Summary
Effekten av substrat stelhet på cellulär funktion kan modelleras
Abstract
Tissue styvhet är en viktig faktor för cellulär funktion, och förändringar i vävnaden styvhet är vanligen associerat med fibros, cancer och hjärt-kärlsjukdom 1-11. Traditionella cellbiologiska metoder för att studera cellfunktioner innebär odling celler på ett styvt underlag (plastskålar eller täckglas glas) som inte kan kompensera för inverkan av en elastisk ECM eller variationer i ECM styvhet mellan vävnader. Att modellera in vivo-förhållanden vävnad efterlevnad in vitro, vi och andra använder ECM-belagda hydrogel. I vårt laboratorium, är hydrogeler baseras på polyakrylamid som kan härma olika vävnader efterlevnad sett biologiskt 12. "Reaktiv" täckglas genereras genom inkubering med NaOH följt av tillägg av 3-APTMS. Glutaraldehyd används för att länka till 3-APTMS och polyakrylamidgel. En lösning av akrylamid (AC), bis-akrylamid (Bis-AC) och ammonium persulfate används för polymerisation av hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) har införlivats med AC lösningen Crosslink ECM protein till hydrogel. Efter polymerisation av hydrogel är gelen ytan belagd med en ECM protein val som fibronektin, vitronektin, kollagen, etc.
Styvheten i en hydrogel kan fastställas genom reologi eller atomkraftsmikroskopi (AFM) och justeras genom att variera andelen AC och / eller bis-AC i lösningen 12. På detta sätt kan underlaget stelhet anpassas till styvheten i biologisk vävnad som också kan kvantifieras med hjälp av reologi och AFM. Celler kan sedan seedade på dessa hydrogeler och odlade baserat på krävs experimentella förhållanden. Avbildning av celler och deras återhämtning för molekylär analys är enkel. För den här artikeln definierar vi mjuka substrat som de som har elastiska böjmotståndet (E) <3000 Pascal och styva substrat / vävnader som de med E> 20.000 Pascal.
Protocol
Förberedelser
- Täckglas skall autoklaveras.
- Sterilt destillerat eller avjoniserat vatten bör användas för att förbereda lösningar och för tvätt täckglas.
- AC (40% w / v) och bis-AC (1% w / v) lösningar är steriliserade med 0,2 ìm filtrering. Förbered 10% ammonium persulfate (APS, 100μg/ml vatten) strax före användning och sterila filter. Byt APS lösning månad.
- Kemiska reagenser som 3-APTMS, kloroform, glutaradehyde, NHS, och SurfaSil som inte kan autoklaveras hålls i en tilldelad flaska används enbart för tillverkning av hydrogel.
- För bästa resultat bör hydrogeler utnyttjas inom ett par dagar efter den natten inkubation med rätt ECM protein.
- Förbered en 10% SurfaSil lösning i kloroform (10 ml brukar räcka för 20 topp täckglas) i en 50 ml polypropylen Falcon röret före upphällningen hydrogel. (Vårt labb brukar siliconizes toppen täckglasen under 0,5% glutaraldehyd inkuberingssteget). Lägg till täckglasen till Falcon röret och rock i minst 10 min. Dekantera den SurfaSil lösningen och luft torka täckglas på Kimwipes i den biologiska säkerhetsskåp där hydrogeler kommer att utarbetas.
- Förbered värmeinaktiveras BSA-lösning som följer: en 20 mg / ml lösning av fettsyror fri BSA i PBS inkuberas i 68 ° C vattenbad i 30 min. Lösningen är då sterilt filtreras och lagras vid 4 ° C.
Förfarande
- Lägg ett lager Parafilm på den nedre halvan av en 150-mm petriskål.
- Placera upp till nio 25 mm täckglas ovanpå Parafilm och täck dem med 1 ml 0,1 M NaOH. Inkubera i 3 min och sedan aspirera med ett vakuum linje.
- Att arbeta i en kemisk huva, placera 0,5 ml 3-APTMS på varje täckglas. Inkubera i 3 min och sedan aspirera APTMS. Om du väntar för länge, kommer en skum form.
- Skölj täckglasen gång med 20 ml avjoniserat vatten i samma skål. Ta bort täckglasen från skålen med hjälp av böjda pincett och överföra dem, med deras behandlade uppåt, till en ny 150-mm skålen. Tvätta täckglas med avjoniserat vatten tre gånger, på rocker, i 10 min varje tvätt. Om du misslyckas med att ta bort alla APTMS, kommer det att reagera med glutaraldehyd i nästa steg och lämnar en vit grumlig fällning (Figur 1).
- Tina glutaraldehyd (~ 10 min innan användning).
- Använda böjd pincett, överföra täckglasen till en ren skål lager med Parafilm och aspirera resterande vätska. Använd en dammsugare linje eller Kimwipe att utplåna de resterande vatten om det behövs.
- Täck varje täckglas helt med 0,5 ml 0,5% glutaraldehyd i sterilt avjoniserat vatten och inkubera i 30 min i en kemisk huva. Aspirera glutaraldehyd. Skölj och tvätta täckglas som i steg 4. Torka täckglasen helt. [Du kan stanna här och lämna täckglas i flera veckor i ett torrt område].
- När du är redo att förbereda hydrogeler använder böjd pincett för att överföra täckglas, reaktiv uppåt, till ett ark med Parafilm som har tejpade på ytan av den biologiska säkerhetsskåp. Se till att täckglas är platt på Parafilm ytan.
- Förbered en mättad NHS lösning i toluen. (Lös upp en liten mängd av NHS i tillräckligt toluen för experimentet. Fortsätt att tillsätta NHS bit för bit tills NHS inte längre löser sig. Den mättade lösningen är oftast klart och rosa.)
- Därefter förbereda akrylamid, bis-akrylamid, vatten och APS för att nå önskad akrylamid procent. Tillsätt reagens i mikrocentrifugrör som beskrivs nedan för en total volym på 0.8ml.
- Sedan en alikvot i taget, tillsätt NHS och TEMED till 0,8 ml AC lösning, vortex kort stund och häll 3-5 geler med 140 l per täckglas i det biologiska skyddshuv. Om möjligt bör alla steg från denna punkt skall utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp. [OBS: olika storlek täckglas kan utnyttjas baseras på behov. Om 18-mm täckglas ska man använda ~ 33 l AC lösning per täckglas och en 18-mm topp silikoniserad täckglas.]
Bis-AC (%) 0,3 (hård) 0,15 0,06 0,03 (mjuk) l l l l Vatten 402 522 594 618 AC 150 150 150 150 Bis-AC 240 120 48 24 APS 8 8 8 8 TEMED 1 1 1 1 NHS 228 228 228 228 - Snabbt placera silikoniserade 25 mm täckglas ovanpå varje gel innan det börjar att polymerisera. Tillägg av toppen täckglas bör tillåta AC att helt täcka botten täckglas. Inkubera denna "sandwich" i rumstemperatur tills AC polymerizes. (Kontrollera den återstående AC lösning i mikrocentrifugrör att avgöra när polymerisation har inträffat. Vanligen några minuter för fasta geler och lite längre för mjuka och kära räcker.).
- Försiktigt plocka upp smörgåsen (sterila handskar på!) Och dra bort den övre täckglas tills det skjuter ut polymeriserade gelen. Du kan sedan bända bort gelen. Om du väntar för länge innan du tar bort den övre täckglas kommer gelen slita som täckglaset tas bort.
- Kasta upp täckglas. Placera den nedre gel-täckglas (nedan kallad hydrogel) i 6-brunnars plattor med 2 ml PBS / brunn. PBS kan läggas till före eller efter gel-täckglas i varje brunn. Tvätta hydrogeler med PBS tre gånger, på en rocker, 5 min per tvätt.
- Upprepa steg 11-14 tills det önskade antalet hydrogeler har upprättats.
- Täck varje hydrogel med 2 ml av en fibronektin lösning (3 mikrogram / ml i PBS) eller andra ECM-proteiner (se Klein et al. 13 för mer information.). ECM-proteinet blir kovalent bundna till hydrogelen under natten inkubation vid 4 ° C.
- Aspirera ECM-lösningen och blockera oreagerade NHS med 1mg/ml värmeinaktiveras fettsyror fri BSA i serum-fri media i minst 30 minuter vid 37 ° C i en cellkultur inkubator. Skölj hydrogeler gång med steril PBS eller cellodling medium.
- Plate celler i lämpliga odlingsmedium som innehåller FBS. Antalet celler seedade på hydrogelen bör fastställas av användaren baserade på graden av cell spridning och confluency krävs för experiment. Cirka 10 5 celler är vanligtvis tillräckligt för Western blotting och qPCR analys.
- Efter inkubationstiden kan cellprotein eller mRNA utvinnas. Den täckglas avlägsnas omsorgsfullt från brunnarna med hjälp av böjda pincett och placeras (cell-nedåt) ovanpå 100 l droppar av lyseringsbuffert som har placerade (2-3cm) längs en ark Parafilm på lab bänk. (Vi använder standard SDS prov buffert och TRIzol respektive att förbereda prover för Western blotting och att isolera RNA för qPCR.) Inkubera cellerna med lyseringsbuffert under exakt en minut. Ta bort täckglasen och överföra lyseringsbuffert till en mikrocentrifugrör. Alternativt för RNA-extraktion bara kan användaren överföra varje hydrogel till en ny 6-brunnar och tillsätt 1 ml TRIzol / brunn. Inkubera 3 minuter och ta bort TRIzol lösning för lagring i ett mikrocentrifugrör.
Ytterligare information om förfaranden som immunofluorescens är BrdU färgning, transfektion, osv för celler seedade på hydrogeler beskrivs i Klein et al. 2007 13.
Representativa resultat
Noggrann tvättning av täckglas följande tillägg av APTMS är ett viktigt steg i att producera "reaktiva" täckglas. Om man misslyckas med att ta bort APTMS helt, kommer det att reagera med glutaraldehyd i följande steg och ger en vit grumlig fällning som visas i Figur 1A. Figur 1B visar en väl tvättas och torkas täckglas. Om fällningen utvecklas måste hela proceduren startas om från början eftersom täckglas inte längre användbar.
Efter hydrogel bildning och beläggning med ECM-proteiner över natten, kan cellerna seedas följande dag. Som Figur 2 visar finns det en tydlig skillnad mellan cell spridning på hård kontra mjuk hydrogel. Som kan ses av phalloidin färgning i möss embryonala fibroblaster (MEFs), celler sprids i större utsträckning på styva jämfört med mjuka hydrogel. I själva verket kommer de flesta celler som är förenade med en mjuk hydrogel förblir kompakt och fäster mindre effektivt.
Även om endast MEF morfologi visas i figur 2, är skillnaden i cell sprids konsekvent mellan flera andra cellinjer testades 11-12,14.
Hemligheter till framgång
- När förfarandet är igång, är det mycket viktigt att hålla täckglasen med "reaktiva" sidan upp och tänka på vilken sida har varit belagda.
- Handskar ska användas vid alla tidpunkter under förfarandet för att ge en arbetsmiljö som är så sterilt som möjligt.
- De flesta av de första stegen utförs mellan en kemisk dragskåp och lab bänk. Alla steg efter det att avlägsna överskott glutaraldehyd från täckglasen bör genomföras under en biologisk säkerhet skåp.
- På grund av skillnader i cell spreading (Figur 2), rekommenderar vi att seeda dubbelt så många celler på mjuka hydrogeler jämfört med stela hydrogel.
- AC polymerisation processen är mycket snabb. För första gången användare, kan man minska mängden APS eller TEMED i lösningen att förlänga polymerisation processen. Försök inte att förbereda mer än ett par täckglas på en gång.
- I studier cellcykeln där synkronisering i G0 krävs, vi brukar serum-svälta celler i plast kultur rätter, trypsinize cellerna och reseed dem på hydrogeler olika överträdelser i närvaro av mitogener (FBS och / eller tillväxtfaktorer). Detta förfarande säkerställer att starta befolkning G0 synkroniserade-celler är identisk i alla prover. Men för många studier signaltransduktion, kan erforderlig mitogen stimulering tiden vara tillräckligt lång för att möjliggöra fastsättning och spridning av celler. I detta fall har vi serum-svälter cellerna på hydrogeler och sedan direkt stimulera dem med mitogen.
Figur 1A. Felaktigt tvättade täckglas. Efter tillsats av APTMS var täckglas tvättas i 1-2 minuter före tillsats av glutaraldehyd lösningen. En fällning bildas på täckglas som inte har tvättats enligt anvisningarna i arbetsordningen.
Figur 1B. Ordentligt tvättade täckglas. Efter tillsats av APTMS var täckglas tvättas tre gånger 10 minuter vardera före tillsats av glutaraldehyd lösningen. Ingen fällning bildas på täckglas.
Figur 2. Morfologi hos celler hydrogeler av varierande styvhet. Etablerad MEFs var seedade på fibronektin-belagd hydrogeler av hög eller låg styvhet i 9 timmar. Efter inkubationstiden var cellerna fast, permeabilized och färgade med FITC-phalloidin som binder till F-aktin. MEFs på hög styvhet geler uppvisar stressen fibrer och är väl spridda jämfört med dem seedade på låg styvhet hydrogel. Skala bar = 50μm.
Figur 3. Representant kvantitativa PCR-resultat för D1 musen cyklin mRNA nivåer. Serum svalt musen embryonala fibroblaster var klädd på hög (3% akrylamid) eller låg (0,3% akrylamid) hydrogeler stelhet och stimuleras med 10% FBS för 9 timmar. Efter RNA-extraktion, var i realtid av kvantitativ PCR-analys utförs för cyklin D1 mRNA nivåer (normaliserad till 18S RNA). G0 representerar cyklin D1 mRNA från vilande celler. Cyklin D1 mRNA nivåerna ökar markant på styva hydrogeler men inte på mjuka hydrogel. Data innebär + / - SD över dubbla PCR-reaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En avgörande del av hydrogel polymerisation processen är att undvika att luft bubblor bildas som gör att cellerna binder till glaset täckglas stället för ECM-belagda hydrogel själv. Detta kan förhindras genom att försiktigt pipettera den polymerisation lösning efter vortexa och visuellt se till att inga luftbubblor har blivit fångade i gelen. Vi rekommenderar alltid att förbereda ytterligare "reaktiv" täckglas och hydrogeler att se till att ha tillräckligt för experiment.
Särskild uppmärksamhet bör ägnas när geler tvättas med PBS. Sug-processen måste undvika nära kontakt med hydrogelen sig som det kan fastna och trasiga. Det säkraste sättet att aspirera vätska utan störande hydrogeler är att tippa plattan medan sugning.
Det är svårt att få helt nivå hydrogeler, och mikroskopiska skillnader i hydrogel tjocklek kan resultera i ojämna ytor som gör det svårt att fokusera bilder under ett synfält. Man kan fokusera på relativt små områden, och vi finner att detta tillvägagångssätt är tillräckligt för de flesta faskontrast och epifluorescence applikationer som visas i bild. 2. Problemet blir värre när förstoringen ökar, så hög upplösning analyser såsom co-lokalisering av proteiner bäst analyseras som optiska skivor från konfokala mikroskop. Konfokalmikroskopi utförs med hjälp av standardiserade förfaranden, men hydrogel kan behöva vändas på ett täckglas snarare än en bild för att anpassa arbetsmiljön avstånd av målen i en inverterad konfokalmikroskop.
Denna in vitro polyakrylamidgel systemet kan modellera olika fysiologiska förhållanden ECM styvhet. ECM efterlevnad varierar mellan normal vävnad, och förändringar i styvhet är också upptäcks patologiskt. Som sådan kan detta hydrogel systemet vara ett värdefullt för in vitro-test för att undersöka hur förändringar i ECM styvhet påverkar sjukdomsprogress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Arbete är vårt laboratorium stöds med bidrag från National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde, 70% | Sigma-Aldrich | G7776 | Store at -20°C |
| 3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%) | Sigma-Aldrich | 281778 | Store at room temperature |
| SurfaSil Siliconizing Fluid | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 42800 | Store at room temperature |
| NHS (N-hydroxysucinimide Ester) | Sigma-Aldrich | A-8060 | Store at 4°C Replace monthly |
| Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003-100G | Store at 4°C |
| Coverslips (25mm) | Fisher Scientific | 12-545-86 25 Cir 1D | |
| Coverslips (18mm) | Fisher Scientific | 12-545-84 18 Cir 1D |
References
- Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta. J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).
- Bernini, G. Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibrosis in patients with primary aldosteronism. J Hypertens. 26, 2399-2405 (2008).
- Boonyasirinant, T. Aortic stiffness is increased in hypertrophic cardiomyopathy with myocardial fibrosis: novel insights in vascular function from magnetic resonance imaging. J Am Coll Cardiol. 54, 255-2562 (2009).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Duprez, D. A., Cohn, J. N. Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).
- Lee, R. T. Prediction of mechanical properties of human atherosclerotic tissue by high-frequency intravascular ultrasound imaging. An in vitro study. Arterioscler Thromb. 12, 1-5 (1992).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples. Phys Med Biol. 52, 1565-1576 (2007).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad Sci USA. 94, 13661-13665 (1997).
- Klein, E. A., Yung, Y., Castagnino, P., Kothapalli, D., Assoian, R. K. Cell adhesion, cellular tension, and cell cycle control. Methods Enzymol. 426, 155-175 (2007).
- Klein, E. A. Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening. Current Biology. 19, 1511-1518 (2009).
