해 땡 (그림 2), 우리는 부드러운 hydrogels에 대한 세포의 두 수를을 심는 것이 좋습니다.
- 교류 중합 과정은 매우 빠르다. 처음 사용자의 경우, 하나는 APS의 양을 줄일 수 또는 중합 과정을 연장하는 솔루션 TEMED. 한 번에 몇 coverslips 이상을 준비하려고하지 마십시오.
- G0에서 동기화가 필요한 세포주기 연구에서 우리는 일반적으로 플라스틱 문화 요리 세포를 혈청 - 굶어 세포를 trypsinize하고 mitogens의 존재 (FBS 및 / 또는 성장 요소) 다른 compliances의 hydrogels 그들을 reseed. 이 절차는 G0 - 동기 세포의 시작 인구가 모든 샘플에서 동일 보장합니다. 그러나 많은 신호 전달 연구를 위해, 필요한 mitogen 자극의 기간은 첨부 파일 및 세포의 확산을위한 충분한 길이되지 않을 수 있습니다. 이 경우에, 우리는 hydrogels에있는 세포를 혈청 - 굶어 후 직접 mitogen으로 그들을 자극.
그림 1A. 부적절 coverslip을 빨기도 했죠. APTMS의 또한 다음, coverslip는 글루 타 알데히드 솔루션뿐만 아니라 전 1~2분에 대한 졌죠. 침전물이 절차에 설명된 단계에 따라 씻어되지 않은 coverslip을 형성한다.
그림 1B. 적절히 coverslip 세탁. APTMS의 다음 또한이 coverslip는 글루 타 알데히드 솔루션뿐만 아니라 전 세 번 십분마다 세탁했습니다. 아무도 침전은 coverslip에 형성하지 않습니다.
그림 2. 강성 변화.의 hydrogels에 대한 세포의 형태 MEFs가 9시간에 대한 높거나 낮은 강성의 fibronectin - 코팅 hydrogels에 씨앗을 품고 있었다 설립. 잠복기에 따라, 세포는 고정 permeabilized 및 F - 굴지에 바인딩 FITC - phalloidin 물들일되었습니다. 높은 강성 젤에 MEFs 낮은 강성 hydrogels에 씨뿌린 사람에 비해 스트레스 섬유를 전시하고 잘 확산됩니다. 스케일 바 = 50μm.
그림 3. 마우스 cyclin의 D1의 mRNA 수준의 대표 양적 PCR 결과. 세럼 굶주린 생쥐 배아 섬유아 세포가 높은 (3 % 아크릴 아미드) 또는 낮은 (0.3 % 아크릴 아미드) 강성 hydrogels에 도금 9 시간 10 % FBS와 자극했다. RNA 추출 다음, 실시간 정량 PCR 분석은 cyclin D1의 mRNA의 수준 (18S RNA에 정규화)을 수행했습니다. G0가 정지 세포에서 cyclin D1의의 mRNA를 나타냅니다. Cyclin D1의 mRNA의 수준이 뻣뻣한 hydrogels에 아니지만 부드러운 hydrogels을 크게 향상시킬 수 있습니다. SD 중복 PCR 반응의 - 데이터 + /을 의미합니다.
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Discussion
히드로겔 중합 과정의 중요한 요소는 세포가 아니라 ECM - 코팅 히드로겔 자체보다 유리 coverslip에 바인딩 수 있도록 공기 방울 형성을 방지하는 것입니다. 이것은 vortexing 시각도 기포가 젤에 갇혀가 없습니다 중일 후 신중하게 중합 솔루션을 pipetting하여 예방할 수 있습니다. 우리는 항상 실험에 대한 충분한 발생시키기 위해 추가 "반응"coverslips 및 hydrogels을 준비하는 것이 좋습니다.
젤은 PBS로 씻은 때마다 특별한 관심을 지불하여야한다. 흡입 프로세스가 잡아서 찢어진 수 있으므로 히드로겔 자체와 긴밀한 접촉을 피해야합니다. perturbing hydrogels없이 액체를 대기음하는 가장 안전한 방법은 suctioning 동안 접시는 힌트를주고있다.
그것은 완전히 수준 hydrogels를 얻는 열심히하고, 히드로겔 두께의 미세한 차이가 힘들보기의 필드를 통해 이미지를 집중할 수 있도록하기 고르지 표면이 발생할 수 있습니다. 하나는 상대적으로 작은 영역에 집중할 수 있으며, 우리는이 접근법이 대부분의 위상 콘트라스트와 같은 그림에 표시된 epifluorescence 어플 리케이션을위한 충분한 것을 알게됩니다. 2. 문제가 배율이 증가할수록 더 심한가되고, 이러한 단백질의 공동 지방화로 고해상도 분석이 가장 공촛점 현미경에서 광학 조각으로 분석되도록. 공촛점 현미경은 표준 절차를 사용하여 수행되지만 히드로겔은 거꾸로 공촛점 현미경의 목표의 작동 거리를 수용하기 위해 coverslip보다는 슬라이드에 반전해야 할 수 있습니다.
시험 관내 polyacrylamide 젤 시스템이 서로 다른 생리 ECM의 강성 조건을 모델링이 가능합니다. ECM 준수 정상 조직 사이에 다양하고, 강성의 변화는 또한 병적 감지됩니다. 따라서,이 히드로겔 시스템은 ECM의 강성의 변화는 질병의 진행에 미치는 영향 조사에 대한 시험 관내 분석에 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
작업은 저희 연구실은 국립 보건원에서 기금 지원입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde, 70% | Sigma-Aldrich | G7776 | Store at -20°C |
| 3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%) | Sigma-Aldrich | 281778 | Store at room temperature |
| SurfaSil Siliconizing Fluid | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 42800 | Store at room temperature |
| NHS (N-hydroxysucinimide Ester) | Sigma-Aldrich | A-8060 | Store at 4°C Replace monthly |
| Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003-100G | Store at 4°C |
| Coverslips (25mm) | Fisher Scientific | 12-545-86 25 Cir 1D | |
| Coverslips (18mm) | Fisher Scientific | 12-545-84 18 Cir 1D |
References
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